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Tecnología de Fermentación
Fermentación: Producción de alcohol a partir de azúcar. Reacciones donde la materia prima
orgánica se convierte en producto por la acción de enzimas o microorganismos.
En las fermentaciones microbianas los microorganismos se reproducen, en la enzimática no
hay reproducción.
Bioproductos
Clasificados según:
Tamaño de molécula:
1. Pequeñas: químicos, antibióticos, hormonas, AA y vitaminas)
2. Macromoléculas: proteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos/
3. Partículas: células, esporas.
Bioproductos Moleculares
Producen por fermentación y se separan por extracción u operaciones unitarias.
Divididos en:
Enlace peptídico
Formación de una amida y agua a partir de aminoácidos (enlace de la vida), reacción en los
ribosomas.
Metabolitos Secundarios: Producidos durante la fase estacionaria de los microorganismos
(antibióticos). Se emplean como tratamientos humanos, terapia de cáncer y aplicaciones
fisiológicas.
Macromolecules
Proteínas: Formadas por aminoácidos y enlaces peptídicos, base de ADN y ARN.
Estructura Secundaria: Formada por varias estructuras primarias, unidas a partir de puentes
de hidrógeno. Tienen forma de hélice alfa o placa beta.
Moléculas híbridas: proteínas que contienen dentro de sus cadenas a otras moléculas que
tienen propiedades únicas (Lipoproteinas, Glycoproteinas, Fosfoproteinas)/
Estabilidad de proteínas
No desnaturalizar el estado activo de la proteína, la desnaturalización se debe a la ruptura
de puentes de hidrógeno debido a T de 45 a 50C, pH causando una hidrólisis debido a la
protonación o generación de cargas y esfuerzo cortante.
Polisacáridos
Biopolimeros o macromoléculas ramificadas de mayor peso molecular, empleados como
componentes de vacunas (almidón, glucógeno y celulosa).
Fermentación Microbiana
Autótrofo: CO2 es su fuente de carbón
Heterotrofo: Carbón de fuentes orgánicas.
Levadura: Fungi que se encuentra con otro organismo que genera su propio alimento, se
reproducen por brotes (Saccharomyces cerevisiae).
Hongos Filamentosos: cuerpos que se reproducen por esporas, formando dominios de gran
tamaño (Aspergillus y Penicillium).
Metabolismo Microbiano
Metabolismo: Actividad ordenada que abarca sus operaciones quimicas y de energía, las
cuales pueden ser por:
Catabolismo: moléculas más grandes se degradan y rompen en moleculas más pequenas,
liberando energía.
Anabolismo: Formación de moléculas grandes a partir de moléculas pequeñas, impulsado
por la energía proveniente del catabolismo.
Vias Metabolicas
Serie de etapas, cada una catalizada por una enzima, pueden ser ramificadas (métodos
alternativos para el procesamiento de nutrientes) o cíclica (la molécula inicial se regenera
otra vez).
Diferencia principal entre respiracion anaerobica y aerobica: ambas pasan por la glucólisis,
formación de 2-piruvato, acetil CoA, Krebs, pero en la aeróbica el O2 es el que acepta los
electrones, en anaerobica son no oxigenados). En la fermentación no hay Krebs y el aceptor
de electrones es una molécula orgánica (piruvato o acetaldehído).
Glucolisis
Vía anaerobia que convierte la glucosa en ácido pirúvico, proporciona el medio para
sintetizar ATP en ausencia de oxígeno.
Serie de 9 pasos lineales donde se activa la glucosa con el consumo de ATP. Seguido por
la oxidación de la glucosa, síntesis de ATP y formación de ácido pirúvico. El acido piruvico
se utiliza en el ciclo de Krebs o en la fermentación.
Ciclo de Krebs
Entran 2 piruvatos (de la Glucólisis) y 2 CoA al TCA, por lo que para procesar
completamente una glucosa el ciclo debe dar 2 vueltas.
El ciclo tiene 8 pasos donde se forman distintos ácidos en cada paso (Citrico, Oxaloacetico,
Málico, etc.)
Crecimiento Microbiano
Cinética de Crecimiento Microbiano
Métodos empíricos que explican el modelo que sigue el crecimiento de las células en un
medio de cultivo. Suele ser complejo debido a que la masa del medio varía, esencial para el
entendimiento y diseno de equipos.
Utiliza el cambio de concentración de células con el tiempo.
Velocidad de crecimiento celular: crecimiento de la concentración de células con el tiempo.
Cultivo Batch
El consumo de sustrato que controla el crecimiento se monitorea en función del tiempo, el
medio, composición y estado de la célula cambia durante el experimento.
En un cultivo continuo la concentración del sustrato es independiente de la concentración y
tiempo de cultivo, se mantienen condiciones estables de medio.
Fase de retardo (lag): las células agotan varios constituyentes esenciales por lo que
necesitan tiempo para sintetizarlos nuevamente. Se produce también por células dañadas o
cuando se transfiere de un medio rico a uno pobre.
Fase exponencial: Influenciada por condiciones ambientales (T y medio de cultivo), las
células más pequeñas y simples tienen mayor capacidad de intercambio de nutrientes y
desechos.
Velocidad de crecimiento específica Tiempo de duplicación (aparición de nueva
gen.)
Tecnología de Enzimas
Cinética de las Reacciones Enzimáticas
Caracterizada por su alto aumento en la velocidad de reacción y alta especificidad
(catalizacion selectiva de ciertos sustratos).
El catalizador no se consume o produce y no altera la termodinámica de la reacción.
Reacciones de Orden Cero: Una pequeña fracción de moléculas reaccionan y esa fracción
se repone por una fuente más grande. Si se involucran 2 o más reactivos las concentración
de algunos serán mayores a la de los otros. Las reacciones ocurren cuando el número de
moléculas de enzima es limitada en relación a moléculas de sustrato.
Ecuación de Arrhenius
k = Ae−Ea/RT
A = frecuencia
k = constante de velocidad
Ea = Energía de Activación
Importancia de v max
Representa la velocidad de generación de producto máxima alcanzable, donde toda la
concentración de enzima inicial está presente como ES.
Turnover Number: número de moléculas de sustrato convertidas en producto por una
molécula de enzima, donde la enzima está completamente saturada con sustrato (k cat =
vmax / [E]0).
Mecanismo secuencial
Ordenado: Un sustrato se une a la enzima antes de que un segundo sustrato pueda unirse.
Aleatorio: La unión de sustratos y liberación de productos no siguen un orden definido.
Ping pong: Un sustrato se une, al mismo tiempo, otro se libera, siguiendo ese proceso
múltiples veces.
Inhibidores
Compuestos que disminuyen la velocidad de reacción catalizada por una enzima.
Generalmente, tienen bajo peso molecular y inhiben de manera reversible o permanente.
Inhibición reversible
Equilibrio entre enzima/inhibidor.
1. Inhibición Competitiva: El sustrato e inhibidor compiten por el mismo sitio activo. Se
debe aumentar [S] en relación a [I]
2. Inhibición No Competitiva: Un inhibidor se une a una enzima en un sitio distinto a la
unión del sustrato. La unión no tienen ningún efecto sobre el sustrato., aunque el
complejo ESI no forma el producto deseado. Puede revertirse con el aumento del
sustrato.
3. Inhibición Anticompetitiva: Inhibidor que no se une a la enzima libre, solo
reversiblemente al complejo ES produciendo un ESI inactivo.
Inhibición irreversible
La inhibición incrementa conforme avanza el tiempo.
No aplica Michaelis Menten, la eficiencia del inhibidor no está relacionada a la constante de
equilibrio, sino que a la velocidad a la que se unen los inhibidores.
Introduccion al Diseno de Reactores.
Tipos de Reactores
Reactor Intermitente
Es sencillo y requiere poco equipo de apoyo, utilizado para estudios experimentales de
cinética, con pequeñas cantidades de material.
Para determinar el tamaño:
1. Encontrar cinetica de reaccion
2. Encontrar variación de volumen
3. Determinar el grado de conversión deseado.
4. Determinar el volumen necesario y el tiempo necesario.
Espacio Tiempo
Tiempo necesario para tratar un volumen de alimentación igual al volumen del reactor
medido en condiciones normales de operación.
Espacio Velocidad
Cantidad de alimentación que puede tratarse en la unidad de tiempo establecida, medida en
volúmenes del reactor.
Funciones de un Fermentador
Mantener la concentración de biomasa al máximo.
Capaz de mantener condiciones estériles.
Consumo de energía eficiente
Agitación eficaz.
Eliminación de calor eficiente.
Fuerzas de corte por agitación controladas.
Posea instalaciones de muestreo
Posea instalaciones donde agregar medios de control de espuma o pH.
Requisitos Necesarios
Excluir entrada de microorganismos contaminantes y contener los deseados.
Volumen del cultivo constante (controlar la espuma).
Mantener el nivel de oxígeno disuelto por encima de niveles de aireación y agitación para
microorganismos aerobios.
Mantener T y pH controlados con volumen total de cultivo bien mezclado.
Fermentadores Aeróbicos
Biorreactor de Burbujas
Recipiente cilíndrico con distribuidor de gas en la parte inferior, el gas forma burbujas que
entran en contacto con el líquido, TdM de una fase a la otra.
Buenas características de TdM y TdC, bajos costos de operación, poco mantenimiento y
falta de piezas móviles.
Involucra grandes caudales de gas (gran diámetro) y alturas elevadas para obtener niveles
de conversión grandes.
Componentes:
1. Agitador: aumentar la uniformidad de concentración y T.
2. Suministro de gases
3. Control de espuma: puede danar a las proteínas, añadir antiespumantes.
4. Control de T: remover enfriamiento del medio, calor generado por metabolismo y
color generado por agitación.
5. Control de pH
6. Puestos de muestreo
7. Sistema de limpieza
8. Colector en la línea de descarga.
Precipitación
Obtención de un soluto en solución, en forma de sólido. El objetivo es concentrar el soluto
para reducir volumen.
Carga
Aumenta conforme aumenta la carga neta, cambia al variar el pH de la solución. Cuando la
solución tiene carga cero se le conoce como pH isoeléctrico.
Solvente
Hidrofobicidad : Soluciones de alcoholes monovalentes con agua, desnaturalización de las
proteínas. Los alcoholes con cadenas largas están mejor unidas a grupos polares en la
proteÍna debilitando las interacciones hidrofóbicas, produciendo la desnaturalización.
Fuerza iónica: puede solubilizar (salting in) o precipitar (salting out).
Las euglobinas son insolubles en ausencia de sal en su punto isoeléctrico.
Las albuminas, solubles en agua como en altas concentraciones de sal
Modelo de Kirkwood
Describe interacciones entre iones y dipolos para efectos de solubilidad.
Fuerza Iónica
Pasos de la precipitación
1. Mezcla inicial: mezcla requerida para alcanzar homogeneidad luego de la adición del
componente que causa la precipitación
2. Nucleación: generación de partículas de tamaño ultramicroscópico, debe estar saturada
resp
3. Crecimiento por difusión: Limita el crecimiento de partículas hasta 0.1 a 10 micrómetros,
limitando el movimiento del fluido.
4. Crecimiento por movimiento del fluido: después de llegar al tamaño crítico (1 micrometro),
las partículas chocan y se pegan (floculación).
Rompimiento del Precipitado
Las partículas grandes son más susceptibles al rompimiento por colisiones, está depende
de los esfuerzos cortantes y de la concentración de partículas.
Métodos de Precipitación
Precipitación isoeléctrica: Se ajusta el pH al punto isoeléctrico de cierta proteína se utiliza
cuando se quiere fraccionar una mezcla de proteína.
Adición de solventes orgánicos: se utiliza alcoholes, acetona o éter.
Adición de sales: se agrega una sal a una solución con proteínas (sulfato, fosfato, citrato).
Adición de polímeros no iónicos: se utiliza dextran o polietilenglicol.
Filtración
Separar partículas de un soluto en una suspensión fluida de acuerdo al tamaño del soluto,
haciendo pasar el fluido por un medio poroso.
Filtración Convencional: Fluido fluye perpendicular al medio generando una torta que ayuda
como medio filtrante/
Filtración de Flujo Cruzado: el fluido fluye paralelo al medio, minimizando la acumulacion de
solidos.
Principios de la filtración
Medios de Filtración
Tejidos: telas porosas con resistencia química (10um).
Tela metálica: alambres entrelazados de Ni, Cu, Al o acero (5um)
Membranas: Ultrafiltración (0.001 a 0.1 um) o de Microporos (0.1um)
Módulo: herramienta que sostienen y extiende las membranas.
Sedimentacion
Movimiento de partículas o macromoléculas en un campo de inercia (gravedad o
aceleración centrífuga).
Afectada por la fuerza boyante del medio y fuerzas de arrastre.
La velocidad de sedimentación es 0 cuando la densidad de partícula es igual a la del
solvente.
Métodos de sedimentación
Sedimentación en equilibrio: capas de soluciones con densidades menores.
Centrifugación a altas velocidades: crea un soluto estratificado de densidades.
Coeficiente de sedimentación: la velocidad de sedimentación es proporcional al campo de
aceleración al aplicar una fuerza (Dimensional de Svedberg)
Equipos
Centrífuga Tubular: los sólidos se depositan en la pared giratoria mientras el líquido sale por
el extremo opuesto.
Centrífuga de discos: Rotación de conos invertidos concéntricos, si es abierto es continuo,
cerrado es batch.
Ultracentrifugación: Rotación a altas velocidades para determinar pesos moleculares.