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También llamada filtración por gel o cromatografía de permeación por gel, las moléculas
pequeñas penetran en los poros pequeños de la fase estacionaria, pero no las moléculas
grandes. Puesto que las moléculas pequeñas tiene que recorrer un volumen realmente
mayor, las moléculas grandes se eluyen primero (Tabla1). Ésta técnica se usa mucho en
bioquímica para purificar macromoléculas.
Las sales de masa molecular baja (o las moléculas pequeñas) se pueden eliminar de
disoluciones de moléculas grandes por filtración por gel. Ésta técnica, llamada desalado, es
útil para cambiar la composición del tampón de una disolución de macromoléculas.
TABLA 1
COLUMNA A
Las moléculas grandes no pueden penetrar en los poros de
la fase estacionaria. Se eluyen con un volumen de
disolvente igual al volumen de la fase móvil.
COLUMNA B
Las moléculas pequeñas que se pueden encontrar dentro
y fuera del gel, necesitan un volumen mayor para eluirlas.
V1 es el volumen total de la columna ocupada por el gel
mas el disolvente. V0 cuyo valor puede tomarse también
como VM, es el volumen de la fase móvil VR = V0 es el
volumen ocupado por el gel mas su fase líquida interna.
Fase estacionaria
Entre los geles utilizados en columnas abiertas de exclusión molecular, a escala preparativa,
se encuentra el Sephadex cuya estructura se muestra en la Figura 1,Sephadex, y el Bio-Gel
P, que es una poliacrilamida entrecruzada con N’N’- metilenbisacrilamida Figura 2.
FIGURA 1 FIGURA 2
TABLA 2
NOMBRE INTERVALO DE NOMBRE INTERVALO DE
FACCIONAMIENTO FACCIONAMIENTO
(MASA MOLECULAR) PARA (MASA MOLECULAR) PARA
PROTEÍNAS GLOBULARES PROTEÍNAS GLOBULARES
Sephadex G-10 a 700 Bio-Gel P-2 100-1800
Sephadex G-15 a 1500 Bio-Gel P-4 800-4000
Sephadex G-25 1000-5000 Bio-Gel P-6 1000-6000
Sephadex G-50 1500-30000 Bio-Gel P-10 1500-20000
Sephadex G-75 3000-80000 Bio-Gel P-30 2500-40000
Sephadex G-100 4000-150000 Bio-Gel P-60 3000-60000
Sephadex G-150 5000-300000 Bio-Gel P-100 5000-10000
Sephadex G-200 5000-600000 Bio-Gel P-150 15000-150000
Bio-Gel P-200 30000-200000
Bio-Gel P-300 60000-400000
En HPLC pueden utilizarse moléculas de poliestireno con tamaños de poro desde 5 nm hasta
centenares de nm. Las partículas de un diámetro de 5micrometros dan 8000 platos por
metro de longitud de columna. La sílice micro porosa de tamaño de poro controlado
permite 10000-16000 platos/metro TABLA 3. La sílice se recubre de una fase hidrófila que
minimiza la adsorción de solutos. Se puede usar una resina de poliéster hidroxilada de
tamaño de poro bien definido en el intervalo de Ph de 2 a12, mientras que las fases de sílice,
generalmente, no pueden usarse por encima de Ph 8. Las partículas con diferentes tamaños
de poro se pueden mezclar para dar un intervalo más amplio de separación de tamaños
moleculares.
TABLA 3
DESIGNACIÓN TAMAÑO DE INTERVALO DE MASA MOLECULAR
PORO (nm) PARA PROTEÍNAS GLOBULARES
G2000SW 13 500-60000
G3000SW 24 1000-300000
G4000SW 45 5000-1000000
G5000SW 100 >1500000
FASE MOVIL
Desventajas de la CEM:
Su rendimiento es muy sensible al empaque de la columna.
Puede haber interacciones no específicas entre la proteína y la resina, lo que disminuye la
resolución.
Baja resolución para mezclas complejas de proteínas.
La muestra debe ser sembrada en un volumen pequeño para obtener una resolución
adecuada. Esto puede ser problemático para proteínas que precipitan en altas
concentraciones.