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MICROBIOLOGIA 3.

Lezione del 14/03/18 – Prof.ssa De Grazia

Sbobinatore: Elena Bivona


Controsbobinatore: Vincenzo Lo Iacono

Riepilogo della lezione precedente


Ieri abbiamo iniziato ad introdurre il concetto di farmaci, di terapia terziaria e l’ambito di utilizzo della
terapia farmacologica. Abbiamo definito la differenza tra un antibiotico e un chemioterapico, tra un
antibiotico batteriostatico e battericida e abbiamo analizzato il meccanismo di azione dei farmaci, che
agiscono a livello di una via metabolica, andando a bloccare non tanto la struttura di per sé, ma la via
metabolica che porta alla sua produzione. Questo lo specifichiamo in quanto tale aspetto la distingue dal
meccanismo di azione di un disinfettante. I disinfettanti alterano la struttura preformata, ovvero la struttura
del microorganismo; il farmaco invece va a bloccarne la produzione, quindi interferisce su una via metabolica
(necessitiamo di un microorganismo attivo, che si replica, che si riproduce, che attua sintesi proteica).
La via metabolica che porta alla sintesi del peptidoglicano inizia a livello del citoplasma.
- la fosfomicina, analogo del fosfoenolpiruvato, impedisce la sintesi del NAG (N-acetil-glucosamina)
- la cicloserina impedisce la conversione della L-alanina in D-alanina
Attraversando la membrana plasmatica abbiamo visto altri farmaci, quali:
- bacitracina che impedisce la fosforilazione/defosforilazione del trasportatore, fondamentale per
trasportare i singoli mattoncini del peptidoglicano
- beta lattamici chiamati così per la presenza dell’anello beta lattamico

o Penicilline
Sono attive nei confronti dei gram positivi, ma non nei confronti dei gram negativi, perché non sono in grado
di attraversare efficacemente la membrana esterna di questi batteri, ma l’uomo ha modificato la loro
struttura per ampliarne lo spettro di azione, riuscendo a farle agire anche a livello dei gram negativi.

Meticillina: rientra tra le penicilline di ultima generazione e riesce ad agire a livello di batteri particolarmente
noti per la loro farmaco-resistenza, tra cui gli stafilococchi. Questi ultimi tendono ad avere beta lattamasi,
enzimi che danneggiano l’anello beta lattamico di questi farmaci, alterando la struttura del farmaco stesso. I
produttori di beta lattamasi, alterando la struttura del beta lattamico, lo rendono inefficace; quindi questi
sono farmaci capaci di agire anche su ceppi produttori di beta lattamasi.

Pseudomonas aeruginosa: è un bacillo gram negativo, responsabile di diverse infezioni nosocomiali, perché
in grado di resistere in condizioni avverse, come la presenza di saponi o l’acqua dei fiori. Tale bacillo dà
all’acqua stagnante la colorazione verdastra, in quanto produce dei pigmenti che inducono tale colorazione.

o Cefalosporine
Insieme alle penicilline rientrano nella categoria dei beta lattamici; tendenzialmente modificano la struttura
dell’anello rispetto alle penicilline, non avendo un anello diazolico, bensì diidrodiazinico. La struttura
dell’anello li rende naturalmente resistenti alle penicillinasi, beta lattamasi in grado di rompere l’anello beta
lattamico.
- Cefalosporine di prima generazione: attive sui gram positivi, ma anche a livello degli enterobatteri
(gram negativi)
- Cefalosporine di seconda generazione: sintetizzate nei confronti dei batteri gram negativi e resistenti
alle beta lattamasi di tali gram negativi
- Cefalosporine di terza generazione: attive su gram negativi con una MIC da 10 a 100 volte inferiore.
MIC: concentrazione minima inibente  concentrazione di farmaco in grado di agire sul batterio
senza avere effetto tossico a livello cellulare; quindi minore è la concentrazione del farmaco, minore
è la possibilità di danneggiare l’organismo

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- Cefalosporine di quarta generazione: possono attraversare efficientemente la membrana esterna di
tutti i gram negativi e hanno una maggiore resistenza alle beta lattamasi
- Cefalosporine di quinta generazione: ha l’obiettivo di raggiungere il MRSA

o Altri farmaci beta lattamici


Si affiancano alle penicilline e alle cefalosporine e agiscono bloccando l’azione delle beta lattamasi, in modo
particolare si utilizza molto l’acido clavulanico (es. augmentin), che agisce arrivando ad inibire l’azione delle
beta lattamasi. Utilizzando tali farmaci insieme alle penicilline e alle cefalosporine, non fanno altro che
inibire le beta lattamasi batteriche favorendo l’attività del farmaco beta lattamico.
Altri farmaci sono:
- monobattamici
- carbapenemici: ultimi farmaci utilizzati nell’ambito di questa categoria, tra cui troviamo imipenem e
meropenem ad ampio spettro (su Streptococchi, Stafilococchi e Gonococchi)

Farmaci che agiscono a livello della membrana batterica


A livello della membrana citoplasmatica, i farmaci possono avere due target: alcuni polieni agiscono
efficacemente a livello della membrana esterna dei gram negativi, mentre altri attraversano la parete e
agiscono sulla membrana citoplasmatica dei gram positivi. Il meccanismo di azione sembra simile a quello di
un disinfettante, in quanto non vanno a danneggiare una via metabolica di sintesi della membrana, ma
danneggiano la struttura, legando specificatamente la membrana cellulare dei batteri, distruggendone le
proprietà osmotiche vitali.
- polimixine: sono attive soprattutto a livello della membrana esterna dei batteri gram negativi
- daptomicine: sono attive a livello della membrana citoplasmatica dei batteri gram positivi
entrambe le molecole, sia nei gram negativi sia in quelli positivi, presentano ceppi multi-resistenti; in realtà è
così per tutti i farmaci.

Farmaci che agiscono all’interno del citoplasma del batterio


Siamo in grado di bloccare alcune vie metaboliche come la sintesi dell’acido nucleico (DNA e RNA).
 Partendo dalla sintesi del DNA, sappiamo che questa è una molecola dicatenaria, in grado di
srotolarsi nel corso della replicazione perché la DNA polimerasi possa sintetizzare dal singolo
filamento. I primi farmaci in grado di agire sulle girasi sono i chinoloni (acido nalidixico, per le
infezioni delle vie urinarie). I nuovi chinoloni prendono il nome di fluorochinoloni e la capacità dei
farmaci è quella di agire su siti differenti a livello dello stesso enzima.

La girasi o topoisomerasi è l’enzima che ha il ruolo di srotolare l’acido nucleico e presenta due siti (GyrA e
GyrB); mentre i farmaci di prima generazione (come l’acido nalidixico) agiscono solo a livello della GyrA, i
farmaci di seconda generazione agiscono a livello di due siti attivi dell’enzima. Il vantaggio di avere due
target è che, se basta una mutazione a livello di GyrA per diventare resistente o a livello di GyrB, la possibilità
di accumulare mutazioni è inferiore. Quindi farmaci di nuova generazione tendono ad agire a livello di più
target per ridurre il rischio che il batterio possa diventare resistente; in alcuni casi posso usare associazioni di

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farmaci, uno che agisce su GyrA, l’altro che agisce su GyrB, per avere la funzione di possedere farmaci che
agiscono su un doppio target. Agiscono su pseudomonas, sia sui gram positivi sia a livello dei micobatteri.
Sono farmaci che vengono utilizzati nell’ambito di infezioni a livello sistemico, cioè per contrastare batteri
che entrano in circolo.

 Nell’ambito, invece, di farmaci che agiscono sulla sintesi del RNA abbiamo la rifampicina, che ha
come bersaglio la subunità beta della RNA polimerasi e agisce sia su gram negativi sia su quelli
positivi; è anche questo un farmaco attivo sul micobatterio della tubercolosi. I frammenti sono attivi
sia nei confronti dei Gram+ e Gram-, sebbene esistano dei Gram- (come gli enterobatteri) che hanno
una resistenza intrinseca, cioè una resistenza naturale nel sintetizzare l’RNA polimerasi che è meno
appetibile al farmaco, di conseguenza l’affinità tra l’enzima e il farmaco è ridotta e non hanno un
meccanismo d’azione efficiente.

La fidaxomicina agisce a livello di un batterio anaerobio; ha attività battericida selettiva per


il patogeno Clostridium difficile, mentre altera solo minimamente l'equilibrio delle altre numerose specie
di batteri che costituiscono la normale flora intestinale. Il patogeno C. difficile dà colite pseudomembranosa
in pazienti che fanno terapia farmacologica contro altri batteri, creando un dis-microbismo a livello
intestinale. Facendo terapia antibiotica ad ampio spettro, soprattutto in soggetti ospedalizzati, si ha
aumento di questi batteri causando tali sintomatologie come la colite.

Una categoria di farmaci che sono attivi non solo su tutti i batteri, ma anche su tutti i microrganismi (ad
eccezione dei virus), sono il Metronidazolo e il Nitronidazolo. Questi farmaci sono molto attivi a livello dei
batteri anaerobi, in quanto vengono attivati grazie ad un processo di riduzione del gruppo nitrico che
avviene in condizione di anaerobiosi, quindi essi agiscono bene su batteri aerobi e non su anaerobi, da qui
l’importanza di tali farmaci nell’agire su organismi anaerobi obbligati. È importante notare che il
Metronidazolo e il Nitronidazolo agiscono sia sulla sintesi dell’RNA che del DNA, andando a danneggiare
l’acido nucleico già sintetizzato agiscono danneggiando qualsiasi acido nucleico che trovano dentro la cellula,
sia bloccandone la sintesi che danneggiando l’acido nucleico già sintetizzato.

Farmaci che agiscono sulla sintesi delle proteine


Nel caso di farmaci attivi sulla sintesi delle proteine, distinguiamo i farmaci attivi sulla subunità 30S e quelli
attivi sulla subunità 50S del ribosoma.
 Tetracicline: una volta che il ribosoma si alloca nell’RNA messaggero la tripletta viene letta dal tRNA
che porterà l’amminoacido corrispondente, una volta legata la subunità maggiore, la tetraciclina si
lega dopo il tRNA, impendendo che il tRNA successivo possa portare l’amminoacido successivo al
livello della catena della proteina nascente. Il risultato sarà la formazione di una proteina tronca, che
non sarà in grado di potersi allungare nell’ambito dell’aggiunta dell’amminoacido successivo. Questo
legame con la subunità 50S del ribosoma sembrerebbe un legame di tipo reversibile, in grado di
rompersi; è attivo su tutti i batteri però ha un limite, ovvero non può essere utilizzato né nelle donne
in gravidanza né nei bambini piccoli, avendo una spiccata affinità per le ossa e per i denti, andando a
danneggiarne lo smalto.
Tra le tetracicline di nuova generazione si ha la tigeciclina, utilizzata per le infezioni addominali
polimicrobiche, sia nei confronti di gram + sia di gram -; tali farmaci sono attivi anche contro i batteri
privi di parete, come nel caso della clamidia.

 Aminoglicosidi: impediscono la sintesi proteica. In tal caso avremo il legame del tRNA, a cui dovrebbe
seguire la subunità maggiore, mentre il legame dell’aminoglicoside al tRNA impedisce
l’incappucciamento, quindi che il ribosoma si possa strutturale. Va a legare il tRNA alla subunità
minore del ribosoma e impedisce la formazione del complesso della traduzione. Quindi, la loro
azione è legare in maniera irreversibile la subunità 30S del ribosoma. Tra questi farmaci abbiamo:
Gentamicina, Streptomicina, Kanamicina e Neomicina e abbiamo come limite il fatto che questi non

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siano attivi nei batteri anaerobi, perché per potere essere attivi hanno bisogno della fosforilazione
ossidativa, svolta da batteri che attuano la respirazione. Anche nell’ambito degli aminoglicosidi
abbiamo farmaci di ultima generazione e possiamo notare come questi abbiano la capacità di legare
sia la subunità 30S sia la 50S. L’obiettivo è sempre lo stesso: avere più target di azione ne riduce il
rischio di accumulo di farmaco resistenza.

 Macrolidi: ultima categoria di farmaci attivi sulla sintesi proteica e che legano esclusivamente la
subunità 50S, è rappresentata dai Macrolidi, tra cui ricordiamo l’eritromicina, l’azitromicina, la
claritromicina. Il legame del farmaco in questo caso si verifica a livello delle due molecole di tRNA e a
livello della subunità 50S, impedendo che l’intero ribosoma possa scorrere sul messaggero; tale
legame quindi va a bloccare il ribosoma a livello di due molecole di tRNA che sono unite a loro volta.
Il messaggero impedisce lo scivolamento del ribosoma sull’mRNA. Si tratta di un legame irreversibile
che blocca l’allungamento della sintesi proteica. Questi farmaci sono batteriostatici e sono attivi su
batteri intracellulari, ma anche su alcuni protozoi, riuscendone a bloccare la sintesi proteica
nonostante il protozoo abbia un ribosoma di diversa natura. Viene usato per infezioni da
streptococco e stafilococchi multi-resistenti.

 Cloramfenicolo: altro farmaco che agisce a livello della sintesi proteica, come target d’azione ha la
subunità 50S e ha meccanismo di azione che agisce a livello della peptidiltransferasi. Obiettivo
comune alle altri classi di farmaci è quello di bloccare la formazione della proteina nascente.
Farmaco di ultima generazione è oxazolidiloni (linezolid) e anche in questo caso il meccanismo di
azione è arrivare a bloccare a livello di due subunità differenti del ribosoma.

Farmaci che intervengono sulla sintesi dell’acido folico


L’acido folico è una sostanza che l’uomo ingerisce con la diete e che il microorganismo sintetizza in
autonomia; in modo particolare si hanno diverse tappe che portano alla sintesi dell’acido folico e alla fine
delle basi azotate per la sintesi degli acidi nucleici.

Abbiamo due categorie di farmaci:


- Sulfamidici: agiscono andando ad inibire l’acido p-aminobenzoico
- Trimethoprim: agiscono andando ad inibire l’attività dell’enzima diidrofolato reduttasi
I due farmaci non possono essere somministrati insieme, in quanto l’azione di uno andrebbe ad interferire
con il meccanismo di azione dell’altro. Essi in generale agiscono andando ad impedire la via di sintesi
dell’acido folico e hanno azione batteriostatica; gli enterococchi sono naturalmente resistenti e non possono
essere utilizzati dove sono presenti cellule necrotiche, perché dalla cellula necrotica viene sicuramente
liberato acido nucleico e di conseguenza la presenza di basi azotate, ottenute dalla cellula morta, andrebbe
ad ovviare la problematica data dalla inibizione della sintesi dell’acido folico: il batterio andrebbe a reperire
dalla cellula lesa le basi di cui ha bisogno per sintetizzare l’acido nucleico.

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I micobatteri sono batteri molto particolari per la loro parete, che comporta gran parte di quello che è il
problema patogenetico di questi batteri. Essi sono acido-alcol-resistenti, li possiamo colorare con la
colorazione di Ziehl-Neelsen, hanno una parete di tipo idrorepellente, per cui crescono lentamente e hanno
necessità di un terreno ricco in lipidi e se abbiamo una sostanza tossica anche questa entra lentamente nel
corpo batterico. Se non abbiamo una terapia di attacco molto efficiente, il batterio che entra in contatto con
poche concentrazioni di farmaco, può facilmente diventarne resistente. Allora contro i micobatteri si agisce
con:
- terapie di associazione con due o più farmaci
- la terapia non dura 5 giorni, come per gli altri farmaci, bensì mesi
Per non danneggiare la flora microbica, si utilizzano farmaci che sono specifici nei confronti dei micobatteri.
La via metabolica tipica dei micobatteri è quella che porta alla sintesi degli acidi micolici. Quindi, oltre alla
rifampicina, che agisce sulla sintesi dell’RNA e la Streptomicina e i Chinoloni che agiscono sulla sintesi del
DNA e la sintesi proteica, l’Isoniazide, l’Etianamide, l’Etanbutolo e il Pirazinamide sono dei farmaci specifici
per i micobatteri, in quanto essi inibiscono la sintesi degli acidi micolici, degli arabinogalattani e
interferiscono nella sintesi del NAD, quindi sono dei farmaci specifici per micobatteri perché interferiscono
sulla sintesi della parete di questa tipologia di batteri. Bisogna sottolineare che l’isoniazide viene considerato
come un pro farmaco, perché esso viene attivato all’interno della cellula stessa. Inoltre bisogna ricordare che
le terapie di associazione non vengono effettuate solo per 5 giorni, come siamo soliti pensare per una
terapia antibiotica, ma per periodi di tempo più lunghi che coinvolgono addirittura mesi.

FARMACO-RESISTENZA
Ad ogni modo, i batteri sono in grado di diventare resistenti o addirittura possedere come caratteristica
intrinseca la resistenza stessa. Quindi si opera una distinzione tra quelle che sono le resistenze naturali (es. i
micoplasmi sono resistenti a tutto ciò che agisce sulla parete; alcuni farmaci non agiscono mai su organismi
anaerobi; il beta lattamato rende resistente l’organismo al farmaco) e quelle acquisite.

 Naturali: cioè resistenze che il batterio aveva prima che venissero scoperti i farmaci e che sono
intrise nella sua natura, ovvero sono delle resistenze presenti in “era pre-antibiotica” e che sono
quindi attaccabili da parte di un farmaco. Tendenzialmente riguardano una specie e coinvolgono
tutti i ceppi appartenenti a quella specie. Ad esempio quando abbiamo parlato delle Polimixine,
abbiamo visto che alcuni Gram-, tra cui ad esempio Proteus, Providencia e Morganella, che sono
naturalmente resistenti alla Polimixine e alle Colistine, sviluppano una resistenza che è dovuta al
fatto che i lipopolisaccaridi di questi batteri legano poco efficientemente la polimixina, impedendo
che venga portata a livello della membrana citoplasmatica che è il sito in cui la polimixina agisce per
andarla a danneggiare. Abbiamo visto anche come nel caso degli aminoglicosidi fosse necessaria una
fosforilazione a livello della membrana e quindi come questi farmaci siano inattivi a livello dei batteri
anaerobi. Abbiamo visto inoltre come le penicilline di prima generazione erano naturalmente
inattive nei confronti dei Gram- . Si tratta dunque di resistenze naturali, correlate semplicemente al
fatto che il farmaco non sia efficiente nei confronti di una determinata categoria di batteri.

 Acquisite: quelle in cui il batterio avrebbe il target per essere debellato dal farmaco, ma ha acquisito
un meccanismo che lo rende resistente. Sono selezioni clonali di ceppi che, sotto pressione selettiva
del farmaco stesso, acquisiscono mutazioni che indurranno nel batterio la resistenza. Per questo
motivo, quando si dà una terapia farmacologica, si somministra con una determinata posologia.
Questo è importante in quanto un farmaco deve agire ad una determinata concentrazione e per un
determinato periodo di tempo; se non sfruttiamo la giusta posologia, il batterio si troverà nella
condizione di potersi continuare a replicare in presenza del farmaco, essendo così indotto a
selezionare mutazioni che lo porteranno a sopravvivere in condizioni sfavorevoli. Ciò è proprozionale
all’utilizzo dei farmaci  più utilizziamo dei farmaci, più la probabilità che si accumulino ceppi
resistenti aumenta.

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I geni di resistenza si possono acquisire per meccanismi:
- cromosomali: si modifica il cromosoma batterico;
- extra-cromosomale: es. plasmidi, che rappresentano uno dei meccanismi del trasferimento
dell’informazione genetica, ma anche i batteriofagi, che possono inserire dentro il batterio il
materiale genetico, e i trasposoni, ovvero materiale genetico in grado di trasferirsi da una porzione
all’altra del genoma, in alcuni casi anche replicandosi, lasciando più sedi in grado di portare il gene
della resistenza. A livello dei trasposoni si possono portare i geni della farmaco resistenza e questi
possono integrarsi nel genoma microbico replicandosi e trasferendosi in due sedi (miglioramento
della performance farmacologica).

Meccanismi che portano il batterio a diventare farmaco-resistente


1. Riduzione della permeabilità cellulare: il farmaco per agire deve avere la giusta concentrazione,
quindi se il farmaco ha una concentrazione minore, esso risulterà inefficace
- Pompe di efflusso: il batterio produce delle porine che non permettono l’accumulo del
farmaco all’interno della cellula. Questo meccanismo impedirà l’arrivo della giusta
concentrazione di farmaco dove il farmaco deve agire.
- Riduzione di canali di entrata: il farmaco non entra per una riduzione della permeabilità di
membrana.
Streptococchi, Enterococchi ed Anaerobi sono resistenti agli Aminoglicosidi in quanto privi dei sistemi di
trasporto attivo.

2. Modifica del sito di attacco del farmaco:


- mutazioni genetiche
- ad opera di enzimi batterici che possono alterare il target: si vanno a modificare le PBP
(penicillum binding proteins), sito di attacco delle penicilline, quindi se abbiamo batteri che
ne riducono l’affinità, la penicillina non legherà efficientemente l’enzima, che continuerà a
svolgere la sua funzione fisiologica. Determinati ceppi hanno PBP con bassa affinità per il
farmaco, che ne impediscono un legame efficiente. In altri casi abbiamo, ad esempio, un
RNA di ceppi resistenti all’eritromicina che mediante un meccanismo di metilazione, riduce
l’affinità dei farmaci attivi per la sintesi proteica, per esempio l’eritromicina. Possiamo avere
un target modificato come la GyrA, che a causa di mutazioni su cui subisce l’azione dell’acido
nalidixico (che agisce solo a livello della GyrA), piuttosto che liposaccaridi poco affini a livello
delle polimixine. Quindi in tal caso si ha una scarsa affinità tra il target e il farmaco. Un altro
tipo di mutazione che può ridurre l’affinità fra il farmaco è il target si ha nel caso di ceppi
resistenti alla vancomicina; essa creava un cappuccio che andava a legare il dimero D-
alanina-D-alanina, quindi impedendo la transpeptidazione; se si verifica una sostituzione del
dimero D-alanina-D-alanina in D-alanina-D-lattato, avendo una morfologia chimica
completamente differente, la vancomicina non riuscirà a legarsi a livello del tetrapeptide,
quindi in tal caso vi è una scarsa affinità per modifica della natura chimica del target.

Nel caso di modifiche al farmaco stesso, un esempio è dato dai ceppi batterici che producono le Beta
lattamasi ad ampio spettro, un enzima in grado di idrolizzare l’anello Beta lattamico di tutti i farmaci Beta
lattamici, andando a modificarne la natura chimica. Alcuni farmaci come l’acido clavulanico sono dei pro-
farmaci che vengono attivati da un enzima di questo tipo, che purtroppo oggi si ritrovano nella maggior
parte dei ceppi batterici.
ESBL: beta lattamasi ad ampio spettro  distruggono tutte le tipologie di anelli beta lattamici esistenti e
sono attive su penicilline e cefalosporine.

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Oltre alla possibilità di rompere l’anello beta lattamico, il batterio può alterare la struttura del farmaco
attraverso il legame con gruppi fosforici oppure esterificarli. Quindi si ha la produzione di enzimi inattivanti
per cui il farmaco è reso inefficace tramite queste modifiche strutturali che il batterio ha operato su di esso.
Es. negli aminoglicosidi la presenza di glicosiltransferasi, che aggiungono gruppi fosfato e amminici a livello
della struttura del farmaco, ne modifica l’efficacia.

Nel caso di farmaci che agiscono a livello della sintesi dell’acido folico (sulfamidici e trimetropim) o si ha
produzione di enzimi con ridotta affinità nei confronti del farmaco oppure un utilizzo di vie metaboliche
alternative.

Come possiamo in laboratorio a capire che l’infezione in atto nel paziente è ad opera di un batterio resistente
ad una determinata terapia?
Al giorno d’oggi innanzitutto sappiamo come si coltivano i batteri, ovvero come identificare la presenza di un
batterio presente in un paziente infetto. Possiamo isolarlo in terreni di coltura, valutandone la capacità
replicativa.
- Normalmente all’inizio della terapia antibiotica la carica microbica del paziente sarà alta e in seguito,
se andiamo a monitorare lo stesso paziente nell’arco del tempo, dovrebbe presentarsi un crollo della
conta cellulare. Questo ci andrebbe a dimostrare che il batterio non si sta sicuramente replicando.
- Se invece il batterio acquisisce la resistenza al farmaco la conta microbica rimane comunque elevata,
quindi la terapia farmacologica non funziona in modo corretto.
L’obiettivo del microbiologo è quello di identificare l’agente patogeno, quindi fare diagnosi eziologica per
comprendere quale sia il batterio responsabile di quel determinato quadro patologico. Se sappiamo che
alcuni ceppi sono naturalmente resistenti, mentre altri no, è comunque vero che qualsiasi ceppo può
acquisire la resistenza, per cui non è detto che il ceppo sia sensibile. Un’altra cosa fondamentale è quindi
andare a valutare la sensibilità al farmaco. Quindi il microbiologo deve:
- isolare il ceppo
- valutarne la sensibilità nei confronti della vasta gamma di farmaci a disposizione

Valutazione in laboratorio della farmaco-resistenza


 valutazione qualitativa: diamo un esito in positivo o negativo
 valutazione quantitativa: ci dice anche la concentrazione di farmaco a cui il batterio è sensibile o
resistente. Tale metodo prende il nome di metodo delle diluizioni.

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Oltre al metodo delle diluizioni abbiamo il metodo della diffusione in agar, che comprende la metodica di
Kirby-Bauer (qualitativa) e l’E-test (quantitativa).

METODO DELLA DILUIZIONE


Posso mettere nelle provette diluizioni scalari del farmaco, prendo una sospensione batterica, partendo da
una coltura pura. Ho isolato il ceppo batterico e metto le diluizioni scalari del farmaco a contatto con una
concentrazione nota di batteri. Se c’è crescita il terreno diventa torbido, mentre se non si ha la crescita il
terreno risulta limpido. Per cui incubo a 37° per una notte e il giorno dopo analizzo le singole diluizioni,
notando che dove il farmaco agisce il terreno resta
limpido, mentre dove esso non agisce il terreno
diventerà torbido, poiché il batterio si sarà replicato.
Vado a vedere qual è la più alta diluizione del
farmaco in cui il batterio non si è replicato (più alta
diluizione = minore concentrazione di farmaco). In
tal modo calcolo la MIC, la minima concentrazione
inibente, minima concentrazione di farmaco che
impedisce la crescita microbica.

Dall’immagine risulta che nel mio esperimento la


MIC = 2 microgrammi/mL (ultima diluizioni del
farmaco in cui non si ha crescita microbica).

La MIC viene definita come la minima concentrazione in grado di inibire il 50% della crescita microbica.
La MBC è invece la minima concentrazione battericida, la minima concentrazione del farmaco capace di
uccidere il 100% dei batteri.

Questo metodo è un metodo quantitativo.

METODO KIRBY-BAUER O DIFFUSIONE IN AGAR


L’agar è un terreno solido, in cui il batterio non risulta in grado di muoversi; la cellula si replica per scissione
binaria, formando moltissime cellula che andranno a costituire una colonia. Se io il batterio lo spatolo su una
piastra, ne creo una patina uniforme; sulla piastra andiamo ad allocare una serie di dischetti di carta bibula
che contengono la minima concentrazione inibente di diverse molecole. Quindi abbiamo la piastra e sopra di
essa si pone la semina dei batteri, sopra la quale vengono messi dischetti di carta bibula, ognuno con
molecole diverse. A distanza di 24 h dopo l’incubazione a 37°, il batterio, dove non è stato interferito, si
replica, dove è stato interferito dall’azione del farmaco non si replica più. Avremo allora una patina uniforme
data dai batteri e intorno ai dischetti si nota un alone di inibizione, che si crea dove il ceppo è sensibile al
farmaco (il batterio non si replicherà più).

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Il test ha tale nome perché le molecole di farmaco sono in grado di diffondere nel terreno agarizzato. Sotto
la piastra c’è un righello, perché ogni farmaco è in grado di diffondere in modo più o meno efficientemente
nell’agar e per tale motivo per ogni singola molecola di farmaco utilizzata si conosce il diametro che il
batterio deve dare per dire se è resistente o sensibile nei confronti del farmaco.
Possiamo avere diversi casi per quanto riguarda il diametro, ovvero possiamo avere diametri ben più grandi
per cui sicuramente il ceppo è sensibile, possiamo avere ceppi che crescono perfettamente intorno al
dischetto che in tal caso saranno resistenti, oppure possiamo avere dei casi in cui il diametro è intermedio,
allora può dipendere dall’esito dell’antibiogramma, ovvero verso quanti ceppi è sensibile il farmaco. Può
essere utile anche utilizzare associazioni nel momento in cui il ceppo ha diametro intermedio. La presenza di
colonie all’interno dell’alone può indicare la presenza di:
- varianti resistenti
- colture miste

Esempio di un esame

R = ceppo resistente
S = ceppo sensibile

METODO DI DIFFUSIONE IN AGAR O E-


TEST
Metodo quantitativo, al contrario del
Kirby-Bauer. Viene utilizzato nel
momento in cui vogliamo definire la MIC
per il singolo ceppo che abbiamo isolato;
in tal caso però, il farmaco non è inserito
alla stessa concentrazione in ogni
dischetto, ma si ha una striscia di carta
bibula con un gradiente del farmaco
(dalla concentrazione più bassa a quella
più alta). Anche in tal caso si prende la

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piastra, si semina il ceppo isolato e allochiamo sopra la striscia con il farmaco. A seguito di una incubazione
di 24 h noto che si ha un punto lungo la striscia in cui si inizia a formare l’alone di inibizione; chiaramente da
questo punto in poi la concentrazione è maggiore e da questo punto in poi l’alone si andrà ad allargare
sempre di più.
La MIC sarà quella in cui inizia la formazione dell’alone di inibizione. In tal caso sarà 1,5.

Qualora io metta più molecole di farmaco posso fare più test insieme e ne vado a valutare l’efficacia.

Tra l’isolamento e l’antibiogramma passano 24 e 48 h di incubazione.

C’è stato un miglioramento tecnologico che ha portato alla strumentazione automatizzata, dove non si
utilizza il metodo di diffusione in agar, ma sono sistemi fluidi in cui concentrazioni di farmaco sono messe a
contatto con una piccola sospensione batterica e il sistema di rivelazione è uno spettrofotometro. Dove il
batterio cresce si nota la torbidità, mentre non la si evidenzia dove il batterio non cresce. Possiamo avere
sistemi automatizzati per l’identificazione rapida del microorganismo e contemporaneamente la
determinazione della sensibilità. Per cui all’interno di questo sistema si ha una cartuccia con tanti micro-
pozzetti, in ognuno dei quali viene fatto un test: possiamo avere test delle ossidasi, delle catalasi, delle
fermentazioni e tutti questi dati ci permettono la distinzione di una specie dall’altra.

Questo è un esempio del risultato con le varie resistenze nei confronti del farmaco.

Le ESBL hanno le beta lattamasi ad ampio spettro, che tendenzialmente sono un problema nei confronti di
tutti i farmaci beta lattamici. I test in vitro hanno dimostrato che si hanno risultati sensibili in alcuni casi, ma
in realtà, quando il farmaco viene somministrato al paziente, quest’ultimo continua a manifestare la
patologia. Sembrerebbe esserci un’incongruenza tra il risultato fenotipico (il comportamento del batterio in
vitro) e il comportamento del batterio nell’uomo. Siccome il fallimento terapeutico diventava frequente,
cosa si deve fare per rendere le cefalosporine attive? Possiamo, oltre ad un test di screening (Kirby-Bauer),
cercare di un test di conferma per valutare se il ceppo che abbiamo isolato è beta lattamasico sicuro o meno.
Si attua quindi un test crociato, dove si testa da una parte la molecola di farmaco e dall’altra la molecola di
farmaco con l’aggiunta dell’acido clavulanico. Quest’ultimo inibisce la beta lattamasi.

- se il ceppo si comporta allo stesso modo sia in presenza del solo farmaco sia in presenza del farmaco
e dell’acido clavulanico  ceppo sensibile, non cresce in presenza del farmaco
- se ho un significativo incremento dell’alone di inibizione dove metto l’inibitore di beta lattamasi
potrei pensare che il ceppo è resistente, ma se metto l’inibitore la sensibilità aumenta in maniera
significativa  il ceppo è produttore di beta lattamasi e il farmaco è inefficace

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Quindi in presenza di beta lattamasi, soltanto andandola ad inibire riesco ad avere la presenza di una
sensibilità. Quanto deve cambiare per essere significativo? Ci deve essere una riduzione di almeno 3
logaritmi della MIC per poter dire che il test è positivo (differenza significativa in presenza o meno dell’acido
clavulanico.

Quello che andremo a vedere è l’esito, cioè l’andamento dell’infezione del paziente.

Oggi giorno si parla tanto di farmaco-resistenza in varie situazioni:

- Quando non c’è infezione: gli antibiotici vengono spesso utilizzati quando non è presente
un’infezione cioè quando, nonostante il microrganismo sia presente, questo non si replica ad alte
dosi quindi l’utilizzo dell’antibiotico non è strettamente necessario.
- Quando vengono somministrati a pazienti venuti a contatto con dei microrganismi che potrebbero
da soli, con il loro sistema immunitario, rispondere alla replicazione microbica.
- Quando vengono usati farmaci con terapie empiriche non corrette e quando si vede che questa non
è corretta, non viene modificata e ciò induce i batteri ad una pressione selettiva nei confronti del
farmaco (e si continua dopo che l’infezione si è ridotta.
- Quando si sottodosano i farmaci o si somministrano nei tempi sbagliati. Ad esempio quando il
paziente inizia la terapia farmacologica, comincia a stare meglio e sospende la terapia. È importante
tenere conto della durata della terapia poiché in un primo momento avremo la cessazione dei
sintomi, ma rimarranno ancora dei ceppi che devono essere eliminati. Se non tutti i ceppi sono stati
eliminati, a bassa pressione farmacologica, possono accumulare determinate resistenze.
- Quando uso un antibiotico che non arriva alla sede dell’infezione. Utilizzando un farmaco che viene
alterato a livello renale o che non agisce a livello delle vie urinarie, la sua utilizzazione risulta inutile
per un’infezione a livello delle vie urinarie, in quanto non verrebbe assorbito in quel distretto.
- Quando si utilizza un batteriostatico quando servirebbe un battericida, non un farmaco che rallenta,
ma un farmaco che deve uccidere.

Anche l’alimentazione rappresenta un problema, perché cioè che ingeriamo è imbottito di farmaci; se
pensiamo alle carni o alle verdure, in quanto esistono microorganismi che infettano sia animali sia l’uomo, il
problema risulta evidente. Se abbiamo un allevamento di animali in batteria si facilita la trasmissione;
l’influenza dei polli non si replica solo nelle vie respiratorie, ma anche nell’intestino. Il pollo elimina
l’influenza sia tramite respirazione sia tramite le feci, che risultano secche e quindi si ha un’enorme
concentrazione virale all’interno di un allevamento chiuso. Per questo motivo si utilizzano molti antibiotici
per prevenire tale problema.

N.B: nella terapia del raffreddore, chiamato rinovirus, essendo un virus, non potrà essere utilizzato
l’antibiotico.

INFEZIONI NOSOCOMIALI

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Esse sono infezioni contratte in ambito ospedaliero, il cui periodo di incubazione non preceda il ricovero. Ciò
significa che l’insorgenza del sintomo è dovuta al fatto che il paziente sia stato sottoposto ad una partica in
ambito ospedaliero. L’infezione nosocomiale insorge durante il ricovero ospedaliero oppure dopo 48 h dal
ricovero, e per definirla tale, il paziente non deve essere in incubazione prima del ricovero stesso. Bisogna
tenere conto del periodo di incubazione per definire un’infezione di tipo nosocomiale. Essa quindi avviene:
- dopo 48h o più dal ricovero
- fino a 48h dopo la dimissione
Interessa soprattutto i pazienti ricoverati, ma può anche interessare il personale sanitario, che vive gran
parte del suo tempo in ambito ospedaliero.

Infezioni più frequenti che si verificano:


- infezioni dell’apparato urinario i giorni di mantenimento del catetere vescicale sono direttamente
proporzionali al rischio di infezione: maggiore sono ii giorni con il catetere, maggiore sarà il rischio di
infezione batterica;
- infezioni delle ferite chirurgiche soprattutto a livello addominale, in quanto a tale livello si ha una
flora microbica particolarmente ricca
- infezioni delle basse vie respiratorie in particolare nei pazienti intubati
- infezioni nei cateteri venosi
- infezioni a livello cutaneo
la strumentazione è in gran parte dei casi un veicolo di trasmissione.

Differenza tra veicolo e vettore:


- vettore di trasmissione  è l’insetto ed è vivo
- veicolo di trasmissione  generalmente è materiale inanimato, come il cibo o l’acqua, ma anche i
fomiti e gli oggetti chirurgici
in gran parte delle infezioni nosocomiali entra in gioco il corpo iatrogeno che è entrato in contatto con il
nostro corpo.

Organismi coinvolti in infezioni nosocomiali


- Stafiloccocco Aureus principalmente si riscontra o a livello cutaneo o a livello di ferite chirurgiche; è
un batterio alofilo e predilige i follicoli piliferi; si trova a livello delle vie respiratorie anche
dell’operatore sanitario come portatore sano, di conseguenza egli potrebbe contaminare con le
mani un qualsiasi oggetto che entra in contatto con il paziente, motivo per cui il lavaggio delle mani
è la prima pratica essenziale che impedisce la trasmissione di infezioni nosocomiali.
- Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella anche queste a livello di ferite chirurgiche.
- Clostridium Difficile, che normalmente si trova a livello intestinale e che, però, essendo anaerobio si
replica a bassi tassi, non causando problemi, se non quando un soggetto è sottoposto a terapie
antibiotiche ad ampio spettro che alterano la flora batterica intestinale residente. È causa di diarree
in pazienti sottoposti a terapie farmacologiche.

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- Miceti in alcuni casi, in quanto quasi tutti farmaci analizzati fin ora sono antibatterici; sebbene i
miceti siano presenti in concentrazioni minori, nella terapia antibiotica ad ampio spettro, essi
sopravvivono e i batteri no, causando dismicrobismo e infezioni da miceti (es. candida albicans).
- Gram – sono i principali implicati nelle infezioni delle vie urinarie.

Principali vie di trasmissione


- contatto diretto tra il paziente e il personale ospedaliero
- contatto paziente-paziente
- contatto indiretto con i fomiti (maniglie delle porte) e con tutto il materiale inanimato
- contatto indiretto tramite il sistema di ventilazione dell’ospedale (sorveglianze ospedaliere, come le
sale operatorie con filtri HEPA, filtri sottili che devono impedire la trasmissione batterica)

Reparti ad alto rischio


- centro ustioni: la cute è una barriera aspecifica, mentre la cute lesa rappresenta una via di accesso; il
centro ustionati dà disponibilità di grandi accessi a livello della cute lesa
- centro di emodialisi: i pazienti innanzitutto hanno un catetere a permanenza, che rappresenta in sé
un rischio
- rianimazione: il paziente non è collaborante e la quantità di strumentazione utilizzata è
particolarmente elevata
- terapia intensiva
- reparti oncologici: il paziente viene immunodepresso e ha un rischio maggiore di contrarre infezioni

Come tenere sotto controllo la trasmissione di infezioni?


1. Lavaggio delle mani frequentemente e accuratamente, soprattutto quando si passa a visitare un
nuovo paziente, anche se si utilizzano i guanti
2. Mettere in atto pratiche di disinfezione e sterilizzazione
3. Prestare massima attenzione ai materiali contaminanti, anche nell’ambito dello smaltimento di
materiali contaminati
4. Usare stanze di isolamento per i pazienti altamente infettivi. A questo proposito è bene che
conosciate le stanze a pressione negativa, dove c’è un controllo del flusso dell’aria, per cui si
utilizzano per pazienti che presentano infezioni a livello dell’apparato respiratorio. In questo modo si
evita che il microrganismo esca fuori dalla stanza e vada nei reparti, diffondendosi.
5. Lavorare in strutture adatte sterili costruite appositamente, ad esempio, dove le maniglie siano
apribili con la mano sinistra o il rubinetto del lavabo sia apribile a pedale, dato che le maniglie sono
le superfici più sporche e contaminate.

TERMINOLOGIA DI BASE:
Sterilizzazione = eliminazione di tutti i microrganismi, comprese le spore. Una superficie sterile non deve
presentare alcuna forma microbica.
Disinfezione = riduzione della carica microbica. In alcuni testi si intende come l’eliminazione dei batteri
patogeni, ma così non è. Infatti, è una pratica aspecifica che, mirando alla riduzione della carica microbica,
impedisce ai fini infettivi che la malattia si diffonda.
Lavaggio = prerequisito di sterilizzazione e disinfezione. È la rimozione del pulviscolo e delle sostanze
organiche o dei residui chimici ad opera di detergenti.
Antisepsi = eliminazione dei microrganismi patogeni mediante pratiche di disinfezione a livello topico,
ovvero di cute e tessuti integri (antisettico del cavo orale = collutorio).

Pratiche di sterilizzazione

 Sistema dell’autoclave

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L’autoclave come meccanismo di sterilizzazione sfrutta il vapore sotto pressione; il vapore acqueo ha il
vantaggio di essere altamente trasmissibile, ovvero il vapore è un ottimo conduttore di calore, più dell’aria.
Allora posso usare due metodi di sterilizzazione al calore:
- calore secco: non è altro che la stufa; abbiamo dei forni che arrivano ad alte temperature e possiamo
inserire all’interno ferri chirurgici per lunghi periodi di tempo al fine di ottenere una denaturazione,
grazie alle elevate temperature, delle proteine e l’uccisione del microorganismo
- calore umido: il vantaggio del vapore sottopressione è innanzitutto il poter inserire materiale
plastico (es. pipette, provette) all’interno dell’autoclave.

Utilizziamo l’autoclave anche per sterilizzare i materiali di coltura batteriologici. Alle alte temperature
avremo terreno sterile per la seminazione del materiale biologico.

CARATTERISTICHE dell’autoclave
- efficacia ottima
- impiego ampio
- raggiunge temperature maggiori di 100°C

L’autoclave raggiunge 121 C° alla pressione di 1 atm e il tempo di esposizione è di 15 minuti. Quindi, come
vedete i tempi si riducono rispetto alla stufa, grazie alle alte pressioni, raggiunte prima grazie al fatto che la
tenuta del coperchio è stagna e grazie al fatto che il vapore è un conduttore termico migliore. Inoltre, un
altro vantaggio è che in autoclave si possono sterilizzare anche materiali plastici, terreni agarizzati e tutto ciò
che resiste al vapore. Per capire se un materiale è stato autoclavato si segna con un pezzetto di scotch da
autoclave che ha la caratteristica di virare di colore quando sottoposto al calore.

Il materiale sterilizzato in ospedale ha del nastro adesivo attaccato con delle strisce di colore blu o nero. Si
definisce “nastro adesivo da autoclave”. Prima di inserire il materiale chirurgico nell’autoclave, poniamo il
nastro adesivo (tutto trasparente) sugli oggetti che vogliamo inserire; una volta che il materiale è stato
sterilizzato avremo la presenza delle strisce blu o nere sul nastro adesivo, a conferma del fatto che il

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materiale chirurgico è stato sterilizzato. La presenza del colore sul nastro adesivo è data dal raggiungimento
delle alte temperature a livello dell’autoclave.

 Stufa
Il vantaggio della stufa è che si possono inserire le polveri;
se devo sterilizzare la polvere non posso metterla in
autoclave in quanto si ri-idraterebbe, ovvero cambierebbe
la sua struttura, ma posso sterilizzarla nella stufa dove si
mantiene secca.

 Sterilizzazione mediante radiazioni


Ci sono due tipi di radiazioni:
- ionizzanti  con cui viene sterilizzato tutto il
materiale monouso, come i cateteri, le provette, le
siringhe, i bicchierini per le urine. Si sfruttano delle
camere dove si ha materiale sigillato che viene
bombardato dalle radiazioni ionizzanti, che avendo
una grandissima lunghezza d’onda, staccano
l’elettrone e vanno ad alterare qualsiasi struttura
vitale esistente all’interno di questi materiali.
Mediante attraversamento della materia provocano quindi rimozione di elettroni e formazione di
radicali liberi. Hanno efficacia ottima, costo elevato, ma non se si fanno grandi volumi. Le radiazioni
ionizzanti sono altamente in grado di attraversare la materia, sono in grado quindi di sterilizzare
anche materiale accatastato.
- ultraviolette  i raggi UV nelle sale operatorie sterilizzano le superfici. I raggi UV inducono la
formazione di dimeri di timina a livello dell’acido nucleico, denaturando la molecola di acido nucleico
(azione che danneggia qualsiasi microorganismo). Hanno un limite: non ha potere penetrante, per
cui sterilizzano solamente le superfici, per cui ciò che deve essere sterilizzato con le radiazioni
ultraviolette deve essere “vuoto”. Hanno efficacia ottima, ma solo se le superfici sono esposte; viene
utilizzato anche per la potabilizzazione delle acque: l’acqua viene fatta passare attraverso
piccolissimi capillari che sono circondati di raggi UV per garantirne la sterilizzazione. In sala
operatoria sono associate ai filtri HEPA (metodo della filtrazione).

Filtrazione con la filtrazione si sfrutta un filtro che, in base alla sua porosità, al diametro del poro, consente il
passaggio di determinati microrganismi e non di altri. Ad oggi esistono filtri che impediscono il passaggio in
soluzione anche dei virus che per eccellenza erano i microrganismi non filtrabili. Ovviamente, utilizzando
filtri a così bassa porosità, è fondamentale imprimere una pressione alla soluzione da filtrare in modo tale
che essa fluisca più rapidamente. La filtrazione è utile per sterilizzare terreni di coltura per le linee cellulari o
per la crescita di colonie, che se sterilizzati al calore modificherebbero le proprietà organolettiche dei
nutrienti in essi contenuti. Alcuni sistemi di filtrazione (filtri HEPA) si utilizzano per sterilizzare l’aria delle sale
operatorie, che agiscono con una efficienza del 99,99%.

Pratiche chimiche di disinfezione


- I metalli pesanti agiscono perché hanno elevata affinità con i gruppi -SH delle proteine, quindi
argento proteinato e mercurio cromo sono disinfettanti che si utilizzano perché denaturano le
proteine.
- La formaldeide e la glutaraldeide sono addirittura degli sterilizzanti, che in alcuni casi si utilizzano in
forma gassosa per la sterilizzazione degli endoscopi. Essi vanno ad alchilare gruppi -SH e amminici.
Nell’ambito dei disinfettanti chimici se guardiamo l’etichetta ci dice un sacco di cose, come la concentrazione
che dovrebbe usarsi e soprattutto dove utilizzarsi.

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- Agenti ossidanti come l’acqua ossigenata: H2O2 agisce perché il batterio produce catalasi che
scindono l’acqua ossigenata e liberano i radicali dell’ossigeno; si utilizza solitamente soltanto sulla
cute lesa, quando si ha una ferita (sembra che “frigge” perché le cellule del nostro corpo la attivano).
Agiscono alcuni anche sulla cute integra. Alogeni e ipoclorito (candeggina) agiscono come agenti
ossidanti, ma anche le tinture di iodio
- Alcoli e fenoli. Questi ultimi si utilizzano generalmente nelle stalle per la loro disinfezione

Bisogna conoscere del disinfettante:


- il principio attivo
- l’efficacia
- se è tossico per l’operatore o per l’ambiente (smaltimento corretto)
- uso specifico del prodotto esaminato (dove lo si può usare)
- concentrazione adeguata
- tempo di contatto

Graduatoria della capacità del disinfettante di agire su diversi microorganismi


1) Prioni (CJD, BSE) = essi non sono microrganismi ma proteine, che, variando la loro struttura
tridimensionale, possono risultare patogene se trasmesse.
2) Spore (Bacillus e C. difficile) = ovviamente si tratta delle spore dei batteri e non dei miceti. Esse
sono delle vere e proprie forme di resistenza, che, grazie al loro metabolismo quasi inerte e alle loro
strutture di protezione aggiuntive (esosporio, andosporio e cortex), riescono a mantenersi vitali in
condizioni estreme alle quali qualsiasi batterio morirebbe, come ad esempio essiccamento e
radiazioni ionizzanti. Ovviamente, non avendo un metabolismo attivo è impossibile eliminarle
utilizzando farmaci che agiscano a livello di qualche tappa o intermedio metabolico. Un batterio
sporigeno si mantiene infettante anche per centinaia di anni. Per questo motivo alcune pratiche non
possono definirsi di sterilizzazione, ma di disinfezione, proprio perché incapaci di eliminare le spore.
3) Micobatteri (M. tuberculosis) = sono molto resistenti grazie alla parete che li costituisce, essendo
questa caratterizzata da acidi micolici, arabinogalattani, mannani, che la rendono idrorepellente in
primis alle sostanze antibiotiche, e funzionale alla vita ambientale.
4) Virus piccoli non inviluppati (Poliovirus) = i virus piccoli riescono a sfuggire prima alla risposta
immune, inoltre, essendo nudi resistono meglio al pH acido e all’essiccamento. Si possono, dunque,
trovare anche nelle acque sottoposte a clorazione.
5) Tutte le forme microbiche

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