Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Reportado por: Maria Guadalupe Angon Garcia

Materia: Métodos de Análisis

Practica III: separación e identificación de aminoácidos de jugos

de fruta por cromatografía bidimensional en capa fina

Grupo: 4IM1

Sección: 1

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 Fundamentos:

La cromatografía en capa fina o unidimensional consiste en la separación

mezclas de moléculas, el cual, se realiza permitiendo que la mezcla de moléculas
que se desea separar (muestra) interaccione con un medio de soporte (fase
estacionaria)y un segundo medio que se encarga de eludir . La muestra a analizar
se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o aluminio que
previamente ha sido recubierta de una fina capa de absorbente (fase
estacionaria). La lámina se coloca en
una cámara cerrada la cual contiene uno
o varios disolventes mezclados
(eluyente o fase móvil). La mezcla de
solventes asciende por capilaridad a
través de absorbente, la muestra se va
separando en sus componentes, debido
a que la fase móvil desplaza a los
componentes de acuerdo a la polaridad
a la afinidad que tenga la muestra con la
fase móvil o estacionaria .Los solutos
más polares quedaran retenidos en la
fase estacionaria y los no polares se
eluiran con mayor facilidad.
Imagen 1.0: Desarrollo de una cromatografía
unidimensional

La separacion de compuestos por cromatografia en capa fina (unidimensional) es

util cuando la mezcla tiene pocos componentes, sin
embargo las muestras prolemas tienes varios
componentes los cuales es dificil de separar ya
que una mancha no solo puede contener un
componente si no mas . Debido a que en el
cromatograma unidimensional no se lleva acabo
una buena separacion de los componentes
(parecidos fretes de disolucion), se propone
efectuar un cromatograma en dos dimensiones
para obtener una mejor separacion de estos.
a cromatografía bidimensional se refiere al
proceso cromatográfico que hace que los
componentes migren primero
en una dirección y luego en otra perpendicular a
ella; las dos eluciones se llevan a cabo con
Imagen 1.2: Ejemplo de un desarrollo eluyentes diferentes.
cromatografico Bidimensional

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 El Rf sirve como comparación de la
distancia que recorrió unas muestras, en
otras palabras es la distancia recorrida
por el soluto y por el eluyente desde el
origen de la placa. El valor del Rf
depende delas condiciones en las
cuales se corre la muestra y para cada
analito es unico (absorbente, eluyente,
temperatura , Etc) Imagen 1.3: Esta imagen muestra la forma de calcular del Rf

Objetivos:
Separar los aminoácidos presentes en el jugo de frutos por cromatografía
bidimensional en capa fina
Identificar los aminoácidos separados por comparación de sus valores Rf,
con los de las soluciones tipo aminoácidos.
Comparar el grado de la resolución de la cromatografía bidimensional, con
el de la unidimensional

Desarrollo experimental

placa I:Cromatografia
unidimensional, se
obtener el jugo de la colocaron 10
fruta:jitomate . se prepararo 4 placas aminoacidos estandar y
de silica de 10x10 cm. una de analito
centrifugar a 2000rpm por
10 min. fase movil:cloroformo-
metanol-
amoniaco17%(2:2:1)

placa II: Cromatografia Placas III: cromatografia

unidimensional, se bidimensional|
colocaron 10 aminoacidos en este cromatograma se
estandar y una de analito colocaron 1μl de las 10
fase movil:butanol-accido soluciones tipo
acetico-agua(3:1:1) estandares de
aminoacidos
.
neutralizar los desarrollar
cromatrogramasdespues cromatograma I,III y IV
determinar la aplicacion de con la primera fase movil
las muestras con vapores Desarrollar los
de amoniaco durante 15a cromatogramas II,III y IV
30 segundos. con la segunda fase movil
placa
IV:cromatogproblema.
se colocaron 3μl de
solucion problema
revelado por aspersion
:Se rociaron con
ninhidrina 0.2%en etanol
al 96% ,Despues calentar
con la secadora hasta la
aparicion de las manchas

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 Resultados:

Imagen 2.0:cromatograma 1 con fase móvil Imagen 2.1:cromatograma 2 con fase móvil
cloroformo-metanol-amoniaco butanol-ácido acético –agua

Imagen 2.2: Cromatograma III bidimensional tipo Imagen 2.3: Cromatograma IV bidimensional
estándar problema(jugo de jitomate)

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Tabla 1: cromatogramas unidimensionales

Aminoácido 1° fase móvil 2° fase móvil

Frente del Frente del Rf Frente del Frente del Rf
soluto solvente soluto solvente
Arginina 1.9 7.2 0.2638 0.9 7.5 0.12
Lisina 2.2 7.2 0.3055 0.7 7.5 0.0945
Prolina 4.5 7.2 0.625 1.9 7.5 0.2533
Glicina 5.25 7.2 0.7291 2.1 7.4 0.2885
Acido glutámico 6.2 7.2 0.8611 2.5 7.4 0.33

Histidina 6.3 7.2 0.875 0.8 7.4 0.1081

Treonina 6.5 7.2
Metionina 6.8 7.2 0.944 4 7.5 0.5405
Tirosina 6.8 7.2 0.944 4 7.5 0.5921
fenilalanina 7.1 7.2 0.9861 4.5 7.5 0.6

Tabla 1.2: cromatogramas Bidimensionales tipo desarrollado en las 2 fases

móviles

NUMERO 1° fase móvil 2° fase móvil AMINOACIDO

DE CORRESPONDIENTE
MANCHA
Frente Frente Rf Frente Frente Rf
del del del del
soluto solvente soluto solvente
1 2.1 7.2 0.2916 1.1 7.4 0.1486 Histidina
2 2.7 7.2 0.375 0.8 7.1 0.1126
3 4.8 7.2 0.666 2 7.4 0.2702 prolina
4 5.3 7.2 0.7361 2.2 7.1 0.3098 Glicina
5 6 7.2 0.833 4.2 7.2 0.5833 treo

6 6 7.2 0.8472 2.5 7.2 0.3472 Ácido Glutámico

7 6.2 7.1 0.873 4.9 7.1 0.6901
8 6.3 7.3 0.8630 3.9 7.1 0.5492 Metionina
9 6.4 7.1 0.9014 1.5 7.1 0.2112 Metionina
10 6.7 7.3 0.9178 4.6 7.2 0.6388 Fenilalanina

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Tabla 1.3: cromatogramas Bidimensionales tipo desarrollado en las 2 fases
móviles

NUMERO 1° fase móvil 2° fase móvil AMINOACIDO

DE CORRESPONDIENTE
MANCHA
Frente Frente Rf Frente Frente Rf
del del del del
soluto solvente soluto solvente
1 2.3 7.2 0.3194 0.9 7.3 0.1224 arginina
2 4 7 0.5714 2.6 7.3 0.3605 No identificado
3 4.4 7.10 0.6197 2.3 7.3 0.3129 prolina
4 4.5 7 0.64 3.1 7.3 0.4286 No identificado
5 4.9 7 0.7 2 7.3 0.2740 Glicina

6 5.7 7.1 0.8028 2.4 7.2 0.3403 Ácido Glutámico

7 5.8 7 0.8285 1.65 7.2 0.2292 No identificado
8 6.1 7 0.8714 1.9 7.2 0.2639 histidina
9 6.6 7 0.9428 3.8 7.2 0.5278 Metionina
10 6.6 7. 0.9166 4.6 7.2 0.6389 Fenilalanina

Tabla 1.4: cromatogramas Bidimensionales para jugo de jitomate desarrollado en

las 2 fases móviles

NUMERO 1° fase 2° fase móvil AMINOACIDO CORRESPONDIENTE

DE móvil
MANCHA Rf Rf

1 0.3194 0.1224 arginina

2 0.5714 0.3605 No identificado

3 0.6197 0.3129 Prolina

4 0.64 0.4286 No identificado

5 0.7 0.2740 Glicina

6 0.8028 0.3403 Ácido Glutámico

7 0.8285 0.2292 No identificado

8 0.8714 0.2639 histidina

9 0.9428 0.5278 Metionina

10 0.9166 0.6389 Fenilalanina

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Cuestionario

1. Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo de jitomate y

compare con sus resultados y concluya.
El jugo de jitomate contiene todos los aminoácidos en diferentes concentraciones
debido a que forman proteínas:
La cantidad de aminoácidos corresponden a 100g de zumo de tomate.
Aminoácido Cantidad Aminoácidos Cantidad
Ácido aspártico 84 mg. Leucina 21 mg.
Ácido glutámico 225 mg. Lisina 19 mg.
Alanina 17 mg. Metionina 4 mg.
Arginina 12 mg. Prolina 12 mg.
Cistina 3 mg. Serina 18 mg.
Fenilalanina 16 mg. Tirosina 8 mg.
Glicina 12 mg. Treonina 16 mg.
Hidroxiprolina 0 mg. Triptofano 3 mg.
Histidina 9 mg. Valina 16 mg.
Isoleucina 16 mg.

2. Escriba la reacción completa y con nombre, de la ninhidrina con un

aminoácido
Es una reacción
característica para
grupos amino libres que
se lleva a cabo a pH
alcalino.
La aparición de un color
azul o violeta indica la
presencia de grupos
aminos libre.

3. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles?

Si, si es posible ya que en una cromatografía bidimensional las soluciones se

desplazarán de acuerdo a las polaridad del medio.

4. Indique posibles fuentes de error de esta técnica :

 Contaminación de Muestra o de placa.
 No tener un buen eluyente
 Analitos con similares Rf.

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Discusiones:
La cromatografía unidimensional es una técnica analítica rápida y muy sencilla
para determinar la cantidad de analito que hay en una muestra la desventaja de
esta técnica es cuando hay varios analito en la muestra, los que hace difícil
observar el desplazamiento de cada analito ya que unos son muy cercanos que se
puede llegar a pensar como si fuera solo un analito (obsérvese en la imagen 2.0 y
2.1).
Debido a esta razón se emplea la cromatografía bidimensional para obtener una
mejor separación de cada analito que contiene la muestra, En este caso el
cromatograma problema se obtuvieron 11 aminoácidos (imagen 2.3),
El jugo de tomate es un alimento rico en aminoácidos, contiene los 20
aminoácidos, pero en diferentes concentraciones debido a las proteínas que
contiene esta fruta.Solo se identificaron 7 aminoácidos en el cromatograma
bidimensional para jugo de tomate, esto se debe a que solo se ocuparon 10
aminoácidos estándares, lo que no permitió la identificación de los otros
aminoácidos, ya que no se contó con los demás Rf para comparar los e
identificarlos.
Un aminoácido Que es fácil de identificar en el cromatograma al revelar con la
ninhidrina es la prolina, la cual al no tener enlace amino libre no reacción lo cual le
confiere una coloración amarilla y no violeta como los otros aminoácidos.
En la tabla 1.3 se puede observar que algunos aminoácidos no se identificaron
debido a que los Rf obtenidos en cada fase no se parecían a los Rf de los
aminoácidos estándares en los cromatogramas unidimensionales.
Una de las desvenas de la cromatografía bidimensional es que es muy lenta.

Conclusiones:
 La cromatografía unidimensional sirve para separar muestras con pocos
analito
 La cromatografía bidimensional sirve para separar en identificar muestras
que contienes varios analito.
 Se identificaron 7 aminoácidos por la comparación de los Rf de los
aminoácidos tipo.
 La concentración para la determinación de aminoácidos por cromatografía
en capa fina es muy importante, ya que la intensidad de color depende de
esta.
Bibliografía:

Gutiérrez Venegas Gloria.(2015),Bioquímica experimental,(en línea),

Pag:51-54,disponible
enhttp://www.odonto.unam.mx/pdfs/bioquimica_experimentalparte4_defipart
e1.pdf
Abbott D Y. Andrews R. S,”Introducción a la cromatografía”. 3ra edición,
Madrid, 1999.

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