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TESIS
TRUJILLO - PERÚ
2018
RESUMEN
2
ABSTRACT
The control of microbial growth is an important factor in food preservation, for which
chemicals are commonly used; however, these are being replaced by natural substances
such as essential oils. The objective of the present investigation was to determine the
minimum inhibitory concentration of the essential oil of Minthostachys mollis "muña" on
the growth of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus. To do this, the
essential oil was extracted from the entire muña plant using the steam distillation
technique, and a stock solution was prepared. The growth curve of L. monocytogenes and
S. aureus was determined, determining that the generation time was 55 and 42 minutes
respectively; and the logarithmic phase averages 11 and 8 hours respectively. The
inoculum of each bacterium was prepared, in its average logarithmic phase and with the
stock solution the determination of the minimum inhibitory concentration was made,
using microculture wells with final concentrations of 320; 160; 80; 40; twenty; 10; 5 and
2.5 μg/mL of the essential oil. The systems were incubated at 37°C for 24 hours,
everything was done in triplicate. The result of the minimum inhibitory concentration of
Minthostachys mollis "muña" on the growth of L. monocytogenes and S. aureus was 40
μg/mL and 80 μg/mL respectively.
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I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias del género Listeria comprenden un grupo de bacterias Gram positivas,
anaerobios facultativos, bacilos no esporulados que están ampliamente distribuidos en el
medio ambiente (Hain y col., 2007). Debido a su naturaleza ubicua, estas bacterias pueden
persistir en las instalaciones de procesamiento de alimentos y, por lo tanto, pueden
contaminar los productos alimenticios (Carpentier y Cerf, 2011).
De las siete especies reconocidas de Listeria (L. monocytogenes, L. ivanovii, L. innocua,
L. seeligeri, L. welshimeri, L. grayii y L. murrayi),
solo L. monocytogenes y L. ivanovii actualmente se consideran como patógenos e
infecciosos, provocando enfermedades en animales y seres humanos, ya que son
conocidos por ser β-hemolíticos (Brugere-Picoux, 2008; Schuchat y col., 1991).
4
celular e intercelular; y transportadores de hexosa fosfato que le permiten utilizar azúcares
en el citosol celular durante su replicación intracitoplasmática (Wallecha y col., 2009).
El género Staphylococcus está formado por cocos Gram positivos, con un diámetro entre
0.5 a 1.5 μm, agrupados como células únicas, en pares, tétradas, cadenas cortas o
formando racimos de uvas (Kloss y col., 1992). Ogston introdujo el nombre de
Staphylococcus, del griego staphyle que significa racimo de uvas, para describir a los
cocos responsables de inflamación y supuración. Son bacterias no móviles, no
esporuladas, no poseen cápsula, aunque existen algunas cepas que desarrollan una cápsula
de limo, son anaerobias facultativas. La mayoría de los estafilococos producen β-
hemólisis o hemólisis total y catalasa; característica que se utiliza para diferenciar el
género Staphylococcus de los géneros Streptococcus y Enterococcus que son catalasa
negativos (Kloss y col., 1992; Kuroda y col., 2001).
S. aureus se diferencia de las demás especies por producir coagulasa que se manifiesta
por su capacidad para coagular el plasma, es resistente al calor, a la desecación y puede
crecer en medios con grandes cantidades de NaCl (7.5%). S. aureus crece bien en medios
de cultivos no selectivos, como el agar sangre, agar chocolate, agar cerebro corazón (agar
BHI) y medios selectivos como el agar manitol salado o medio de Chapman por su
elevado contenido de sal que inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram
negativas. Este medio permite realizar la identificación presuntiva de S. aureus por la
pigmentación amarilla, característica de esta bacteria, debido a que fermenta el manitol
se genera un cambio de color en el medio que vira de rojo pálido a amarillo (Compernolle
y col., 2007; Marcos Vivoni y Meurer, 2005).
5
S. aureus es importante no solo porque ocasiona infecciones en diversas partes del
organismo humano, sino porque es una de las principales bacterias implicadas en
enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Tales enfermedades son causadas por
diversas acciones, incluyendo la capacidad del patógeno de producir toxinas, siendo esto
relativamente común en determinados sectores de la población y en algunas regiones
geográficas desfavorecidas por la falta de sistemas de salud. Las infecciones causadas por
la ingesta de alimentos contaminados con toxinas que se encuentran presentes en el aire,
la leche, el agua potable, la aguas residuales y, desde luego, la comida o en el equipo
donde los alimentos han sido elaborados (Tibavizco y col., 2007).
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El hombre a través del tiempo ha encontrado en los recursos naturales la solución a
diferentes problemáticas, empleando las plantas a nivel alimenticio, industrial y
medicinal, convirtiéndose de esta manera, en materias primas de vital importancia para el
avance de la humanidad (Ben-Hsouna y col., 2013).
El valor medicinal de las plantas curativas, se debe a la presencia de una sustancia química
(principio activo) que produce un efecto fisiológico. Mucho de los principios activos son
sumamente complejos, desconociéndose aún su naturaleza química; otros han sido
purificados, sintetizados o imitados. Por lo general pertenecen a una de estas categorías:
aceites esenciales, alcaloides, glúcidos, taninos, sapogeninas, fenoles, quinonas, terpenos,
carotenoides, cumarinas, flavonoides y resinas (Thompson, 1981).
Los aceites esenciales son las fracciones liquidas volátiles generalmente destilables por
arrastre con vapor de agua, que contienen las sustancias responsables del aroma de las
plantas y que son importantes en la industria cosmética (perfumes y aromatizantes), de
alimentos (condimentos y saborizantes) y farmacéuticas (saborizantes) (Reichling y col.,
2009). Los aceites esenciales lo constituyen una diversa familia de compuestos orgánicos
de bajo peso molecular con grandes diferencias en la actividad antimicrobiana. Los
componentes activos de los aceites esenciales pueden dividirse en cuatro grupos según su
estructura química: terpenos, terpenoides, fenilpropenos, y fenilpropanoides (Berka-
Zougali y col., 2012).
7
respiratorias y digestivas. La muña habita en los diferentes pisos ecológicos de nuestra
serranía, crece entre 2500 y 3500 m.s.n.m, donde existe en abundancia (Salaverry, 2005;
Roersch, 1999; Rojas y col., 2003). El clima más apropiado es aquel con abundante
lluvias y elevada luminosidad (Salaverry, 2005).
Minthostachys mollis es una planta de 0.9 a 1.5 m de altura, frondosa en la parte superior,
de aspecto bien tupido en hojas, las mismas que son opuestas y aserradas presentando
pelos en los peciolos y en la cara inferior de las hojas, en las cuales se deposita la mayor
cantidad de aceite esencial. El tallo es ramificado desde la base, que también presenta
pelos, tiene forma prismático cuadrilátero y propenso a la lignificación. Las flores se
encuentran en la parte superior de las ramas reunidas en verticilos. Las flores son
pequeñas y blancas; irregulares o zigomorfas. Se encuentran reunidas en seudo verticilos
axilares, formados por cuatro pequeñas cimas, brevemente pedunculadas, dos en cada
axila y situadas en la parte superior de las ramas (Salaverry, 2005).
La muña, según el sistema de Engler & Prantil, modificado por Melchor en 1964, recibe
la siguiente clasificación (Dabbah y col., 1970):
REINO: Vegetal
DIVISIÓN: Angiospermae
CLASE: Dicotyledoneae
SUB CLASE: Simpetaleae
ORDEN: Tubiflorales
FAMILIA: Lamiaceae
GÉNERO: Minthostachys
ESPECIE: Minthostachys mollis (Kunt/Griseb)
NOMBRE COMUN: “MUÑA”
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89.80 % para la fracción terpénica. Cano (2007) determinó la presencia de carvacril
acetato, carvacrol, pulegona y mentona.
Díaz K. y col. (2005), obtuvieron el aceite esencial de muña mediante la técnica arrastre
de vapor de agua y fue sometida a cromatografía de gases y se determinó sus principales
componentes pulegona y transmenton. Concluyó que el aceite esencial de muña presenta
actividad antibacteriana en Streptococcus mutans, Lactobacillus sp., Fusobacterium
nucleatum, Actinobacillus actinomycetemcomitans y Actinomyces sp. frente a
Amoxicilina como control positivo y agua destilada como control negativo. En las
pruebas de susceptibilidad concluyó que la bacteria más sensible al aceite esencial de
muña era Fusobacterium nucleatum seguido de Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Streptococcus mutans, Lactobacillus sp. y Actinomyces sp. con una media de halos de
inhibición 20.13 mm, 18.42 mm, 16.50 mm, 14.38 mm, 11 mm respectivamente. La
propiedad antimicrobiana se debería a las sustancias terpenoides presentes en el aceite
esencial del Minthostachys mollis (Díaz, 2005).
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La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente
mediante algunas de las variantes de los métodos de dilución. La Concentración Mínima
Inhibitoria (CMI) se define como la mínima concentración de antimicrobiano (en μg/mL)
que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo después de 24 horas de
incubación a 37°C. La CMI se ha establecido como "gold Standard" frente a otros
métodos que evalúan susceptibilidad antimicrobiana; además de confirmar resistencias
inusuales, da respuestas definitivas cuando el resultado obtenido por otros métodos es
indeterminado (Andrews, 2001).
Este trabajo forma parte del programa sobre acción bacteriana de plantas medicinales que
está ejecutando el laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana en el Departamento de
Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo.
OBJETIVO GENERAL
10
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
11
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. MATERIAL BIOLÓGICO
2. PROCEDIMIENTO
12
2.2. Reactivación de las cepas Listeria monocytogenes ATCC® 19115™ y
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 12600™
13
obtuvo la curva de crecimiento, la fase logarítmica media y por
consiguiente el tiempo de generación.
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adicionó 800 µL de solución Stock del aceite esencial de M. mollis. Del primer
pocillo se tomó 800 µL y se realizó diluciones hasta el octavo pocillo para
obtener las concentraciones 400; 200; 100; 50; 25; 12.5; 6.25; 3.125 µg/mL.
Luego se completó el mililitro con 200 µL de inóculo (3x105 células) para tener
las concentraciones finales de: 320, 160; 80; 40; 20; 10; 5; 2.5 µg/mL. Se
adicionó en un noveno pocillo 800 µL de Tween 80 que sirvió de control del
medio (Cueva-Yesquen, 2016).
3. PROCESAMIENTO DE DATOS
15
III. RESULTADOS
16
1,00E+11
1,00E+10
Fase logarïtmica
1,00E+08 corregida
1,00E+07
y = 0,752x +15771
1,00E+06
0 2 4 6 8 10 12
Horas
17
1,00E+13
1,00E+12
1,00E+11
Fase logarítmica
UFC/ mL
Fase logarítmica
1,00E+10 corregida
1,00E+09
y = 0,9792x + 18,457
1,00E+08
0 2 4 6 8 10 12
Horas
18
Tabla 01. Tiempo de generación de L. monocytogenes ATCC® 19115™ y S. aureus subsp.
aureus ATCC® 12600™.
Tabla 02. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Minthostachys
mollis sobre el crecimiento de L. monocytogenes y S. aureus.
Bacterias CMI
L. monocytogenes ATCC® 19115™ 40 µg/mL
S. aureus subsp. aureus ATCC® 12600™ 80 µg/mL
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IV. DISCUSIÓN
La demanda del consumidor por alimentos naturales, con ausencia o reducida cantidad de
productos químicos ha ido incrementando notoriamente, lo que hace indispensable la
búsqueda de compuestos alternativos y nuevas tecnologías no contaminantes. El control
del crecimiento microbiano es uno de los factores más importantes a considerar en la
conservación de alimentos, por lo que la sustitución de los productos antimicrobianos
químicos por sustancias naturales, como los aceites esenciales, que no alteran las
características sensoriales ni nutricionales de los alimentos ha sido revisada por diversos
autores desde hace varios años (Velázquez, 2010).
Los aceites esenciales son compuestos extraídos de varios tipos de plantas y usados para
preservar alimentos y bebidas, tienen un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de
microorganismos (Azaña, 2010). Los componentes activos de los aceites esenciales
pueden dividirse en cuatro grupos según su estructura química: terpenos, terpenoides,
fenilpropenos, y fenilpropanoides (Berka-Zougali y col., 2012). Los terpenoides pueden
servir como un ejemplo de agentes liposolubles, los cuales afectan la actividad de las
enzimas catalizadoras a nivel de membrana, por ejemplo: ciertos componentes del AE
pueden actuar como desacopladores, los cuales interfieren en la translocación de protones
sobre la membrana y subsecuentemente interrumpir por la fosforilación del ADP (Cano
y col., 2008).
Estudios in vitro han mostrado que los aceites esenciales inhiben el crecimiento
bacteriano pero varían en su eficacia debido a que los componentes químicos que actúan
20
como agentes antimicrobianos varían en tipo y concentración (Hyldgaard y col., 2012).
La actividad antimicrobiana de los diferentes aceites esenciales es muy difícil de
comparar teniendo en cuenta la variación de la composición del aceite esencial
(compuestos orgánicos de bajo peso molecular) entre especies de plantas, diferencias en
el origen geográfico, estación del año, métodos de extracción y parte de la planta que es
usada (Kuorwell-Kuorwell y col., 2011).
Los aceites esenciales que tienen mayor capacidad inhibitoria presentan como mayores
componentes del mismo, compuestos tales como el timol, el carvacrol, el linalol, el
aldehído cinámico, la alicina y el eugenol (Winward y col., 2008; Delaquis y col.; 2002;
Benkeblia, 2004); dichos aceites por su acción lipofílica tienen la capacidad de pasar las
membranas celulares, romper polisacáridos, ácidos grasos y lípidos, permeabilizando la
membrana celular; conduciendo a la pérdida de iones, al colapso de la bomba de protones
y a la disminución del ATP lo cual conduce a la muerte celular; a nivel citoplasmático
puede actuar sobre lípidos y proteínas coagulando dichas moléculas (Bakkali y col.,2008).
21
pueden penetrar la membrana del citoplasma, causando una desestabilización de esta;
igualmente podría actuar como intercambiador de protones, reduciendo el gradiente de
pH a lo largo de la membrana (Xu y col., 2008), y con algo menos de actividad se
presentan los derivados alcohólicos y cetónicos (Domingo y López-Brea, 2010).
Cabe resaltar que los aceites esenciales mostraron un mayor efecto inhibitorio frente a
cepas Gram-negativas. Este comportamiento particular frente a un grupo de cepas,
probablemente se debe a que la pared celular de las bacterias Gram-positivas estudiadas
está compuesta básicamente por peptidoglicano que representa hasta el 90% de la pared,
ácidos teicoicos que también suelen estar presentes en pequeñas cantidades y
polisacáridos; mientras que la pared celular de las Gram-negativas está constituida solo
por el 10% del peptidoglicano, además posee tres polímeros que se encuentran fuera de
su envoltura: lipoproteína, membrana externa y lipopolisacáridos, este último con un
contenido de lípido A que pudiera favorecer la entrada, por disolución de los aceites
esenciales debido a su carácter hidrofóbico y provocar la muerte celular por
desestabilización de la membrana externa y la membrana plasmática. Este lípido A no
está presente en las bacterias Gram-positivas y esta sería una causa probable del efecto
del aceite en los diferentes grupos bacterianos, donde las bacterias Gram-negativas son
relativamente más sensibles (Guerra y col., 2014).
22
asume que la actividad antimicrobiana de éste depende principalmente de tres
características: su carácter hidrófilo o hidrófobo, sus componentes químicos y el tipo de
microorganismo que debe atacar (Fisher y Phillips, 2008; Solórzano Santos y Miranda-
Novales, 2011). Es por ello que se concluye que la concentración mínima inhibitoria de
L. monocytogenes es 40 µg/ml y S. aureus es 80 µg/ml.
23
V. CONCLUSIÓN
24
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alaba W, Jiménez C. (2014). Efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial de las hojas de
Minthostachys mollis (muña) sobre colonias de Enterococcus faecalis ATCC
29212. (1):15-22.
Baca C. (2014). Efecto inhibitorio del aceite esencial de Minthostachys Mollis (Muña)
sobre el género Proteus causantes de infecciones del tracto urinario. Tesis para
optar el título profesional de licenciado en Biología. UNA-Puno. Perú.
Berka-Zougali B, Ferhat MA, Hassani A, Chemat F, Allaf KS. (2012). Comparative study
of essential oils extracted from Algerian Myrtus communis L. leaves using
microwaves and hydrodistillation. Int J Mol Sci.13 (4):4673-95.
Brack A, Heinz P. (2002). Perú Maravilloso. Edit. Epenza. Empresa Periodística Nacional
SAC. Lima.
25
Brooks G, Butel J, Ornston N. (1996). Microbiología Médica de Jawetz, Melnick y
Adelberg. 15º edición. México: Editorial Manual Moderno.
Brugere-Picoux O. (2008). Ovine listeriosis. Small Rumiant Res. 76 (1): 12-20. doi:.
10.1016 / j.smallrumres.2007.12.022
Cano C. (2007). Actividad antimicótica in vitro y elucidación estructural del aceite de las
hojas de Minthostachys mollis (muña). Tesis de Maestría para Magister en
recursos vegetales y terapéuticos, Lima- UNMSM.
26
Delaquis, P.J; Stanich, K; Girard, B; Mazza, G. (2002). Antimicrobial activity of
individual and mixed fractions of dill, cilantro, coriander and eucalyptus essential
oils. International Journal of Food Microbiology. 74:101-109
Domingo D., López-Brea M. (2010). Plantas con acción antimicrobiana. Revista española
de quimioterapia.16 (4):385-393.
Foster TJ. (2005). Immune evasion by staphylococci. Nat Rev Microbiol. 3: 948-958.
Guerra L.,Soto L.,Medina Z.,Ojeda G. de R., Pena J. (2014) Actividad antibacteriana del
aceite esencial de cortezas de naranja (Citrus sinensis) var. Valencia frente a
microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos, Rev. Fac. Agronom. Univ.
Zulia, 31, 215-232.
Hain T, Chatterjee SS, Ghai R, Kuenne CT, Steinweg C, et al. (2007). Pathogenomics
of Listeria spp. Int J Med Microbiol. 297(8): 541-557.
Inga BA, Guerra MB. (2000). Efecto del aceite esencial de Minthostachys mollis (muña)
contra algunas bacterias y hongos de interés en la salud (Tesis de Licenciatura).
27
Lima: Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad Nacional Mayor de San
Marcos.
Kloss WE, Schleir KH, Goirtz F. (1992). The genus Staphylococcus. In: Balows A,
Truper HG, Dwoekin M, eds. The Prokaryotes, 2nd Ed.New York, Spring-
Verlag.
Kloss WE, Bamerman TL. (1995). Staphylococcus and Micrococus. In: Murra PR, Baron
EJ, Pfaller MA. Manual of Clinical Microbiology. 6th ed.Washington DC: ASM
PressM.
Lowy FD. (1998). Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med. 339: 520-532.
Marcos Vivoni A, Meurer MB. (2005). Application of molecular techniques in the study
of Staphylococcus aureus clonal evolution-A review. Mem Inst Oswaldo Cruz.
100: 693-98.
28
Mora FD, Araque M, Rojas LB, Ramirez R, Silva B, Usubillaga A. (2009). Chemical
composition and in vitro antibacterial activity of the essential oil of Minthostachys
mollis (Kunth) Griseb Vaught from Venezuelan Andes. Nat Prod Commun.
4(7):997- 1000.
Roersch C. (1999). The marketing of medicinal, aromatic plants and essential oils in the
Dominican Republic. Acta Hort (ISHS). 503:197-219.
29
Schuchat A, Swaminathan B, Broome CV. (1991). Epidemiology of human
listeriosis. Clin Microbiol Rev. 4(2): 169-183.
Tibavizco D, Rodríguez JY, Silva E, Cuervo SI, Cortés JA. (2007). Enfoque terapéutico
de la bacteriemia por Staphylococcus aureus. Biomédica. 27(2): 294-307.
Voyich JM, Braughton KR, Sturdevant DE, Whitney AR. (2005). Inshights mechanisms
used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils. J
Immunol. 175: 3907-3919.
Wiegand I, Hilper K, Hancock RE. (2008). Agar and broth dilution methods to determine
the minimal inhibitory concentration (CMI) of antimicrobial substances. Nat
Protoc. 3(2):163-75.
Winward, GP; Avery, L.M; Stephenson, T; Jefferson, B. (2008). Essential oils for
disinfection of grey water. Water research. 42:2260-2268. 28.
30
Xu J, Zhou F, Ji B, Pei R, Xu N. (2008). The antibacterial mechanism of carvacrol and
thymol against Escherichia coli. Lett Appl Microbiol. 47(3):174-9.
31
ANEXOS
32
ANEXO 01. Ficha de identificación taxonómica de Minthostachys mollis “muña”
33
ANEXO 02. Constancia de identificación de la especie de la planta de
Minthostachys mollis “muña”
34
ANEXO 03. Equipo de destilación por el método de arrastre de vapor
35
ANEXO 04. Soluciones de trabajo para realizar la concentración mínima inhibitoria.
36
ANEXO 05. Presentación KWIK-STIK de Listeria monocytogenes
ATCC® 19115™
37
ANEXO 06. Certificado de Identificación de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™
38
ANEXO 07. Placa de Petri conteniendo colonias típicas de Listeria monocytogenes
ATCC® 19115™ en Agar BHI
39
ANEXO 08. Observación microscópica de Listeria monocytogenes ATCC® 19115™.
Aumento 1000 X. Coloración Gram
40
ANEXO 09. Presentación KWIK-STIK de Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC® 12600™
41
ANEXO 10. Certificado de Identificación de Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC® 12600™
42
ANEXO 11. Placa de Petri conteniendo colonias típicas de Staphylococcus aureus
subsp. aureus ATCC® 12600™ en Agar Manitol Salado
43
ANEXO 12. Observación microscópica de Staphylococcus aureus subsp. aureus
ATCC® 12600™. Aumento 1000 X. Coloración Gram
44
ANEXO 13. Biorreactor utilizado para determinar la curva de crecimiento de L.
monocytogenes y Staphylococcus aureus
45
ANEXO 14. Sistema de pocillos a diferentes concentraciones del aceite esencial de
Minthostachys mollis “muña”, para evaluar CMI frente a Listeria
monocytogenes ATCC® 19115™.
La concentración mínima
inhibitoria de L. monocytogenes
ATCC® 19115™ es 40 µg/mL.
46
ANEXO 15. Sistema de pocillos a diferentes concentraciones del aceite esencial de
Minthostachys mollis “muña”, para evaluar CMI frente a Staphylococcus
aureus subsp. aureus ATCC® 12600™.
47
ANEXO 16
Concentración Bacterias
del aceite esencial S. aureus L. monocytogenes
de Minthostachys
mollis (µg/mL) 1° repetición 2° repetición 3°repetición 1° repetición 2° repetición 3°repeticion
320 I I I I I I
160 I I I I I I
80 I I I I I I
40 N.I N.I N.I I I I
20 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
10 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
5 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
2,5 N.I N.I N.I N.I N.I N.I
LEYENDA
I = Inhibe el crecimiento
N.I = No inhibe el crecimiento
48