Rodriguez Lopez Joseph Jeremy

Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
A
IC
M
TESIS II
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Efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa
O
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orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus
Y
IA
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:

AC
RM
BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

FA
DE
AUTOR (es): RODRIGUEZ LOPEZ, Joseph Jeremy

CA
SEGURA ALAYO, Alex David

TE
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ASESOR: Dr. QUISPE DÍAZ, Iván Miguel

BI
Co-ASESOR: Dra. LUJÁN VELÁSQUEZ, Manuela Natividad
TRUJILLO - PERÚ
2018
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú.
Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
DEDICATORIA
A nuestro Dios, por ser nuestra luz en este largo
camino, por permitirnos seguir adelante ante toda
adversidad, por ser nuestro guía en todos nuestros
logros y cuidarnos en todo momento.
A
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M
A nuestros padres, por su apoyo incondicional, por
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darnos una carrera para nuestro futuro, por ser el
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BI
motivo que nos impulsa a llegar más lejos y lograr
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IA
todas nuestras metas.

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RM
FA
A nuestros profesores, por haber compartido su

DE
experiencia, entregarnos sus conocimientos y apoyo

CA
durante nuestra formación profesional.

TE
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Los Autores
AGRADECIMIENTO
A nuestro Dios por darnos salud.
A nuestros profesores, que hoy pueden ver un reflejo de lo que han formado,
permitiéndonos fortalecernos como estudiantes.
A nuestro asesor el Dr. Iván Miguel Quispe Díaz (Profesor Auxiliar de la Cátedra de
A
IC
Farmacología de la Facultad de Farmacia y Bioquímica) y Co-Asesora la Dra. Manuela
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Natividad Luján Velásquez (Profesora de Microbiología y Parasitología de la Facultad de
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Q
Ciencias Biológicas), docentes de la Universidad Nacional de Trujillo, por ser excelentes
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profesores, por darnos la oportunidad de trabajar con ustedes y a la vez transmitir sus
Y
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conocimientos hacia nosotros que han sido útiles en el desarrollo de esta tesis, por su
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apoyo desinteresado, paciencia, consejos y ayuda brindados. Gracias también a nuestra

RM
casa de estudios, la Universidad Nacional de Trujillo, en especial a nuestra Facultad de

FA
Farmacia y Bioquímica y a las instalaciones de la misma.

DE
CA
TE
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Los Autores
BI
ii
PRESENTACIÓN
Señores miembros del Jurado Dictaminador:
Dado el cumplimiento a lo establecido por el reglamento de Grados y Títulos de la
Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo; sometemos a
vuestra honorable consideración y elevado criterio el presente informe final de tesis II,
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titulado:
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“Efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa orégano” frente a
Escherichia coli y Staphylococcus aureus”

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RM
Es propicia la oportunidad para evidenciar el más sincero reconocimiento a nuestra

FA
facultad y toda su plana docente que con su capacidad, buena voluntad y enseñanzas
DE
impartidas han contribuido a nuestra carrera profesional.

CA
TE
Dejamos a vuestro criterio señores miembros del jurado dictaminador la calificación del
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presente trabajo de investigación científica.

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Loa Autores
iii
JURADO DICTAMINADOR
PRESIDENTE
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Dra. Marilú Roxana Soto Vásquez
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IA
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JURADO
FA
Dr. Francisco Moisés Abanto Zamora

DE
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TE
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ASESOR
Dr. Iván Miguel Quispe Díaz
iv
RESUMEN
La investigación tuvo como objetivo determinar el efecto in vitro del aceite esencial de
las hojas de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus, para lo cual
se extrajo el aceite esencial mediante el método de destilación por arrastre de vapor de
agua. Para la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se utilizó el
método de macrodilución en caldo Brain Heart Infusion (BHI), posteriormente se agregó
A
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las concentraciones del aceite esencial diluido en polisorbato 80 y se agregó la suspensión
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UI
bacteriana incubándose a 37°C por 48 horas. Obteniendo la CMI del aceite esencial de
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O
Lippia alba frente a Escherichia coli de 2.5 uL/mL, y la CMI del aceite esencial de Lippia
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Y
alba frente a Staphylococcus aureus de 3 uL/mL. Posteriormente en la determinación de
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la Concentración Mínima Bactericida (CMB) se utilizó el método de difusión de agar en

AC
RM
placa, colocando en las placas petri agar Mueller-Hinton obteniéndose la CMB del aceite
FA
esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli de 2.5 uL/mL, y la CMB del aceite
DE
esencial de Lippia alba frente a Staphylococcus aureus de 3 uL/mL. Concluyendo que

CA
el aceite esencial de las hojas de Lippia alba tiene efecto antibacteriano frente a
TE
Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

IO
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BI
Palabras claves: Lippia alba, aceite esencial, Escherichia coli, Staphylococcus aureus.
ABSTRACT
The objective of the research was to determine the In vitro effect of the essential oil of
the leaves of Lippia alba versus Escherichia coli and Staphylococcus aureus, for which
the essential oil was extracted by the method of steam distillation. For the determination
of the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), the Brain Heart Infusion macrodilution
method (BHI) was used, after which the concentrations of the essential oil diluted in
A
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polysorbate 80 were added and the bacterial suspension was added, being incubated at
M
UI
37°C por 48 hours. Obtaining the MIC of the essential oil of Lippia alba versus
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Escherichia coli of 2.5 uL/mL, and the MIC of the essential oil of Lippia alba versus
BI
Y
Staphylococcus aureus of 3 uL/mL. Later in the determination of the Bactericidal
IA
Minimum Concentration (CMB), the method of plate agar diffusion was used, placing in
AC
RM
the petri plates Mueller-Hinton agar, obtaining the CMB of the essential oil of Lippia
FA
alba versus Escherichia coli of 2.5 uL/mL, and the CMB of the essential oil of Lippia
DE
alba versus Staphylococcus aureus of 3 uL/mL. Concluding that the essential oil of the
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leaves of Lippia alba has an antibacterial effect against Escherichia coli and
TE
Staphylococcus aureus.
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BL
Key words: Lippia alba, essential oil, Escherichia coli, Staphylococcus aureus
BI
vi
ÍNDICE
DEDICATORIA ................................................................................................... i
AGRADECIMIENTO .......................................................................................... ii
PRESENTACIÓN ................................................................................................ iii
A
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JURADO DICTAMINADOR .............................................................................. iv
M
UI
RESUMEN ........................................................................................................... v
Q
O
BI
ABSTRACT ......................................................................................................... vi
Y
IA
AC
INDICE ................................................................................................................. vii

RM
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................... 1
FA
DE
II. MATERIAL Y MÉTODO ........................................................................ 16

CA
III. RESULTADOS ........................................................................................ 23

TE
IO
IV. DISCUSIÓN ............................................................................................. 25

BL
BI
V. CONCLUSIONES .................................................................................... 28
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 29
ANEXOS .............................................................................................................. 34
vii
I. INTRODUCCIÓN
En la naturaleza existen dos clases de células, las procariotas y las eucariotas; las
primeras son evolutivamente más antiguas, sólo se hallan como seres unicelulares y
constituyen las bacterias. El resto de los organismos vivos unicelulares y pluricelulares
está formado por células eucariotas1,2,3.
Las bacterias, que son las células más pequeñas, sólo se pueden visualizar con ayuda
A
de un microscopio. Las bacterias de menor tamaño miden sólo 0,1-0,2 µm de diámetro,
IC
M
mientras que las bacterias más grandes pueden alcanzar varias micras de longitud1,2,3,4.
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Las bacterias pueden sobrevivir y, en algunos casos, crecer en entornos hostiles, en los
BI
Y
que la presión osmótica en el exterior de la célula es tan baja que la mayor parte de las
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células eucariotas se lisarían, con temperaturas extremas (tanto cálidas como frías), en
AC
RM
ambientes secos y en presencia de fuentes de energía muy diluidas y diversas. Las

FA
bacterias han sufrido cambios en la estructura y función para adaptarse a estas

DE
condiciones1,2,3,4.
CA
TE
Las bacterias se clasifican en dos grupos en función de la estructura de su pared celular,

IO
las Gram positivas, sólo poseen peptidoglicano y las Gram negativas, tienen adosada
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por fuera del peptidoglicano una membrana rica en lipopolisacáridos. Algunas

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bacterias tienen una cápsula rodeando la pared; también pueden poseer flagelos, que
facilitan su movilidad, y fimbrias (pili), que desarrollan varias funciones,
fundamentalmente de adherencia. En las bacterias, además del ácido
desoxirribonucleico (DNA) cromosómico (nucleoide) puede existir DNA extra
cromosómico formando plásmidos. Las bacterias suelen reproducirse mediante la
división en dos células iguales; este proceso se conoce como fisión binaria1,2,3,4.
Algunas estructuras bacterianas, como el lipopolisacárido de la pared, el polisacárido
capsular y las proteínas de los flagelos, son antigénicas, por lo que inducen la
producción de anticuerpos cuando infectan al hombre1,2,3,4.
Los diferentes grupos bacterianos poseen diversas capacidades metabólicas siendo el
grupo de interés en medicina el que posee un metabolismo heterótrofo; es decir,
requiere sustratos orgánicos como fuente de energía y de carbono. Para el desarrollo
de su metabolismo algunas bacterias necesitan oxígeno (bacterias aerobias); para otras
A
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el oxígeno resulta letal (bacterias anaerobias) y algunas pueden multiplicarse tanto en
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presencia como en ausencia de oxígeno (bacterias facultativas) 1,2,4.
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Del número de especies bacterianas existentes en la biosfera, sólo unas pocas
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colonizan las superficies cutáneomucosas del hombre, y un número aún más limitado
AC
posee capacidad patógena, causando las enfermedades infecciosas2.

RM
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Entre estas especies esta Escherichia coli, una especie del género Escherichia, que es
DE
un miembro de la familia Enterobacteriaceae, bacilos Gram negativos, anaeróbico

CA
facultativo, no forma espora, fermentan la glucosa, reducen los nitratos, son catalasa-
TE
IO
positivo y oxidasa-negativo. Escherichia coli son los más abundantes anaerobios

BL
facultativos en el ser humano del tracto gastrointestinal, donde la mayor parte de ellos
BI
son habitantes normales no patógenas. El género Escherichia poseen unos factores de
virulencia especializados que se pueden clasificar en dos categorías generales:
adhesinas y exotoxinas1,2,5.
Este microorganismo se asocia a múltiples enfermedades, que incluyen la
gastroenteritis e infecciones extraintestinales, como las ITU (Infección del Tracto
Urinario), meningitis y sepsis. Multitud de cepas son capaces de producir enfermedad
y algunos serotipos se asocian a una mayor virulencia1.
También esta Staphylococcus aureus, un coco Gram positivo, caracterizado por
presentar una disposición típica en forma de racimos de uvas, denominado así por sus
colonias amarillas, siendo anaerobio facultativo y catalasa positivo. Crecen
relativamente bien en condiciones de presión osmótica elevada y humedad reducida,
lo que explica en parte que puedan desarrollarse y sobrevivir en las secreciones nasales
A
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y en la piel1,5.
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Q
La enfermedad la produce mediante la liberación de toxinas o a través de la invasión
O
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directa y la destrucción del tejido. Entre las toxinas que produce figuran cinco toxinas
Y
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citolíticas que dañan la membrana (alfa, beta, delta, gamma y leucocidina de Panton-
AC
Valentine [P-V]), dos toxinas exfoliativas (A y B), 18 enterotoxinas (A a R) y la toxina-

RM
1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1) 1,5.

FA
DE
Las manifestaciones clínicas de algunas enfermedades estafilocócicas se deben casi

CA
exclusivamente a la actividad de la toxina (síndrome de la piel escaldada por

TE
IO
estafilococos y síndrome del shock tóxico), mientras que otras afecciones son
BL
consecuencia de la proliferación de los microorganismos, la cual da lugar a la

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formación de abscesos y la destrucción tisular (infecciones cutáneas, endocarditis,
neumonía, empiema, osteomielitis y artritis séptica). La producción de enfermedad en
presencia de un cuerpo extraño (astilla, catéter, anastomosis, prótesis valvular o
articular) requiere un número significativamente menor de estafilococos. En la
actualidad se encuentra como el principal causante de las infecciones nosocomiales1.
Los microorganismos enteropatógenos como Escherichia coli, son causantes de una
gran parte de morbilidad y mortalidad en los países en vías de desarrollo como es el
caso de nuestro país. Otros microorganismos como Enterococcus faecalis, son
causante del 15% de las infecciones intrahospitalarias registradas por el Instituto
Nacional de Salud (INS), Staphylococcus aureus es responsable del 50% y
Pseudomona aeruginosa del 70% de dichas infecciones6.
En los últimos años las diversas enfermedades ocasionadas por agentes patógenos e
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inadecuados comportamientos en los distintos estilos de vida del hombre moderno,
M
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creando muchos problemas de salud y la necesidad de buscar nuevas alternativas de
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tratamiento7.
BI
Y
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Es comparativamente fácil encontrar o desarrollar fármacos eficaces contra células

AC
procariontes y que no afecten las células eucariontes humanas. Estos dos tipos
RM
celulares presentan diferencias sustanciales en varios aspectos, como en la presencia o

FA
la ausencia de paredes celulares, en la estructura precisa de sus ribosomas y en los

DE
detalles de su metabolismo. Asimismo, algunos fármacos tienen un espectro reducido

CA
TE
de actividad microbiana como la penicilina G que afecta a las bacterias Gram positivas,
IO
pero con menor actividad sobre bacterias Gram negativas1,8.

BL
BI
Los antibióticos que actúan sobre una amplia variedad de bacterias Gram positivas y
Gram negativas se denominan antibióticos de amplio espectro. Dado que no siempre
se conoce de inmediato la identidad del patógeno, un fármaco de amplio espectro
parece tener ventajas en el tratamiento de una enfermedad para ahorrar un tiempo
valioso. La desventaja es que con estos fármacos se destruye gran parte de la
microflora normal del huésped que normalmente suele competir con los patógenos o
con otros microbios y controlar su crecimiento. Los fármacos antimicrobianos son
bactericidas (destruyen directamente a las bacterias) o bacteriostáticos (inhiben su
crecimiento)1,8.
Habría que concebir las moléculas de antimicrobianos como ligandos cuyos receptores
son las proteínas de los microorganismos. El término farmacóforo introducido por
primera vez por Ehrlich, define la fracción química activa del fármaco que se une al
receptor microbiano. Las proteínas microbianas en las que actúa el antibiótico son
A
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componentes esenciales de reacciones bioquímicas en los microorganismos, y la
M
UI
interferencia en sus vías fisiológicas termina por destruirlos. En la medida en que un
Q
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antimicrobiano actúe de manera específica en una proteína que no se expresa de forma
BI
Y
extensa en otras bacterias, el fármaco tendrá un efecto relativamente selectivo como
IA
antimicrobiano8.
AC
RM
Los procesos bioquímicos que suelen inhibirse incluyen síntesis de las paredes y de
FA
las membranas; síntesis de las subunidades ribosómicas 30s y 50s, metabolismo de

DE
ácidos nucleicos, función de topoisomerasas, proteasas e integrasas. La clasificación

CA
TE
de un antibiótico se basa en: la clase y el espectro de microorganismos que destruye,

IO
la vía bioquímica que interfiere y la estructura química de su farmacóforo8.

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BI
Dentro de los inhibidores de la síntesis de la pared celular están los antibióticos b-
lactámicos que catalizan enzimas específicas (transpeptidasas, transglucosilasas,
carboxipeptidasas) que son miembros de una gran familia de serina proteasas. Estas
enzimas reguladoras reciben también la denominación de proteínas fijadoras de
penicilinas (PBP), porque son las dianas de los antibióticos b-lactámicos. Los cuales
se unen a PBP específicas de la pared celular bacteriana, activando autolisinas que
degradan la pared celular, dando lugar a la muerte de la célula bacteriana1,8.
Entre los antibióticos b-lactámicos tenemos las penicilinas, muy eficaces con una
toxicidad baja. También la combinación de penicilinas con inhibidores de las b-
lactamasas (ácido clavulánico, sulbactam, tazobactam, otros), siendo eficaces en el
tratamiento de algunas infecciones causadas por bacterias productoras de b-
lactamasa1,8.
A
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También las cefalosporinas son antibióticos b-lactámicos derivados del ácido 7-
Q
aminocefalosporánico siendo más estables a la hidrólisis por las b-lactamasas. Otras
O
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clases de antibióticos b-lactamicos son los carbapenems y los monobactams5,10.
Y
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Dentro de los inhibidores de la síntesis de la pared celular también están los

RM
glucopéptidos como la vancomicina, los lipopéptidos como la daptomicina, los

FA
polipéptidos como la bacitracina, las polimixinas (polipéptidos cíclicos), la isoniazida,

DE
la etionamida, el etambutol y la cicloserina1,5,8.

CA
TE
La segunda clase más importante de antibióticos es la inhibición de la síntesis de

IO
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proteínas. Entre estos están los aminoglucósidos, estos antibióticos ejercen su acción
BI
al pasar a través de la membrana externa bacteriana (en bacterias Gram negativas), la
pared celular y la membrana citoplasmática al citoplasma, en donde inhiben la síntesis
de proteínas al unirse de modo irreversible a las proteínas ribosómicas 30S. Esta unión
a los ribosomas tiene dos efectos: producción de proteínas aberrantes como
consecuencia de una lectura errónea del ARN mensajero (ARNm) y la interrupción de
la síntesis de proteínas al producir la liberación prematura del ribosoma del ARNm1,5,8.
También están los inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos como las quinolonas
(ácido nalidíxico, ciprofloxacino, el levofloxacino, el moxifloxacino y
fluoroquinolonas), la rifampicina, el metronidazol, las sulfamidas, la trimetoprima, la
dapsona y el ácido p-aminosalicílico1,5,8.
Entre otros antibióticos esta la clofazimina, un antibiótico lipófilo que se une al DNA
micobacteriano. la pirazinamida (la forma activa de este antibiótico es el ácido
pirazinoico, producido cuando se hidroliza en el hígado), otros1,5,8.
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Cuando se comenzaron a usar en seres humanos, los antimicrobianos se consideraron
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curas milagrosas. Sin embargo, poco después del descubrimiento de la penicilina se
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BI
advirtió que aparecía en forma rápida resistencia, lo que ponía fin al milagro. Esta
Y
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situación grave persiste con cada antimicrobiano nuevo y amenaza con terminar con
AC
la época de los antimicrobianos. En la actualidad, cualquier clase importante de

RM
antibióticos se acompaña de la aparición de resistencia notable1,5.

FA
DE
Una especie sometida a presiones químicas o de otro tipo que amenazan con su
CA
extinción, suele desarrollar mecanismos para sobrevivir bajo tal tensión excesiva. Los
TE
patógenos evolucionarán para presentar resistencia a la “guerra química” a la que están

IO
BL
sometidos. Esta evolución se facilita con prácticas terapéuticas inadecuadas realizadas

BI
por el personal de atención de la salud, así como por el uso indiscriminado de
antibióticos. Las prácticas clínicas que no incorporan las propiedades farmacológicas
de los antimicrobianos aceleran el surgimiento y la evolución de la resistencia a
fármacos1,5.
La resistencia a antimicrobianos puede surgir en una o más de las etapas de los
procesos por los que el fármaco llega y se combina con el sitio en que actúa. De este
modo, la resistencia puede surgir a causa de: disminución de la penetración del
antibiótico en el interior del patógeno, mayor expulsión del antibiótico desde la célula
por la acción de bombas de extracción, liberación de enzimas del microbio que
destruyen el antibiótico, alteración de proteínas microbianas que transforman los
profármacos en sus fracciones eficaces, alteración de las proteínas en que actúa un
fármaco y la creación de otras vías distintas a las inhibidas con el antibiótico1,5.
El primer mecanismo de resistencia se observa en bacterias Gram negativas. Estas
A
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bacterias poseen una membrana externa que está por encima de la capa de
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peptidoglucano. La penetración de los antibióticos b-lactámicos en el interior de los
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bacilos Gram negativos requiere el paso a través de unos poros en esta membrana
BI
Y
externa. Los cambios en las proteínas (porinas) que forman las paredes de los poros,
IA
AC
pueden alterar el tamaño del orificio del poro o la carga de estos canales y dar lugar a
RM
la exclusión del antibiótico1,5.

FA
La resistencia puede adquirirse por modificación de la unión del antibiótico b-

DE
lactámico a la PBP. Esta modificación puede estar mediada por una hiperproducción
CA
TE
de PBP (fenómeno infrecuente), la adquisición de una nueva PBP, la modificación de

IO
una PBP existente por recombinación o una mutación puntual. Por último, las bacterias
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pueden producir b-lactamasas que inactivan los antibióticos b-lactámicos1,5.

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En los aminoglucósidos el mecanismo de resistencia más común es la modificación
enzimática que se lleva a cabo por la acción de fosfotransferasas, adeniltransferasas y
acetiltransferasas en los grupos amino e hidroxilo del antibiótico1,5.
En las tetraciclinas los investigadores han identificado una variedad de genes en
diferentes bacterias que controlan el eflujo activo fuera de la célula. La resistencia a
las tetraciclinas puede ser consecuencia también de la producción de proteínas
similares a factores de elongación que protegen el ribosoma 30S. Cuando así sucede,
el antibiótico puede aún unirse al ribosoma, pero no se desestructura la síntesis
proteica1,5.
Se observa también resistencia al cloranfenicol en bacterias productoras de
cloranfenicol acetiltransferasa de codificación plasmídica, que cataliza la acetilación
del grupo 3-hidroxi del cloranfenicol. El producto es incapaz de unirse a la subunidad
A
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50S1,5.
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En los macrólidos lo más frecuente es que la resistencia se origine de la metilación del
O
BI
ARNr 23S, impidiendo la unión por el antibiótico. Otros mecanismos de resistencia
Y
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incluyen la inactivación de los macrólidos por enzimas (esterasas, fosforilasas,

AC
glucosidasa) o mutaciones en el ARNr 23S y en las proteínas ribosómicas1,5.

RM
FA
En las quinolonas la resistencia está mediada por mutaciones cromosómicas en los

DE
genes estructurales del DNA girasa y en la topoisomerasa de tipo IV. Otros

CA
mecanismos incluyen una menor captación del fármaco causada por mutaciones en los
TE
IO
genes reguladores de la permeabilidad bacteriana, y una hiperexpresión de bombas de

BL
eflujo que de modo activo eliminan el fármaco. Cada uno de estos mecanismos está
BI
principalmente mediado por el cromosoma1,5.
En los últimos años se han realizado investigaciones dirigidas a buscar nuevas terapias
antimicrobianas como opciones alternas a los tratamientos con antibióticos conocidos,
debido a la alta tasa de resistencia que presentan los patógenos microbianos en todo el
mundo. Este importante problema de salud pública involucra a todos los países debido
a su impacto en la salud, como en el costo-beneficio que implica tratar estas
patologías9.
Estudios realizados por la Organización Mundial de la Salud (OMS), Comunidad
Andina de Naciones (CAN), entre otras organizaciones nacionales e internacionales,
establecen que mediante la bioprospección y aprovechando los recursos naturales, se
podrían diseñar alternativas de tratamiento. Uno de los organismos con los cuales se
está trabajando para obtener nuevos compuestos antimicrobianos son las plantas9.
A
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Desde tiempos remotos es sabido que las plantas han sido utilizadas para una amplia
Q
variedad de propósitos. Las plantas medicinales nos ofrecen recursos potencialmente
O
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útiles en el tratamiento de enfermedades, representando una estrategia prometedora en
Y
IA
muchas enfermedades. Recursos que serán utilizadas como materia prima para la
AC
utilización de extractos o para el aislamiento de sustancias naturales puras,

RM
representando así una gran área en expansión10.

FA
DE
Además, en la actualidad se reconoce la importancia de origen natural, por que poseen

CA
innumerables características, con bajo costo y sus principios activos están

TE
IO
biológicamente equilibrados evitando que se acumulen en el organismo, no

BL
presentando efectos secundarios o no advertidos10.

BI
La medicina natural hoy es un campo terapéutico que constituye una vía para
contrarrestar los efectos adversos de los productos farmacéuticos obtenidos mediante
síntesis química. Su aplicabilidad en la terapéutica actual le permite ser considerada
como una de las más importantes modalidades de la medicina complementaria10.
Dentro de estas plantas medicinales está la familia verbenaceae, utilizadas
10
tradicionalmente para tratar múltiples enfermedades. Entre los estudios realizados
tenemos:
El estudio desarrollado en la Universidad Nacional Jorge Basadre Grohmann de Tacna,
donde el aceite esencial de Aloysia triphylla P. mostro actividad antibacteriana
significativa frente a Escherichia coli y moderada frente a Staphylococcus aureus.
Así, el estudio reveló la CMI (Concentración Mínima Inhibitoria) de Escherichia coli
siendo de 3,701 mg/mL mientras que para Staphylococcus aureus fue 15,167 mg/mL.
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También se precisó la CMB (Concentración Mínima Bactericida) de Escherichia coli
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siendo de 4,186 mg/mL, mientras que para Staphylococcus aureus fue 16,259
Q
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mg/mL11.
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El estudio desarrollado en la Universidad de los Andes de Venezuela, muestra que el

AC
aceite esencial de Aloysia triphylla reveló inhibición del desarrollo de todas las
RM
bacterias aisladas (Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Enterobacter aerogenes,

FA
Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus y Enterococcus sp.), con valores de CMI

DE
de 10-50 μg/mL12.
CA
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El estudio desarrollado en la Universidad Sultan Moulay Slimane de Marruecos,

BL
afirma que los aceites esenciales de Aloysia citridora mostraron una actividad
BI
antimicrobiana significativa contra bacterias Gram negativas y Gram positivas con una
CMI de 2.84 y 8.37 mg /mL frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus
respectivamente13.
El estudio desarrollado en la Universidad pedagógica y tecnológica de Colombia,
muestra que el extracto etanolico de las hojas secas de Lantana cámara, frente a
Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa exhibió mejor
11
actividad contra Staphylococcus aureus con un CMI de 12 mg/mL y CMB de 28
mg/mL14.
El estudio desarrollado en la Universidad del Quindío de Colombia, muestra que los
extractos apolares de las hojas de Lippia origanoides H.B.K. mostraron actividad de
inhibición del crecimiento de los microorganismos evaluados (Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Pseudomona aeruginosa, otros), mientras que los extractos
polares no mostraron actividad frente a los mismos microorganismos15.
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El estudio desarrollado en la Universidad Juárez del Estado de Durango de Mexico,
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muestra que el extracto etanólico de Lippia graveolens tiene un fuerte poder
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inhibitorio contra Staphylococcus aureus, además que en combinación con Propolis
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sugiere un efecto sinergico16.

AC
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Dentro de la misma familia de estas plantas se encuentra Lippia alba que es originaria
FA
de América del Sur (Brasil). Se encuentra en regiones tropicales, subtropicales y

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templadas. En el Perú, en los departamentos de Loreto; Amazonas; Huánuco; La

CA
Libertad; Pasco; Ucayali y San Martín. Conocida también por otros nombres como:
TE
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pampa orégano, cidra, cidraero, orégano, sideraca, sideraera, erva cidreira, salsa brava,
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salva, salvia17.
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La Lippia alba, es una hierba arbustiva muy ramificada, de 1 a 2 m de altura, con olor
aromático característico, de tallo rectilíneo y curvado, flexible y quebradizo, de color
castaño claro con ramas nuevas pubescentes y las viejas glabras, hojas elípticas hasta
redondeadas, enteras, simples, penninervadas, aserradas en el margen y ligeramente
escabrosas en la superficie, opuestas, de color verde acenizada de 6 cm de largo y 2,5
cm de ancho. Inflorescencias en capítulo, axial, pedunculada, con bráctea. Flores
12
reunidas en la periferia de la inflorescencia, fuertemente zigomorfas, herma-froditas,
corola lila y blanquecina con fondo amarillo. Fruto drupa o cápsula seca con exocarpo
de color violeta oscuro. Raíz axial, fasciculada, con más o menos 25 cm de largo17.
El género Lippia de la familia Verbenaceae, comprende acerca de 200 especies
distribuidas por las regiones tropicales, subtropicales y templadas de la América,
África y Asia. Los aceites esenciales se encuentran en las estructuras celulares de la
epidermis, más específicamente de las glándulas secretoras especializadas conocidas
A
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como tricomas glandulares. El aceite esencial de Lippia alba está compuesto
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principalmente por dos tipos de compuestos químicos, los terpenoides y los
Q
O
fenilpropanoides. Aunque existe un gran número de quimiotipos18.
BI
Y
IA
El aceite esencial de Lippia alba, está constituido por siete quimiotipos. Pertenecen al
AC
quimiotipo I los aceites que poseen citral, linalol, -cariofileno como sus principales
RM
componentes. Los aceites incluidos en el quimiotipo II tienen tagetenona como su

FA
principal constituyente. Aquellos que poseen limoneno en grandes cantidades y con

DE
una cantidad variable de carvona o cetonas monoterpénicas en lugar de carvona están

CA
TE
incluidos en quimiotipo III. Los quimiotipos restantes se caracterizan por presentar

IO
componentes principales específicos en su composición, tales como quimiotipo IV:

BL
mirceno, V: -terpineno, VI: canfora-1,8-cineol y VII: estragol18.

BI
La planta de Lippia alba tiene diversos usos comerciales y tradicionales asociados a
su acción terapéutica, empleándose como analgésico, antiinflamatorio, antipirético
sedante, antidiarreico, antifúngico, en enfermedades intestinales y hepáticas,
anticolesterolémico, larvicida, repelente, antimicrobiano, antiviral, antimalaria y
molusquicida. Por lo que posee un elevado potencial terapéutico18.
13
Conociendo la diversidad de plantas medicinales en nuestro país y conociendo las
propiedades que tienen sus aceites esenciales. Planteamos esta investigación para
ampliar nuestros conocimientos científicos en el valor que tiene Lippia alba con sus
múltiples propiedades, en especial el efecto antimicrobiano.
Actualmente en el Perú se ha incrementado el porcentaje de infecciones causada por
Escherichia coli y Staphylococcus aureus constituyéndose un problema de Salud
Pública; por lo que se considera necesario la realización del presente trabajo de
A
IC
investigación orientado a determinar el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas
M
UI
de Lippia alba ”pampa orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus,
Q
O
con la finalidad de proporcionar una alternativa de solución a este problema con
BI
recursos que estén al alcance de la población. Es por ello que se plantea el siguiente
Y
IA
problema:
AC
RM
¿Cuál es el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba “pampa
FA
orégano” frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus?

DE
Plantemos la siguiente hipótesis:

CA
TE
El aceite esencial de las hojas de Lippia alba tiene efecto antibacteriano, medido por
IO
BL
la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Mínima Bactericida

BI
(CMB), sobre Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
14
Objetivos
Objetivo general
Determinar el efecto in vitro del aceite esencial de las hojas de Lippia alba pa pa
oréga o frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
Objetivos específicos
 Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las
hojas de Lippia alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a
A
IC
Escherichia coli.
M
UI
 Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las
Q
O
hojas de Lippia alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a
BI
Y
IA
AC
 Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las

RM
hojas de Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a

FA
Escherichia coli.
DE
 Determinar la Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las

CA
hojas de Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a

TE
IO
BL
BI
15
II. MATERIAL Y MÉTODO
2.1. Materiales
2.1.1. Material botánico
Muestras de hojas de Lippia alba procedente del Jardín Botánico de Plantas
Medicinales "Rosa Elena de los Ríos Martínez" de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo del distrito de Trujillo,
provincia de Trujillo, región La Libertad, recolectadas en la época de primavera,
A
identificada y depositada con el código N° 59148 en el Herbarium Truxillense
IC
M
de la Universidad Nacional de Trujillo (Anexo 1).
UI
Q
2.1.2. Material biológico
O
BI
Se utilizaron cepas de Escherichia coli (ATCC 25992) y Staphylococcus aureus
Y
(ATCC 25923). Estas cepas fueron proporcionadas por el Laboratorio de
IA
AC
referencia regional en salud pública, del distrito de Trujillo, provincia de

RM
Trujillo, región La Libertad.

FA
2.1.3. Medios de cultivo

DE
- Agar Mueller-Hinton
CA
- Caldo Brain Heart Infusion (BHI)

TE
IO
2.1.4. Medicamento
BL
- Ciprofloxacino 200mg/100mL (CIPROF-200)

BI
2.1.5. Equipos
- Incubadora Microbiológica (PRECISION)
- Balanza triple brazo (OHAUS 700/800 series)
- Estufa de convección forzada (JSR)
- Congeladora (Coldex)
- Equipo de arrastre por vapor – extracción de aceites volátiles.
16
2.1.6. Solventes
- Solución salina fisiológica
- Polisorbato 80 (Tween 80)
2.1.7. Material de vidrio
- El de uso común en el laboratorio.
2.1.8. Reactivos
- Agua destilada
A
2.1.9. Otros
IC
M
- 6 Jeringas de 1 cc
UI
Q
- 7 frascos de 10 cc, color ámbar.
O
- 500 g de algodón hidrofílico. BI
Y
- Caja de guantes estériles
IA
AC
- Gradilla
RM
- Mascarillas
FA
- Mechero de alcohol
DE
- Cocina eléctrica
CA
- Papel filtro Whatman Nº 1

TE
IO
- Papel Kraft
BL
- Placas petri
BI
17
2.2. Método
2.2.1. Procedimiento Farmacobotánico
2.2.1.1. Recolección
Se recolectó hojas de Lippia alba, procedente del Jardín Botánico de Plantas
Medicinales "Rosa Elena de los Ríos Martínez" de la Facultad de Farmacia y
Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo del distrito de Trujillo,
provincia de Trujillo, región La Libertad, en la época de primavera.
A
IC
M
2.2.1.2. Preparación de la muestra19
UI
Q
a. Selección
O
BI
La planta recolectada fue transportada al Laboratorio de Farmacognosia de la
Y
IA
Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,

AC
donde se eliminarán las sustancias extrañas presentes en la muestra.

RM
b. Lavado
FA
Luego de la separación de las sustancias extrañas, se procedió a lavar las hojas

DE
frescas con agua destilada, seguido de una desinfección, se utilizó hipoclorito

CA
TE
de sodio, a una concentración de 200 ppm.

IO
c. Secado
BL
Se separó las hojas de los tallos de la planta, se colocó sobre papel kraft y se
BI
secó en estufa a 40 °C19.
2.2.1.3. Obtención del aceite esencial de las hojas de Lippia alba
El aceite esencial fue extraído a partir de las hojas frescas por el método de
destilación de arrastre de vapor de agua. Se pesaron 100 g de hojas frescas y se
colocaron en una pera de separación. En un balón a parte se colocó 1000 mL de
18
agua destilada y se calentó hasta punto de ebullición. Luego la muestra fue
sometida a una corriente de vapor de agua sobrecalentada; de esta manera se
arrastró la esencia que posteriormente por acción del refrigerante, fue
condensada y se obtuvo dos fases, una de aceite esencial y otra del agua
(hidrolato); posteriormente se separó el aceite esencial por decantación y se
deshidrató las impurezas de agua en el aceite esencial con sulfato de sodio
anhidro, se filtró y se guardó en un frasco de vidrio color ámbar (para evitar la
A
descomposición por la luz), bajo refrigeración a una temperatura de 4 oC20,21.
IC
M
UI
Q
2.2.1.4. Preparación de las diferentes concentraciones del aceite esencial de las hojas
O
de Lippia alba BI
Y
Se tomó del aceite esencial puro (100%), volúmenes de 0.20 mL. 0.25 mL, 0.30
IA
AC
mL, 0.35 mL, 0.40 mL y 0.45 mL, se colocaron en frascos color ámbar
RM
completando con polisorbato 80, para obtener las concentraciones de 20%, 25%,
FA
30%, 35%, 40% y 45% (v/v) respectivamente22.

DE
CA
2.2.2. Procedimiento Microbiológico23,25,26

TE
IO
2.2.2.1. Distribución de los grupos de estudio

BL
Para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI), del aceite esencial

BI
de las hojas de Lippia alba, se trabajó por triplicado mediante el método de
macrodilución en caldo BHI, a la concentración de 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 uL/mL
para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, utilizando polisorbato 80 como
blanco, y al ciprofloxacino como patrón.
Para determinar la concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial
de las hojas de Lippia alba se trabajó por triplicado, mediante el método de agar
19
en placa, de los tres primeros tubos de la lectura del CMI, en los cuales no se
observó crecimiento visible de la bacteria.
2.2.2.2. Preparación de inóculos bacterianos23,25,26
a. Reactivación de las cepas
Cada cepa bacteriana se sembró en tubos con agar Müller-Hinton inclinado, los
cuales se incubaron a 37° C durante 24 horas.
A
IC
b. Estandarización del inóculo
M
UI
Se tomó una pequeña cantidad de colonias de cada cepa, para luego ser
Q
O
suspendidas en solución salina fisiológica estéril hasta alcanzar la turbidez
BI
equivalente al tubo N° 1 del Nefelómetro de Mac Farland (3 x 108 UFC/mL).
Y
IA
AC
2.2.2.3. Actividad bacteriana por el método de difusión de Kirby Bauer

RM
modificado27
FA
DE
Se empleó la técnica de difusión en placa, según el método de Kirby Bauer, la

CA
cual fue modificada, sustituyéndose el disco de papel por pocillos en el medio

TE
de cultivo agar Mueller-Hinton solidificado.

IO
BL
Este método se fundamenta en la difusión de una muestra a través de una capa

BI
de agar solidificado, en una extensión tal que el crecimiento de microorganismos
sensibles es inhibido en zonas alrededor del área que contiene una concentración
conocida de la muestra en estudio.
20
2.2.2.4. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)23,24,25,26
La concentración mínima inhibitoria es la menor concentración de
antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento visible de la bacteria en el medio
de cultivo, tras 18-24 horas de incubación.
a. Método de macrodilución en caldo BHI
Se utilizó tubos de ensayo, en los cuales se colocó 3 mL de caldo BHI, luego
se añadió 30 uL, de cada una de las concentraciones de las diluciones del
A
IC
aceite esencial preparadas anteriormente, luego en cada tubo de ensayo se
M
UI
colocó 6 uL de la suspensión de la bacteria y se incubó a 37°C por 24 horas.
Q
O
Se empleó como control positivo al ciprofloxacino, 30 uL a una concentración
BI
Y
de 2mg/mL y para el control negativo 30 uL de polisorbato 80. Se trabajó por
IA
AC
triplicado.
RM
Después de 24 horas de incubadas a 37°C, los tubos de ensayo se examinaron

FA
visualmente. Se consideró la concentración mínima inhibitoria a la menor

DE
concentración de la dilución del aceite esencial a la cual el microorganismo

CA
ensayo no presento desarrollo visible.

TE
IO
2.2.2.5. Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)23,24,25,26

BL
BI
La concentración mínima bactericida es la menor concentración capaz de
destruir o matar el 99.9% de bacterias del inoculo original, tras 18-24 horas de
incubación.
a. Método de difusión de agar en placa23,24,25,26
Se colocó en placas petri, 18 mL de Agar Mueller-Hinton. De la lectura del
CMI, a partir del tubo que no se observó crecimiento bacteriano (inhibición
del crecimiento), se contó 3 tubos. De cada tubo seleccionado se extrajo 1 mL
21
para realizar la técnica de siembra por incorporación en placas con agar
Mueller-Hinton.
Se trabajó por triplicado con cada cepa e incubo a 37°C por 24 horas.
Luego se procedió con la lectura; se consideró la CMB a la menor
concentración de aceite de hojas de Lippia alba que destruyó o mató al 99.9%
de bacterias.
A
2.3. Análisis de datos23
IC
M
Los datos fueron presentados en tablas haciendo uso del Excel 2016.
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
22
III. RESULTADOS
Tabla 1. Concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus
A
IC
M
UI
Cepas Concentración mínima inhibitoria
Q
O
Bacterianas (μL/mL)
BI
̅± . .
𝐗
Y
IA
Escherichia coli 2.5 ± 0.00
AC
RM
Staphylococcus aureus 3 ± 0.00
FA
̅
DE
X = promedio
CA
D. E. = desviación estándar
TE
Fuente: Investigadores
O
B LI
BI
23
Tabla 2. Concentración mínima bactericida (CMB) del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus
Cepas Concentración mínima bactericida
A
IC
Bacterianas (μL/mL)
M
UI
̅± . .
𝐗
Q
2.5 ± 0.00
O
Escherichia coli
BI
3 ± 0.00
Y
Staphylococcus aureus
IA
AC
̅ = promedio
X
RM
D. E. = desviación estándar
FA
DE
Fuente: Investigadores CA
TE
O
B LI
BI
24
IV. DISCUSIÓN
Al comienzo del estudio se realizó el método de difusión de Kirby Bauer modificado para
verificar que el aceite esencial de las hojas de Lippia alba tiene efecto sobre los
microorganismos en estudio, comprobando que si tiene efecto. Después se realizaron varios
ensayos para determinar las concentraciones de aceite esencial para realizar el estudio,
encontrando que el aceite esencial opacaba el caldo BHI, siendo necesario tomar como
A
IC
referencia para la determinación del CMI el sedimento bacteriano.
M
UI
En la tabla N° 01 se observa los valores de la CMI del aceite esencial de las hojas de Lippia
Q
alba, siendo para Escherichia coli y Staphylococcus aureus, 2.5 μL/mL y 3 μL/mL
O
BI
respectivamente. Dentro de esta familia, el aceite esencial de Lippia origanoides presento
Y
IA
una CMI para Staphylococcus aureus de 1,25 μL/mL durante los 10 meses de estudio y para
AC
Escherichia coli variaron entre 0.15 μL/mL a 0.31 μL/mL, estos resultados indican que los
RM
componentes del aceite esencial varían dependiendo de la estación y asimismo varían sus
FA
propiedades 27.
DE
CA
En la determinación del CMB, tiene de destruir o matar el 99.9% de bacterias del inoculo
TE
original, 0.1% es la cantidad máxima de UFC que debían crecer en placa, siendo en nuestro
IO
trabajo 600 UFC. En las placas cultivadas a partir del CMI de Escherichia coli no hubo
BL
BI
crecimiento bacteriano considerando la menor concentración como la CMB, pero en las
placas cultivadas a partir del CMI de Staphylococcus aureus si hubo crecimiento bacteriano,
siendo en todas las placas menor a 600 UFC (menor al 0.1% del inoculo original),
considerando la menor concentración como la CMB.
En la tabla N° 02 muestra los valores de la concentración mínima bactericida (CMB) del
aceite esencial de las hojas de Lippia alba, siendo para Escherichia coli y Staphylococcus
aureus, 2.5 μL/mL y 3 μL/mL respectivamente.
25
Dentro de esta familia, el aceite esencial de Lippia origanoides presento una CMB para
Escherichia coli de 1.25 μL/mL y para Staphylococcus aureus fue de 2.5 μL/mL27.
Mostrando que esta especie tiene un mejor efecto bactericida.
La actividad antimicrobiana del aceite esencial depende principalmente de tres
características; sus componentes químicos, su carácter hidrófobo, y el tipo de
microorganismo al que debe atacar28.
La composición de los aceites esenciales varía de acuerdo a las diferentes partes de la planta
A
de las cuales se extrae, y puesto que sus componentes volátiles son los que presentan el
IC
M
efecto antimicrobiano, se ha demostrado que los principales componentes derivan de un
UI
Q
grupo de terpenoides, sesquiterpenos y diterpenos, los cuales a su vez contienen diferentes
O
BI
grupos de hidrocarburos, ácidos, alcoholes, aldehídos, esteres, éteres y cetonas.
Y
El aceite esencial de Lippia alba está caracterizado por un alto contenido de monoterpenos
IA
AC
oxigenados y por un bajo contenido de hidrocarburos sesquiterpénicos y sesquiterpenos

RM
oxigenados.
FA
El efecto inhibidor de varios terpenoides en la absorción de oxígeno microbiano y la

DE
fosforilación oxidativa ha sido demostrado, siendo los compuestos fenólicos y los alcoholes
CA
no fenólicos los que exhiben los efectos inhibidores más fuertes, seguidos de aldehídos y
TE
IO
cetonas, estando así relacionada con el alto contenido de oxígeno que contienen los
BL
monoterpenos representados principalmente por aldehídos y alcoholes28.

BI
Según su carácter hidrófobo, tiene la capacidad de alterar y penetrar en la estructura lipídica
de la pared celular perturbando estructuras celulares, lo que lleva a la desnaturalización de
las proteínas y a la destrucción de la membrana celular, haciéndolas más permeables, lo que
conduce a rupturas o fugas citoplasmáticas, lisis celular, interacciones con proteínas ATPasa
y eventualmente la muerte del microorganismo29.
26
Por otro lado, se ha observado en estudios que las bacterias Gram-negativas tienen mayor
susceptibilidad a los aceites esenciales a diferencia de las Gram-positivas, estando
relacionado con la membrana externa compuesta por lipopolisacáridos que poseen este tipo
de bacterias29.
Otros estudios suponen que el efecto antimicrobiano de los monoterpenos está influenciado
por la carga superficial de la membrana celular microbiana30.
Los resultados obtenidos en esta tesis con otros estudios similares, puede diferir que muchos
A
factores varían entre los ensayos. Esto incluye diferencias en el crecimiento microbiano,
IC
M
exposición de los microorganismos al aceite esencial, la solubilidad del aceite, el uso y
UI
Q
cantidad de emulsificante. Asimismo, la composición del aceite esencial de Lippia alba
O
BI
puede variar, teniendo en cuenta factores como el clima y las condiciones ambientales.
Y
En las diferentes regiones, las mismas especies de plantas pueden exhibir diferente
IA
AC
composición de aceite esencial, esto es justificado por el hecho de que los aceites esenciales
RM
son metabolitos secundarios cuya producción y acumulación depende de variables tales

FA
como el tipo de suelo (por ejemplo: tamaño de la partícula, pH y nutrientes), condiciones

DE
ambientales (temperatura, precipitación, humedad, duración de luz del día, niveles de luz),
CA
disponibilidad del agua y exposición a herbívoros27.

TE
IO
Estos y otros elementos se deben tener en cuenta en la concentración mínima inhibitoria y

BL
concentración mínima bactericida.

BI
27
V. CONCLUSIONES
 La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las hojas de Lippia
alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a Escherichia coli fue 2.5
μL/mL.
 La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del aceite esencial de las hojas de Lippia
alba, por el método de macrodilución en caldo BHI frente a Staphylococcus aureus
A
fue 3 μL/mL.
IC
M
 La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las hojas de
UI
Q
Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a Escherichia coli fue
O
2.5 μL/mL. BI
Y
 La Concentración Mínima Bactericida (CMB) del aceite esencial de las hojas de
IA
AC
Lippia alba, por el método de difusión de agar en placa frente a Staphylococcus

RM
aureus fue 3 μL/mL.

FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
28
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A
24. Picazo J. Métodos básicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos.
IC
M
2000 [acceso en agosto del 2017]. Disponible en:
UI
http://www.seimc.org/contenidos/documentoscientificos/procedimientosmicrobiolo
Q
O
gia/seimc-procedimientomicrobiologia11.pdf
BI
Y
25. Saldarriaga A. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y
IA
Concentración Mínima Bactericida del aceite de Citrus sinensis (Naranja) variedad

AC
RM
Tangelo en el crecimiento de Staphylococcus aureus y de Escherichia coli [tesis].

FA
Universidad Nacional de Trujillo; 2016.

DE
26. Vidal S. Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria y Concentración

CA
Mínima Bactericida del aceite de Citrus reticulada variedad satsuma (mandarina),

TE
en el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus [tesis].

IO
Universidad Nacional de Trujillo; 2013.

BL
27. Sarrazin S, Da Silva L, de Assunção APF, Oliveira R, Calao V, Da Silva R,

BI
Stashenko E, Maia J, Mourão R. Antimicrobial and Seasonal Evaluation of the
Carvacrol-Chemotype Oil from Lippia origanoides Kunth. Molecules. 2015;
20(2):1860-1871. [acceso en agosto del 2017]. Disponible en:
http://www.mdpi.com/1420-3049/20/2/1860
28. Rodriguez C, Saavedra H. Determinación del efecto in vitro del extracto de las hojas
de Croton alnifolius L. “tunga” sobre Escherichia coli y Proteus mirabilis [tesis].
32
Universidad Nacional de Trujillo; 2011. [acceso en agosto del 2017]. Disponible en:
http://dspace.unitru.edu.pe/bitstream/handle/UNITRU/4644/Rodriguez%20Crespo
%20Carmen%20Lisseth.pdf?sequence=1&isAllowed=y
29. Marchese A, Arciola C, Barbieri R, Sanches A, Nabavi S, Tsetegho A, Nabavi, S.
(2017). Update on Monoterpenes as Antimicrobial Agents: A Particular Focus on p-
Cymene. Materials, 10(8), 1-15. DOI: 10.3390/ma10080947
30. Cordeiro de Souza R, Matiuzzi da Costa M, Baldisserotto B, Maria Heinzmann B,
A
Schmidt D, Otomar Caron B, Copatti C. (2017). Antimicrobial and synergistic
IC
activity of essential oils of Aloysia triphylla and Lippia alba against Aeromonas spp.
M
UI
Microbial Pathogenesis. 113.. 10.1016/j.micpath.2017.10.013.
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
33
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
34
ANEXO N° 1: Reconocimiento botánico del material
 Familia: Verbenaceae
 Nombre Científico: Lippia alba (Mill.) N.E. Br. ex Britton & P. Wilson
 Hábito: Suarbusto aromático de ca. 1.00 m de alto, flores rosadas.
 Procedencia: Jardín Botánico “Rosa Elena de los Ríos Martínez”
 Prov.: Trujillo Dpto.: La Libertad
 Hábitat: Suelo salitroso-arenoso.
 Altitud: 34 m.s.n.m.
CÓDIGO: 59148
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
35
ANEXO N° 2: Obtención del aceite de Lippia alba
Figura 1. Recolección Figura 2. Muestra de Figura 3. Lavado de la

de la especie de Lippia ejemplares de la especie de muestra.
A
alba. Lippia alba.
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
Figura 6. Secado de las

AC
Figura 4. Separación de Figura 5. Hojas separadas

hojas en estufa a 40 °C.
las hojas del tallo de la de la especie de Lippia
RM
especie de Lippia alba. alba.

FA
DE
CA
TE
IO
Figura 7. Hojas secas de Figura 8. Se pesó las hojas Figura 9. Se colocó la

BL
la especie de Lippia alba. secas de la especie de Lippia muestra en el embudo de

BI
alba. decantación.
Figura 10. Destilación de la Figura 11. Obtención Figura 12. Se colocó en

muestra por arrastre de vapor de del aceite esencial. frasco color ámbar y se
agua. almacenó a 4 °C.
36
ANEXO N° 3: Preparación del material de vidrio para el procedimiento

microbiológico
A
IC
M
UI
Figura 1. Esterilización del Figura 2. Lavado del
Q
material contaminado en material.
O
autoclave.
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
CA
Figura 3. Preparación del Figura 4. Esterilización y

material para su esterilización secado a 100 °C.
TE
y secado.
IO
BL
BI
Figura 5. Material listo para

su uso.
37
ANEXO N° 4: Procedimiento microbiológico - preparación de inóculos bacterianos

c
A
Figura 1. Cepas proporcionadas por el Figura 2. Calentando el agar Mueller-
IC
laboratorio de referencia regional en Hinton para el sembrado de las cepas
M
salud pública, del distrito de Trujillo, bacterianas.
UI
provincia de Trujillo, región la Libertad.
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
DE
Figura 3. Tubos con agar Figura 4. Se sembró y se colocaron en

Mueller-Hinton listos para el la incubadora por 24 horas a 37 °C.
CA
sembrado.
TE
IO
BL
BI
Figura 5. Cepas reactivadas. Figura 6. Estandarización del inoculo

equivalente al tubo N° 1 del
Nefelómetro de Mac Farland (3 x 108
UFC/mL).
38
ANEXO N° 5: Procedimiento microbiológico - método de difusión de Kirby Bauer

modificado
A
Figura 1. Después de calentar el agar, Figura 2. Se colocó 0.1 mL de la
IC
se vertió en las placas. suspensión bacteriana por extensión y
M
se hizo los pocillos.
UI
Q
ciprofloxacino
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
Polisorbato 80
DE
Figura 3. Se colocó 0.1 mL de las Figura 4. Halo de inhibición del blanco

concentraciones preparadas, más el y control.
CA
blanco y el control.
TE
Lippia alba al 5% Lippia alba al 2% Lippia alba al 10% Lippia alba al 2%

IO
BL
BI
Lippia alba al 8% Lippia alba al 10% Lippia alba al 8% Lippia alba al 5%
Figura 5. Halo de inhibición de las Figura 6. Halo de inhibición de las

diluciones de aceite esencial frente a diluciones de aceite esencial frente a
Escherichia coli. Staphylococcus aureus.
39
ANEXO N° 6: Procedimiento microbiológico – ensayos realizados
Figura 1. Ensayo para

determinar el CMI de las Figura 2. Tubos preparados se Figura 3. Se calentaron
concentraciones preparadas al colocaron en la incubadora, los tubos ligeramente
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13 %, más
A
observando que no se diluyó para un nuevo ensayo.
el blanco y control.
IC
uniformemente la muestra.
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
Figura 4. Se ensayó por duplicado Figura 5. Tubos después de 24 horas de

FA
las concentraciones preparadas, incubación a 37 °C, observando

más el blanco y control. crecimiento en todos, excepto control
DE
con E. coli.
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 6. Se pudo observar Figura 7. Comparación del

que a mayor concentración blanco y control, observando
hubo menos crecimiento crecimiento solo en el blanco.
bacteriano, por la claridad del
medio.
40
Figura 8. Aumento de concentraciones

para el nuevo ensayo con E. coli con Figura 9. Tubos antes de colocarle la
las concentraciones preparadas al 5, suspensión bacteriana, mostrando que a partir
10, 15, 20, 25 y 30 % del 15 %, el aceite genera turbidez en el medio.
A
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
Figura 10. Ensayo por triplicado con E. Figura 11. Ensayo por triplicado con E. coli
IA
coli después de 24 horas de después de 96 horas de incubación,

AC
incubación, observando sedimento observando sedimento y turbidez solo hasta

solo hasta la concentración de 20 %. la concentración de 20 %.
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
Figura 12. Ensayo por triplicado con S. Figura 13. Ensayo por triplicado con S.
BI
aureus con las concentraciones aureus después de 24 horas de

preparadas al 10, 15, 20, 25, 30 y 35 %, incubación, observando sedimento solo
más el blanco y control. hasta la concentración de 20 %.
observando sedimento solo hasta la

concentración de 20 %.
S. aureus S. aureus S. aureus

Figura 14. Sembrado del tubo Figura 15. Sembrado del tubo Figura 16. Sembrado del tubo
que contiene la dilución al 25 que contiene la dilución al 30 que contiene la dilución al 35
%, observando crecimiento. %, observando crecimiento. %, observando crecimiento.
41
ANEXO N° 7: Procedimiento microbiológico – Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI)
A
IC
Figura 1. Ensayo por triplicado con E. coli con
M
las concentraciones preparadas al 20, 25, 30, Figura 2. Se observa sedimento bacteriano a la
UI
35, 40 y 45 %, más el blanco y control, después concentración preparada de 20% (2 μL/mL en
Q
de 24 horas de incubación. el caldo) de E. coli, fue la más alta
O
concentración donde presento crecimiento
BI
bacteriano.
Y
IA
AC
RM
FA
DE
Figura 4. Se observa mayor cantidad

CA
de sedimento en el tubo con solo

Figura 3. Ensayo por triplicado con E. coli
TE
polisorbato 80 en E. coli.
después de 48 horas de incubación.
IO
BL
BI
Figura 5. Se observa sedimento en el Figura 6. No se observa sedimento en el

tubo a la concentración preparada de tubo a la concentración preparada de
20% (2 μL/mL en el caldo) en E. coli. 25% (2.5 μL/mL % en el caldo) en E.
coli.
42
Figura 8. Se observa sedimento bacteriano a la

Figura 7. Ensayo por triplicado con S. aureus con concentración preparada de 20% (2 μL/mL en el
las concentraciones preparadas al 20, 25, 30, 35, caldo) de S. aureus, fue la más alta concentración
40 y 45 %, más el blanco y control, después de 24 donde presento crecimiento bacteriano.
A
horas de incubación.
IC
M
observando sedimento solo hasta la
UI
concentración de 20 %.
Q
O
BI
Y
IA
Figura 10. Se observa mayor cantidad de sedimento

AC
en el tubo con solo polisorbato 80 en S. aureus.

RM
Figura 9. Ensayo por triplicado con S.

FA
aureus después de 48 horas de incubación.

DE
CA
TE
IO
BL
Figura 12. Se observa sedimento en el tubo a la

concentración preparada de 25% (2.5 μL/mL en el
BI
Figura 11. Se observa sedimento en el tubo a la caldo) en S. aureus.

concentración preparada de 20% (2 μL/mL en el
caldo) en S. aureus.
Figura 13. No se observa

sedimento en el tubo a la
concentración
preparada de 30% (3
μL/mL en el caldo) en S.
aureus.
43
ANEXO N° 8: Procedimiento microbiológico – Concentración Mínima Bactericida

(CMB)
A
Figura 1. Calentando el agar Mueller- Figura 2. Preparando el material para
IC
Hinton para el sembrado de las cepas el sembrado.
M
bacterianas.
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
Figura 3. Agregando la muestra de los Figura 4. Agregando el agar Mueller-

DE
tubos q no crecieron. Hinton y su posterior agitación para

el mezclado.
CA
TE
IO
BL
BI
Figura 5. Después de solidificar el Figura 6. No se observó crecimiento

agar, se lleva a incubación a 37° C x en la placa con la concentración
24 horas. preparada de 25% (2.5 μL/mL en el
caldo) en E. coli.
44
Figura 7. No se observó crecimiento en la Figura 8. No se observó crecimiento en la

placa con la concentración preparada de placa con la concentración preparada de
A
30% (3 μL/mL en el caldo) en E. coli. 35% (3.5 μL/mL en el caldo) en E. coli.
IC
M
UI
Q
O
BI
Y
IA
AC
RM
FA
Figura 9. Se observó crecimiento en la Figura 10. Se observó crecimiento en la

placa con la concentración preparada de placa con la concentración preparada de
DE
30% (3 μL/mL en el caldo) en S. aureus. 35% (3.5 μL/mL en el caldo) en S. aureus.

CA
TE
IO
BL
BI
Figura 11. Se observó crecimiento en la

placa con la concentración preparada de
40% (4 μL/mL en el caldo) en S. aureus.
45
ANEXO N° 9: Cálculos
Calculo de las concentraciones de aceite esencial en los tubos de ensayo
 30uL de aceite esencial al 20% en 3mL de caldo BHI
20mL de aceite esencial---------------100mL
200uL de aceite esencial--------------1000uL
x uL de aceite esencial--------------30uL
A
6 uL de aceite esencial (cantidad agregada al caldo BHI)
IC
M
6uL-------------3mL de caldo BHI
UI
Q
x uL-------------- 1mL de caldo BHI
O
BI
2 uL/mL de aceite esencial en el tubo de ensayo
Y
IA
AC
2.5 uL/mL de aceite esencial en el tubo de ensayo

RM

FA

DE

CA
TE

IO

BL
BI
46
Calculo de la cantidad máxima de UFC para la determinación de la CMB

(concentración mínima bactericida)
La CMB es la menor concentración capaz de destruir o matar el 99.9% de bacterias

del inoculo original.
Inoculo original = 3 x 108 UFC/mL
3 x 108 UFC-------------1000uL
x --------------6uL (cantidad agregada al caldo)
x = 18 x 105 UFC
A
IC
M
UI
18 x 105 UFC-----------------3mL de caldo
Q
O
BI
x---------------1mL de caldo (cantidad agregada a la placa)
Y
x = 6 x 105 UFC
IA
AC
6 x 105 UFC-----------100%
RM
x----------------0.1%
FA
x = 600 UFC (cantidad máxima de crecimiento para considerar la CMB)

DE
CA
Calculo de la desviación estándar de la concentración mínima inhibitoria (CMI) por

TE
acción antibacteriana “in vitro” del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia
IO
coli
BL
BI
∑ 𝑋 − 𝑋̅ 2
𝑆=√
𝑛−
X = 2.5, 2.5, 2.5

̅ = 2.5
𝑿
n=3
𝑆= .
El mismo resultado se obtuvo para las demás evaluaciones microbiológicas.
47
ANEXO N° 10: Valores obtenidos de la evaluación microbiológica
CUADRO N° 1: Concentración mínima inhibitoria (CMI) por acción antibacteriana

“in vitro” del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli
Concentración de Crecimiento de Concentración

aceite esencial Escherichia coli mínima inhibitoria
(μL/mL) R1 R2 R3 (CMI)
2 + + +
2.5 - - - 2.5 μL/mL
3 - - -
A
3.5 - - -
IC
4 - - -
M
4.5 - - -
UI
Leyenda: (+) con crecimiento; (-) sin crecimiento
Q
R1: resultado del primer ensayo
O
R2: resultado del segundo ensayo BI
Y
R3: resultado del tercer ensayo
IA
AC
RM
CUADRO N° 2: Concentración mínima inhibitoria (CMI) por acción antibacteriana

“in vitro” del aceite esencial de Lippia alba frente a Staphylococcus aureus
FA
DE
Concentración de Crecimiento de Concentración

CA
aceite esencial Staphylococcus aureus mínima inhibitoria

(μL/mL) R1 R2 R3 (CMI)
TE
2 + + +
2.5 + + +
IO
3 - - - 3 μL/mL
BL
3.5 - - -
BI
4 - - -
4.5 - - -
Leyenda: (+) con crecimiento; (-) sin crecimiento
R1: resultado del primer ensayo
R2: resultado del segundo ensayo
R3: resultado del tercer ensayo
48
CUADRO N° 3: Concentración mínima bactericida (CMB) por acción antibacteriana

“in vitro” del aceite esencial de Lippia alba frente a Escherichia coli
Concentración de UFC de Escherichia Concentración

aceite esencial coli mínima bactericida
(μL/mL) 𝑋̅ (CMB)
2.5 0 2.5 μL/mL
3 0
3.5 0
A
IC
CUADRO N° 4: Concentración mínima bactericida (CMB) por acción antibacteriana
M
“in vitro” del aceite esencial de Lippia alba frente a Staphylococcus aureus
UI
Q
O
Concentración de UFC de Staphylococcus Concentración
aceite esencial aureus BI mínima bactericida
Y
(μL/mL) 𝑋̅ (CMB)
IA
3 21 3 μL/mL
AC
3.5 17
4 12
RM
FA
DE
CA
TE
IO
BL
BI
49

Rodriguez Lopez Joseph Jeremy

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE:

BACHILLER EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA

AUTOR (es): RODRIGUEZ LOPEZ, Joseph Jeremy

SEGURA ALAYO, Alex David

ASESOR: Dr. QUISPE DÍAZ, Iván Miguel

Co-ASESOR: Dra. LUJÁN VELÁSQUEZ, Manuela Natividad

A nuestro Dios, por ser nuestra luz en este largo

camino, por permitirnos seguir adelante ante toda

adversidad, por ser nuestro guía en todos nuestros

logros y cuidarnos en todo momento.

todas nuestras metas.

A nuestros profesores, por haber compartido su

experiencia, entregarnos sus conocimientos y apoyo

durante nuestra formación profesional.

A nuestro Dios por darnos salud.

permitiéndonos fortalecernos como estudiantes.

apoyo desinteresado, paciencia, consejos y ayuda brindados. Gracias también a nuestra

casa de estudios, la Universidad Nacional de Trujillo, en especial a nuestra Facultad de

Farmacia y Bioquímica y a las instalaciones de la misma.

Señores miembros del Jurado Dictaminador:

Dado el cumplimiento a lo establecido por el reglamento de Grados y Títulos de la

Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo; sometemos a

Escherichia coli y Staphylococcus aureus”

Es propicia la oportunidad para evidenciar el más sincero reconocimiento a nuestra

impartidas han contribuido a nuestra carrera profesional.

presente trabajo de investigación científica.

Dr. Francisco Moisés Abanto Zamora

Dr. Iván Miguel Quispe Díaz

se extrajo el aceite esencial mediante el método de destilación por arrastre de vapor de

agua. Para la determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se utilizó el

método de macrodilución en caldo Brain Heart Infusion (BHI), posteriormente se agregó

la Concentración Mínima Bactericida (CMB) se utilizó el método de difusión de agar en

esencial de Lippia alba frente a Staphylococcus aureus de 3 uL/mL. Concluyendo que

Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

PRESENTACIÓN ................................................................................................ iii

INDICE ................................................................................................................. vii

II. MATERIAL Y MÉTODO ........................................................................ 16

III. RESULTADOS ........................................................................................ 23

IV. DISCUSIÓN ............................................................................................. 25

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 29

constituyen las bacterias. El resto de los organismos vivos unicelulares y pluricelulares

está formado por células eucariotas1,2,3.

ambientes secos y en presencia de fuentes de energía muy diluidas y diversas. Las

bacterias han sufrido cambios en la estructura y función para adaptarse a estas

Las bacterias se clasifican en dos grupos en función de la estructura de su pared celular,

por fuera del peptidoglicano una membrana rica en lipopolisacáridos. Algunas

facilitan su movilidad, y fimbrias (pili), que desarrollan varias funciones,

fundamentalmente de adherencia. En las bacterias, además del ácido

desoxirribonucleico (DNA) cromosómico (nucleoide) puede existir DNA extra

cromosómico formando plásmidos. Las bacterias suelen reproducirse mediante la

Algunas estructuras bacterianas, como el lipopolisacárido de la pared, el polisacárido

producción de anticuerpos cuando infectan al hombre1,2,3,4.

Los diferentes grupos bacterianos poseen diversas capacidades metabólicas siendo el

grupo de interés en medicina el que posee un metabolismo heterótrofo; es decir,

requiere sustratos orgánicos como fuente de energía y de carbono. Para el desarrollo

de su metabolismo algunas bacterias necesitan oxígeno (bacterias aerobias); para otras

posee capacidad patógena, causando las enfermedades infecciosas2.

un miembro de la familia Enterobacteriaceae, bacilos Gram negativos, anaeróbico

positivo y oxidasa-negativo. Escherichia coli son los más abundantes anaerobios

son habitantes normales no patógenas. El género Escherichia poseen unos factores de

virulencia especializados que se pueden clasificar en dos categorías generales: