I.

INTRODUCCIÓN
Varios métodos de análisis de material biológico se basan en hacer reaccionar la
sustancia, que se ha de analizar con otras sustancias(reactivos) para producir una
solución coloreada de tal medida que la intensidad de color pueda ser usada como un
indicador de la concentración de ésta.
La interacción entre la energía electromagnética y la materia tiene numerosas
aplicaciones en la Química Analítica. La energía radiante muestra un comportamiento
ondulatorio en el curso de propagación y en su acción con la materia se comporta como
si estuviera formada por corpúsculos. Por su carácter ondulatorio produce fenómenos
de interferencia y difracción que nos permite medir su longitud de onda.( Pino, F. &
Perez, D., 1983).

II. REVISION LITERARIA

En esta lección nos ocuparemos de cómo y para qué hacemos interactuar la luz
ultravioleta (UV) y visible (VIS) con la materia.

Origen y características del espectro de absorción UV-VIS

La región UV está definida en el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm.

Es una región de energía muy alta, por lo que provoca daño al ojo humano, así
como quemaduras comunes en la piel y en algunos casos puede producir cáncer.
En la región VIS, la cual se encuentra comprendida entre 400 y 700 nm,
apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes
de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el
complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de
absorción es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la
solución coloreada. Cuando la materia absorbe energía de la región UV-VIS se
producen transiciones de tipo electrónico

La absorción molecular de la radiación en la región UV-VIS del espectro

electromagnético, depende de la estructura electrónica de la especie
absorbente, como por ejemplo átomos, moléculas, iones o complejos. Esta se
da cuando se hace incidir un haz de luz ultravioleta o visible sobre la molécula
absorbente aumentando su energía hasta la energía (hν) del fotón incidente, lo
cual produce una transición electrónica desde un estado energéticamente menor
a otro mayor. Luego de esto, emite un fotón con la misma cantidad de energía
absorbida. La unión de todas las transiciones se representa por medio de un
conjunto de bandas llamado espectro de absorción molecular.
Espectros de absorción (A) fase gaseosa; (B) fase solución

Cuando la sustancia absorbente se trata de una muestra en fase gaseosa o de

vapor, el espectro se compone de un número de líneas muy próximas entre sí,
como se puede ver en la Figura 4 (A). Sin embargo, si la sustancia se encuentra
en fase de solución el espectro adquiere la forma de un pico de absorción suave
y continua. Esto se debe a que las moléculas de la especie absorbente están
rodeadas por las moléculas del disolvente, produciéndose colisiones
constantes entre ellas. Estas colisiones junto con las interacciones entre las
especies que absorben y las moléculas del disolvente hacen que las energías de
los estados cuánticos se extiendan. Como consecuencia, la muestra absorbe
fotones repartidas en un rango de longitudes de onda. Un típico espectro UV-VIS
en la fase de solución se representa en la Figura 4 (B).

La espectrofotometría o espectrometría UV-visible utiliza el principio de

absorción para determinar la concentración de un compuesto en solución. Se
basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su
vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la
concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro,
en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una
solución y medir la cantidad de luz absorbida o transmitida por la misma.

(1) Lámpara o fuente de luz, (2) rendija 1, (3) monocromador, (4) rendija 2, (5)
cubeta con muestra, (6) rendija 3, (7) detector y transductor, (8) registro de señal.
Para obtener un espectro UV-VIS de una muestra en solución se irradia en un
rango de longitudes de onda. Empleando una radiación monocromática a la vez,
es decir, una radiación de una sola longitud de onda. Este proceso se denomina
de exploración. La cantidad de la radiación absorbida en cada longitud de onda
se mide y se traza frente a la longitud de onda para obtener el espectro. Así, un
espectro UV-Vis típico es un gráfico de longitud de onda o la frecuencia frente a
la intensidad de la absorción.
Absorción de especies moleculares
Cuando un haz incidente de radiación que tiene una longitud de onda adecuada
golpea una molécula, se lleva a cabo la absorción de un fotón y la molécula se
excita. Cuando las moléculas se excitan estas perderán la energía de excitación
en forma de calor o emitiendo fotones (luminiscencia). La absorción de la
radiación UV-Vis es capaz de afectar a la excitación de los electrones de enlace
y otros electrones de valencia. Por lo tanto, la excitación de los electrones en los
enlaces químicos (π y sigma) o electrones no apareados (n) es el resultado de
la absorción de una longitud de onda adecuada de radiación UV-Vis. La
absorción por lo tanto será dependiente de la disponibilidad de enlaces π y sigma
o electrones n que puedan absorber la radiación incidente
Moléculas con solo enlaces σ
Comencemos con una molécula de CH4 y a continuación expandiremos nuestra
discusión a moléculas más complejas: Todos los enlaces en el metano son
enlaces σ y sólo es posible la transición σ-σ*. Sin embargo, la transición σ-σ*
requiere de muy alta energía que se produce en la radiación UV de vacío. No es
prudente pensar en hacer mediciones de radiación ultravioleta en especies
moleculares en la región UV de vacío (125-185 nm), por cinco razones
importantes:

Esquema de la molécula de metano.

a) La alta energía que se requiere puede causar ruptura de enlaces sigma y
desglose de la molécula.
b) Componentes del aire absorben los rayos UV de vacío lo que limita la
aplicación del método.
c) Trabajar en el UV de vacío requiere una formación especial y de precauciones
que limitan una amplia aplicación del método.
d) Se deben utilizar fuentes y detectores especiales distintos de los que
comúnmente se emplean en espectrofotometría.
e) Todos los disolventes contienen enlaces σ. Por lo tanto, si el compuesto en
estudio tiene solamente enlaces σ, UV-Vis no será la técnica adecuada para el
análisis químico
Moléculas con electrones no enlazantes n

Los electrones que se encuentran en la capa de valencia que no se utilizan en

los enlaces químicos se conocen como electrones no enlazantes (electrones n).
Considere la posibilidad de una molécula como el amoníaco

Los puntos encima del nitrógeno es el símbolo de dos electrones no apareados.

Ahora, el tipo de transiciones observadas en esta molécula se pueden enumerar
como: a) Sigma a sigma antienlazante (σ-σ*) y b) electrones no apareados a
sigma antienlazante (n-σ*).

Esquema de la molécula de amoniaco

Hemos visto anteriormente que la transición σ-σ* no es útil en la práctica de la

espectroscopia UV-Vis, pero la transición de otros (n-σ*) es de menor energía y
se debe discutir más. La longitud de onda de absorción para una transición n-σ*
se produce alrededor de 185 nm donde, por desgracia, la mayoría de los
disolventes pueden absorber. Por ejemplo, el disolvente más importante es, sin
duda, el agua que tiene dos pares de electrones no apareados que fuertemente
absorben como resultado de las transiciones n-σ*; que impiden el uso de esta
transición para estudios de soluciones donde el solvente es agua u otro con
electrones no apareados. En resumen, es también poco práctico pensar en
utilizar la espectroscopia de absorción de radiación UV-Vis para determinar
analitos sobre la base de una transición de n-σ *.

Moléculas con enlaces π

La absorción de la radiación hecha por un alqueno, el cual que contiene un doble

enlace, pueden resultar las siguientes transiciones σ-σ* o π-π*. Hemos visto que
una transición σ-σ* no es útil, pero, por otro lado, la transición π-π* si resulta ser
muy útil, ya que requiere de energía razonable y tiene buena capacidad de
absorción. Una molécula que tiene electrones σ, π, y n puede mostrar todos los
tipos de transiciones posibles en la espectroscopia UV-Vis. Por ejemplo, una
molécula de aldehído (ver Figura 8) muestra todas estas transiciones, ya que
contiene σ, π y dos pares de electrones n.

Espectro de absorción UV-VIS y esquema de la molécula de etanol.

Dos transiciones son posibles para los electrones n: a). n-σ* y b). n-π*. Hemos
visto que a n-σ* no es muy útil debido a la absorción de disolventes y otros
aditivos frecuentemente utilizados que tienen electrones n. La transición n-π*
requiere muy poca energía y parece ser potencialmente útil. Sin embargo, por
desgracia, la capacidad de absorción de esta transición es muy pequeña, lo que
impide su uso para un análisis cuantitativo sensible. En la Figura 8 se puede
observar el espectro de absorción UV-Vis para el acetaldehído. En esta gráfica
la mayor absorbancia es debida a la transición π-π*, lo cual da como resultado
una banda bastante ancha.

Compuestos orgánicos cromóforos

Las absorciones moleculares en la región UV-VIS dependerán de la estructura

electrónica de la molécula. La longitud de onda de la radiación absorbida por una
molécula orgánica se determina por la diferencia de energía entre el estado
fundamental y los diversos estados excitados electrónicos de la molécula.
Recordemos que los átomos que forma una molécula orgánica están unidos a
través de enlaces σ y π. Además, estos tienen electrones no apareados en
átomos como N, O, S y halógenos etc. Hay un número de posibles transiciones
que implican enlaces y electrones no apareados (n)
Absorción de grupos inorgánicos.

Los grupos inorgánicos que contienen dobles enlaces absorben en la región UV-
Vis. La mayoría de las transiciones son un resultado de transiciones n-π*¸ como
en el nitrato (313 nm), en el carbonato (217 nm), en el nitrito (280 y 360 nm) y en
la azida (230 nm). Un gran número de sales inorgánicas que contienen átomos
con electrones en los orbitales d dan bandas de absorción débiles en el espectro
visible. Los iones y los complejos de los elementos de las dos primeras series de
transición pertenecen a este grupo y son coloreados. El color de estas especies
se debe a las transiciones entre los orbitales d. La formación de complejos de
estos iones con las moléculas del disolvente o con otros ligandos aumenta la
degeneración de los cinco orbitales d. Como consecuencia, éstos se dividieron
en grupos que poseen diferentes energías. Las transiciones electrónicas de los
orbitales d de baja energía a orbitales d de alta energía son las responsables del
color que se observa en estos compuestos. Estas transiciones se llaman
transiciones d-d.

LEY DE LAMBERT Y BEER

Fuente: https://image.slidesharecdn.com/leydelambertybeer-130924204343-
phpapp01/95/ley-de-lambertbeer-espectrofotometra-3-638.jpg?cb=1380055682

La cantidad de luz absorbida depende de:

 El tipo de sustancia por la que atraviesa la luz

 La distancia que recorre la luz
 La concentración de la sustancia
 Transmitancia ó % transmitancia

 Absorbancia: Se relaciona con la Transmitancia por medio de la ecuación:

Dónde: Ԑ: Coeficiente de absortividad C:

Concentración de la sustancia en análisis
d: Distancia que recorre la luz

Fuente: (Barba, 2016)

DESCRIPCIÓN DEL PROCESO DE ABSORCIÓN EN EL

ESPECTROFOTÓMETRO

Los aparatos de medida de la absorción de la radiación electromagnética se

denominan espectrofotómetros y pueden representarse de forma sencilla
mediante el siguiente esquema:

Fuente: http://www.fcn.unp.edu.ar/sitio/quimicabiologica1/wp-
content/uploads/2010/08/TP-ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

1. Fuente de radiación
2. Monocromador
3. Cubeta con el analito absorbente
4. Fotomultiplicador TFM
5. Registrador de la información

Según la Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco (2016), la luz

procedente de la fuente se hace pasar a través del monocromador, que la
desdobla en haces monocromáticos. El colimador tiene una rendija de ajuste
variable, y según su abertura se obtiene luz de una determinada longitud de
onda. La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la
posición del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la
solución y luego incide sobre el fototubo, donde se detecta. La señal se envía a
un registrador, el cual puede ser la escala de un galvanómetro calibrado.

ACTIVIDAD DE ABSORBANCIA
La ley de Beer también se puede aplicar a un medio que contenga más de un
tipo de sustancias absorbentes.

Según García (2015) siempre que no haya interacción entre las distintas
especies, la absorbancia total para un sistema multicomponente viene dado por:

Donde los subíndices se refieren a los componentes absorbentes 1, 2,…, n.

ESPECTRO DE ABSORCION DE UNA SUSTANCIA PURA Y EN MEZCLA

Definimos anteriormente que, en una mezcla de sustancias absorbentes, a una

misma longitud de onda las absorbancias son aditivas.

Considerando esto, es posible determinar componentes en una mezcla

determinando las respectivas absorbancias a diferentes longitudes de onda.

Así tendremos:

A partir de estándares puros de las especies X e Y se obtienen, por separado los

respectivos valores de las absortividades molares de X e Y. Luego quedan como
incógnitas las concentraciones de X e Y a ambas longitudes de onda y se
resuelve el sistema de ecuaciones (Valladares, 2006).

ESPECTROS DE ABSORCIÓN MEZCLA COMPONENTES

Fuente: http://www.fao.org/docrep/field/003/ab482s/AB482S19.gif
 CURVA DE CALIBRACIÓN

Uno de los métodos más utilizados para determinar la concentración de una

muestra problema, es el método de la curva de calibración. Esta curva de
calibración es una gráfica que relaciona la concentración de al menos cinco
soluciones de estándar de concentraciones conocidas, con la absorbancia de
cada uno de ellos a la longitud de onda máxima (λ máx.) (U-Cursos, 2010):

Fuente: (U-Cursos, 2010)

Una vez obtenida la gráfica se determina la función matemática que presenta

dicha recta a través del tratamiento estadístico de regresión de los mínimos
cuadrados, la cual relaciona la absorbancia y la concentración de un analito. La
siguiente ecuación matemática corresponde a dicha función:

A: Absorbancia.

n: Intercepto de la recta

m: Pendiente de la recta y que corresponde al producto entre absortividad a de

la muestra y el espesor b de la cubeta.

III. MATERIALES Y METODOS

1. Materiales
- Pipetas volumétricas de 1, 2, 5 y 10 mL
- Matraz volumétrico
- Vaso de precipitado de 100 mL
- 1 piceta con agua destilada
De los reactivos:
- Disolución estandarizada de KMnO4 0.0005M
- Disolución estandarizada de K2CrO7 0.0006M
De los equipos:
- Espectofotómetro UV-VIS
 - Cubetas de plástico
2. Métodos
Calibración del espectofotómetro de absorción UV-VIS
- Calibrar el equipo según instrucciones del manual del equipo e
indicaciones del profesor.
Determinación de Cromo y Manganeso independientemente
- El profesor le entregará al alumno las muestras de cromo y
manganeso de concentración desconocida.
- Oxidar vía húmeda hasta dicromato y permanganato en medio ácido
sulfúrico
- Diluir hasta 100mL
- Diluir hasta una concentración que se encuentre dentro del rango de
curva de calibración
- Leer las absorbancias de cada una de las diluciones de las muestras
a la longitud de onda de máxima absorbancia de cada analito y
completar Tabla 2.
Determinación de Cromo y Manganeso en mezcla
- El profesor entregará al alumno la muestra que contienen una mezcla
de cromo y manganeso.
- Leer las absorbancias de la dilucíón mezcla a la longitud de onda de
máxima absorbancia del dicromato y el permanganato; completar
0Tabla 4.

Balance de masa de entradas y salidas de materiales. Cualitativo

- Identificar y clasificar los residuos generados y disponerlos en los recipientes
que corresponden. Elaborar un esquema de entrada y salida para cada
experimento o ensayo realizado.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Usando la ecuación de la recta del anterior informe, la curva de calibración

correspondiente sería:

Gráfico: Curva de Calibración

0.45
0.4 y = 1860.3x - 0.0019
0.35 R² = 0.9484
0.3
Absorbancia

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 0.00005 0.0001 0.00015 0.0002 0.00025
Concentración

Para hallar el coeficiente de absortividad molar usaremos:

𝑨=𝜺∗𝒃∗𝒄
 𝑨 = 𝟏𝟖𝟔𝟎. 𝟑𝒄 − 𝟎. 𝟎𝟎𝟏𝟗
Usando c=4*10-5, ya que es el dato más cercano a la recta, se tiene que:
A=0.072512
Y reemplazando en la ley de Lambert-Beer:
𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟓𝟏𝟐 = 𝜺 ∗ 𝟏𝒄𝒎 ∗ 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟎𝟒
𝜺 = 𝟏𝟖𝟏𝟐. 𝟖

Tabla 1. Datos para el manganeso como estándar

Sustancia Mn como MnO4-

λmáx absorbancia
524 nm

Longitud cubeta
1 cm

P.A. Mn
54.938

Ecuación de regresión lineal

1860.3 x - 0.0019

Tabla 2. Determinación de manganeso en la muestra

Repetición 1

Peso original de la muestra mineral con manganeso

0.0367g

Volumen de dilución de la muestra

250 mL

Volumen de dilución tomada, V1

2 mL

Volumen final de dilución, V2

5 mL

Absorbancia a λmáx del permanganato

Molaridad del dicromato en dilución leída, M2

0.00075997 M

Molaridad del dicromato en dilución anterior, M1

0.0075997 M

Porcentaje cromo (p/p) en muestra original

7.903 %
 Molaridad del permanganato en dilución leída, M2
0.00027441 M

Molaridad del permanganato en dilución anterior, M1

0.0027441 M

Porcentaje manganeso (p/p) en muestra original

0.15075 %

% promedio de cromo en muestra original

7.903 %

% promedio de manganeso en muestra original

0.15075 %

Tabla 4. Datos de los estándares

Absortividad molar

a λmáx Cr2O7 (425 nm) a λmáx MnO4 (530 nm)

Del dicromato, Cr2O7 283.333 75

Del permanganato, MnO4 130 1680

Tabla 5. Datos de la muestra

Absorbancia total de la dilución muestra

a λmáx Cr2O7 (425 nm) a λmáx MnO4 (530 nm)

Repetición 1 0.251 0.518

V. CONCLUSIONES
 A concentraciones considerables, la recta tiende a desviarse en los datos
obtenidos a partir de la considerable concentración, lo que comprueba la ley de
Lambert-Beer con respecto a la desviación de la curva.
 Los valores tomados en el laboratorio a partir del espectro de absorción se basan
en datos estudiados y comprobados anteriormente.
 El coeficiente de correlación o regresión lineal es afectado si se elimina un dato,
causando una menor o mayor afinidad de los datos a la formación de una recta.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Washington: American Water Works Association, Water Enviromental Federation.
  Skoog, D.A. y West, D.M. 1984. Análisis Instrumental. 2a edición. Ed. Interamericana.
 Hewlett Packard. 1988. The Diode-Array Advantage in UV-VIS Spectroscopy.
Publication No12 - 5594–8912.
 Inge, J.A. Jr. and Crouch, S.R. 1988. Spectrochemical Analysis. Prentice Hall
International, Inc.
 Martínez Urreaga, J.; Narros Sierra, A.; De La Fuente García-Soto, M.M.;
Pozas Requejo, F.; Díaz Lorente, V.M. Experimentación en Química General.
Capítulo 5. Ed. Thomson Paraninfo, 2006
 Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación -
FAO. (1994). Espectrofotometría de Absorción Molecular Ultravioleta-Visible.
Control de Calidad de Insumos y Dietas Acuícolas. Ciudad de México: FAO.
Recuperado de Depósito de Documentos de la FAO.
 BERMEJO MORENO, RAQUEL y MORENO RAMÍREZ, ANTONIO. 2014.
ANÁLISIS INSTRUMENTAL. EDITORIAL SÍNTESIS. MADRID. Capítulo 7.
Páginas: 164-193).
 WHITTEN, KENNETH W. 2008. QUÍMICA. Octava edición. Cengage Learning
Editores, S.A. Impreso en México. Capítulo 8. Páginas180-198
 SKOOG, DOUGLAS A. 2005. Octava edición. Thompson Learning Editores. S.A.
Impreso en México. Páginas: 725-733

CUESTIONARIO