Extracción, aislamiento y caracterización de compuestos bioactivos

a partir de extractos de plantas

S Sasidharan , 1 Y Chen , 1 D Saravanan , 2 K M Sundram , 3 y L Yoga Latha 1

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Abstracto
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Introducción
Los productos naturales, como el extracto de plantas, ya sea como compuestos puros o
como extractos estandarizados, brindan oportunidades ilimitadas para nuevos
descubrimientos de medicamentos debido a la disponibilidad inigualable de diversidad
química (Cos et al., 2006). Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), más del
80% de la población mundial depende de la medicina tradicional para sus necesidades de
atención médica primaria. El uso de hierbas medicinales en Asia representa una larga
historia de interacciones humanas con el medio ambiente. Las plantas usadas para la
medicina tradicional contienen una amplia gama de sustancias que pueden usarse para tratar
enfermedades crónicas y enfermedades infecciosas ( Duraipandiyan et al., 2006) Debido al
desarrollo de efectos adversos y resistencia microbiana a las drogas sintetizadas
químicamente, los hombres recurrieron a la etnofarmacognosia. Encontraron literalmente
miles de fitoquímicos de plantas como alternativas seguras y ampliamente efectivas con
menos efecto adverso. Se informaron muchas actividades biológicas beneficiosas tales
como actividad anticancerígena, antimicrobiana, antioxidante, antidiarreica, analgésica y
cicatrizante. En muchos casos, las personas reclaman el buen beneficio de ciertos productos
naturales o herbales. Sin embargo, los ensayos clínicos son necesarios para demostrar la
efectividad de un compuesto bioactivo para verificar este reclamo tradicional. Ensayos
clínicos dirigidos a la comprensión de la farmacocinética, biodisponibilidad, eficacia, la
seguridad y las interacciones medicamentosas de los compuestos bioactivos recientemente
desarrollados y sus formulaciones (extractos) requieren una evaluación cuidadosa. Los
ensayos clínicos se planifican cuidadosamente para salvaguardar la salud de los
participantes y para responder preguntas de investigación específicas mediante la
evaluación de los efectos secundarios inmediatos y a largo plazo y sus resultados se miden
antes de que el medicamento se aplique ampliamente a los pacientes.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), existen casi 20,000 plantas medicinales
en 91 países, incluyendo 12 países con mega biodiversidad. Los primeros pasos para
utilizar el compuesto biológicamente activo de los recursos vegetales son la extracción, el
examen farmacológico, el aislamiento y la caracterización del compuesto bioactivo, la
evaluación toxicológica y la evaluación clínica. En la Figura 1 se puede encontrar un breve
resumen de los enfoques generales en la extracción, el aislamiento y la caracterización del
compuesto bioactivo del extracto de plantas . Este documento proporciona detalles sobre la
extracción, aislamiento y caracterización del compuesto bioactivo del extracto de plantas
con un ensayo de cribado fitoquímico común, técnicas cromatográficas, como HPLC, y
HPLC / MS y espectrometría de masas de Fourier Transform (FTMS).

Figura 1
Un breve resumen de los enfoques generales en la extracción, aislamiento y caracterización del
compuesto bioactivo del extracto de plantas

Extracción
La extracción es el primer paso crucial en el análisis de plantas medicinales, porque es
necesario extraer los componentes químicos deseados de los materiales vegetales para una
mayor separación y caracterización. La operación básica incluía pasos, como prelavado,
secado de materiales vegetales o liofilización, molienda para obtener una muestra
homogénea y, a menudo, mejorar la cinética de la extracción analítica y también aumentar
el contacto de la superficie de la muestra con el sistema disolvente. Deben tomarse las
medidas adecuadas para asegurar que los componentes activos potenciales no se pierdan,
distorsionen o destruyan durante la preparación del extracto de las muestras de la planta. Si
la planta fue seleccionada sobre la base de los usos tradicionales ( Fabricant y Farnsworth,
2001)), entonces es necesario preparar el extracto tal como lo describe el curandero
tradicional para imitar lo más posible la droga tradicional "a base de hierbas". La selección
del sistema de disolvente depende en gran medida de la naturaleza específica del
compuesto bioactivo al que se apunta. Diferentes sistemas de solventes están disponibles
para extraer el compuesto bioactivo de productos naturales. La extracción de compuestos
hidrófilos utiliza disolventes polares tales como metanol, etanol o acetato de etilo. Para la
extracción de más compuestos lipófilos, se usan diclorometano o una mezcla de
diclorometano / metanol en una relación de 1: 1. En algunos casos, la extracción con
hexano se usa para eliminar la clorofila (Cos et al., 2006).
Como los compuestos diana pueden ser no polares a polos y térmicamente lábiles, se debe
considerar la idoneidad de los métodos de extracción. Diversos métodos, tales como
sonificación, calentamiento bajo reflujo, extracción soxhlet y otros se usan comúnmente
(Farmacopea de los Estados Unidos y Formulario Nacional, 2002; Farmacopea de la
República Popular de China, 2000; The Japanese Pharmacopeia, 2001) para la extracción
de muestras de plantas. Además, los extractos de plantas también se preparan por
maceración o percolación de plantas verdes frescas o material vegetal en polvo secado en
agua y / o sistemas de disolventes orgánicos. Un breve resumen de las condiciones
experimentales para los diversos métodos de extracción se muestra en la Tabla 1 .
tabla 1
Un breve resumen de las condiciones experimentales para varios métodos de extracción
para material vegetal

Extracción Soxhlet Sonificación Maceración

Solventes comunes Metanol, etanol o Metanol, etanol o Metanol, etanol o una mezcla de

usados una mezcla de una mezcla de alcohol y agua

alcohol y agua alcohol y agua

Temperatura (° C) Depende del solvente Puede ser calentado Temperatura ambiente

usado

Presión aplicada No aplica No aplica No aplica

Tiempo requerido 3-18 h 1 hora 3-4 días

Volumen de 150-200 50-100 Dependiendo del tamaño de la

solvente requerido muestra

(ml)
 Extracción Soxhlet Sonificación Maceración

Referencia Zygmunt y Zygmunt y Phrompittayarat et al.,

Namiesnik, Namiesnik, 2007 ; Sasidharan et al.,
2003 ;Huie, 2002 2003 ;Huie, 2002 2008 ; Cunha et al., 2004 ; Woisky et
al., 1998

Las otras técnicas de extracción modernas incluyen la microextracción en fase sólida, la

extracción de fluido supercrítico, la extracción de líquido presurizado, la extracción asistida
por microondas, la extracción en fase sólida y las técnicas mediadas por tensioactivos, que
poseen ciertas ventajas. Estas son la reducción en el consumo de solventes orgánicos y en la
degradación de la muestra, la eliminación de la limpieza adicional de la muestra y los pasos
de concentración antes del análisis cromatográfico, la mejora en la eficiencia de extracción,
la selectividad y / cinética de la extracción. La facilidad de automatización para estas
técnicas también favorece su uso para la extracción de materiales vegetales ( Huie, 2002 ).

Identificación y caracterización
Debido al hecho de que los extractos de plantas generalmente ocurren como una
combinación de varios tipos de compuestos bioactivos o fitoquímicos con diferentes
polaridades, su separación sigue siendo un gran desafío para el proceso de identificación y
caracterización de compuestos bioactivos. Es una práctica común en el aislamiento de estos
compuestos bioactivos que se utilicen varias técnicas de separación diferentes, tales como
TLC, cromatografía en columna, cromatografía ultrarrápida, cromatografía Sephadex y
HPLC, para obtener compuestos puros. Los compuestos puros se usan luego para la
determinación de la estructura y la actividad biológica. Además de eso, técnicas no
cromatográficas tales como inmunoensayo, que usan anticuerpos monoclonales (MAbs),
ensayo de cribado fitoquímico, espectroscopía infrarroja de transformada de Fourier
(FTIR),
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Técnicas cromatográficas

Cromatografía en capa fina (TLC) y métodos Bio-autográficos

TLC es un procedimiento simple, rápido y de bajo costo que le da al investigador una
respuesta rápida sobre la cantidad de componentes en una mezcla. La TLC también se usa
para sustentar la identidad de un compuesto en una mezcla cuando el Rf de un compuesto se
compara con el Rf de un compuesto conocido. Las pruebas adicionales implican la
pulverización de reactivos de selección fitoquímicos, que causan cambios de color de
acuerdo con los fitoquímicos existentes en un extracto de plantas; o mirando la placa bajo
la luz ultravioleta. Esto también se ha usado para la confirmación de la pureza y la
identidad de compuestos aislados.
La bioautoría es una técnica útil para determinar el compuesto bioactivo con actividad
antimicrobiana del extracto de la planta. Los métodos bioautográficos de TLC combinan la
separación cromatográfica y la determinación de la actividad in situ facilitando la
localización y el aislamiento dirigido a un objetivo de los constituyentes activos en una
mezcla. Tradicionalmente, la técnica bioautográfica ha utilizado la inhibición del
crecimiento de microorganismos para detectar componentes antimicrobianos de extractos
cromatografiados en una capa de TLC. Esta metodología ha sido considerada como el
ensayo más eficaz para la detección de compuestos antimicrobianos ( Shahverdi,
2007).) Bio-autografía localiza la actividad antimicrobiana en un cromatograma utilizando
tres enfoques: (i) bio-autografía directa, donde el microorganismo crece directamente en la
placa cromatográfica de capa delgada (TLC), (ii) bio-autografía de contacto, donde el
antimicrobiano los compuestos se transfieren desde la placa de TLC a una placa de agar
inoculada por contacto directo y (iii) bio-autopsia de agar, donde se aplica un medio de agar
sembrado directamente sobre la placa de TLC ( Hamburger y Cordell, 1987 ; Rahalison et
al., 1991 ) Las zonas de inhibición producidas en las placas de TLC mediante una de las
técnicas bioautográficas anteriores se usarán para visualizar la posición del compuesto
bioactivo con actividad antimicrobiana en la huella dactilar de TLC con referencia a
los valores de Rf (Homans y Fuchs, 1970 ). Se prepararon placas de TLC preparativa con
un espesor de 1 mm usando las mismas fases estacionarias y móviles que antes, con el
objetivo de aislar los componentes bioactivos que exhibían la actividad antimicrobiana
contra la cepa de prueba. Estas áreas se rasparon de las placas y la sustancia se eluyó de la
sílice con etanol o metanol. Las muestras eluidas se purificaron adicionalmente usando el
método de cromatografía preparativa anterior. Finalmente, los componentes fueron
identificados por HPLC, LCMS y GCMS. Aunque tiene una alta sensibilidad, su
aplicabilidad se limita a los microorganismos que crecen fácilmente en las placas de
TLC. Otros problemas son la necesidad de una eliminación completa de disolventes
volátiles de baja volatilidad, como n-BuOH, ácido trifluoroacético y amoníaco y la
transferencia de los compuestos activos de la fase estacionaria a la capa de agar por
difusión (Cos et al., 2006). Debido a que la bio-autografía permite localizar las actividades
antimicrobianas de un extracto en el cromatograma, respalda una búsqueda rápida de
nuevos agentes antimicrobianos a través del aislamiento guiado por bioensayos (Cos et al.,
2006). El método de superposición de agar con bioautografía es ventajoso porque, en
primer lugar, usa muy poca cantidad de muestra en comparación con el método de difusión
de disco normal y, por lo tanto, puede usarse para el aislamiento de compuestos guiado por
bioensayo. En segundo lugar, dado que el extracto crudo se resuelve en sus diferentes
componentes, esta técnica simplifica el proceso de identificación y aislamiento de los
compuestos bioactivos ( Rahalison et al., 1991 ).

Cromatografía líquida de alto rendimiento

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es una técnica versátil, robusta y
ampliamente utilizada para el aislamiento de productos naturales ( Cannell,
1998 ). Actualmente, esta técnica está ganando popularidad entre varias técnicas analíticas
como la principal elección para el estudio de huellas dactilares para el control de calidad de
las plantas a base de hierbas ( Fan et al., 2006).) Los productos naturales se aíslan
frecuentemente después de la evaluación de un extracto relativamente crudo en un ensayo
biológico con el fin de caracterizar completamente la entidad activa. La entidad
biológicamente activa a menudo está presente solo como un componente menor en el
extracto y el poder de resolución de la HPLC es ideal para el procesamiento rápido de
muestras multicomponente tanto en una escala analítica como preparativa. Muchos
instrumentos de laboratorio de HPLC ahora son de diseño modular y comprenden una
bomba de suministro de disolvente, un dispositivo de introducción de muestras como una
muestra automática o una válvula de inyección manual, una columna analítica, una
columna de protección, un detector y una grabadora o impresora.
Las separaciones químicas se pueden lograr usando HPLC utilizando el hecho de que
ciertos compuestos tienen diferentes tasas de migración dada una columna particular y una
fase móvil. El grado o grado de separación se determina principalmente por la elección de
la fase estacionaria y la fase móvil. En general, la identificación y separación de
fitoquímicos se puede llevar a cabo utilizando un sistema isocrático (utilizando un único
sistema de fase móvil inalterado). La elución en gradiente en la que la proporción de
disolvente orgánico en agua se altera con el tiempo puede ser deseable si se estudia más de
un componente de muestra y se diferencian significativamente entre sí en retención en las
condiciones empleadas.
La purificación del compuesto de interés usando HPLC es el proceso de separar o extraer el
compuesto objetivo de otros compuestos o contaminantes (posiblemente relacionados
estructuralmente). Cada compuesto debe tener un pico característico bajo ciertas
condiciones cromatográficas. Dependiendo de lo que necesita separarse y de cuán
estrechamente relacionadas están las muestras, el cromatógrafo puede elegir las
condiciones, tales como la fase móvil apropiada, la velocidad de flujo, los detectores y
columnas adecuados para obtener una separación óptima.
La identificación de compuestos por HPLC es una parte crucial de cualquier ensayo de
HPLC. Para identificar cualquier compuesto por HPLC, primero se debe seleccionar un
detector. Una vez que se selecciona el detector y se establece en la configuración de
detección óptima, se debe desarrollar un ensayo de separación. Los parámetros de este
ensayo deben ser tales que se observe un pico limpio de la muestra conocida del
cromatógrafo. El pico de identificación debe tener un tiempo de retención razonable y debe
estar bien separado de los picos extraños en los niveles de detección que se realizará el
ensayo. Los detectores UV son populares entre todos los detectores porque ofrecen alta
sensibilidad (Lia et al., 2004) y también porque la mayoría de los compuestos naturales
encontrados tienen algo de absorbancia UV a bajas longitudes de onda (190-210 nm)
( Cannell, 1998).) La alta sensibilidad de la detección UV es adicional si un compuesto de
interés solo está presente en pequeñas cantidades dentro de la muestra. Además de UV,
también se están empleando otros métodos de detección para detectar fitoquímicos, entre
los que se encuentra el detector de red de diodos (DAD) acoplado con el espectrómetro de
masas (MS) ( Tsao y Deng, 2004 ). La cromatografía líquida junto con la espectrometría de
masas (LC / MS) es también una técnica poderosa para el análisis de extractos botánicos
complejos ( Cai et al., 2002 ; He, 2000 ). Proporciona abundante información para la
elucidación estructural de los compuestos cuando la espectrometría de masas en tándem
(MS n) Está aplicado. Por lo tanto, la combinación de HPLC y MS facilita la identificación
rápida y precisa de compuestos químicos en hierbas medicinales, especialmente cuando un
estándar puro no está disponible ( Ye et al., 2007 ).
El procesamiento de un material de origen en bruto para proporcionar una muestra
adecuada para el análisis de HPLC, así como la elección del disolvente para la
reconstitución de la muestra puede tener una influencia significativa en el éxito global del
aislamiento del producto natural. El material fuente, por ejemplo, la planta en polvo seca,
inicialmente deberá tratarse de tal manera que se asegure que el compuesto de interés se
libere de manera eficiente en la solución. En el caso de material vegetal seco, se puede usar
un solvente orgánico (por ejemplo, metanol, cloroformo) como el extractante inicial y
después de un período de maceración, el material sólido se elimina por decantación del
extracto por filtración. El filtrado se concentra y se inyecta en HPLC para la separación. El
uso de columnas de guardia es necesario en el análisis del extracto crudo. Muchos
materiales de productos naturales contienen un nivel significativo de componentes
fuertemente vinculantes, como la clorofila y otros materiales endógenos que pueden
comprometer el rendimiento de las columnas analíticas a largo plazo. Por lo tanto, las
columnas de protección protegerán significativamente la vida útil de las columnas
analíticas.
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Técnicas no cromatográficas

Inmunoensayo
Los inmunoensayos, que usan anticuerpos monoclonales contra fármacos y compuestos
bioactivos naturales de bajo peso molecular, se están convirtiendo en herramientas
importantes en los análisis de compuestos bioactivos. Muestran alta especificidad y
sensibilidad para los análisis de unión a receptores, ensayos enzimáticos y técnicas
analíticas cualitativas y cuantitativas. El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA) basado en MAb es en muchos casos más sensible que los métodos convencionales
de HPLC. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse en células especializadas
mediante una técnica conocida como tecnología de hibridoma ( Shoyama et al., 2006 ). Los
siguientes pasos están involucrados en la producción de anticuerpos monoclonales a través
de la tecnología de hibridoma contra drogas vegetales:

i. Un conejo se inmuniza mediante la inyección repetida de fármacos vegetales

específicos para la producción de anticuerpos específicos, facilitados debido a la
proliferación de las células B deseadas.
ii. Los tumores se producen en un ratón o un conejo.
iii. De los dos tipos anteriores de animales, las células del bazo (estas células son ricas
en células B y células T) se cultivan por separado. Las células del bazo cultivadas
por separado producen anticuerpos específicos contra el fármaco de las plantas y
contra las células de mieloma que producen tumores.
 iv. La producción de hibridoma por fusión de células de bazo a células de mieloma se
induce usando polietilenglicol (PEG). Las células híbridas se cultivan en medio
selectivo de hipoxantina aminopterina timidina (HAT).
v. El hibridoma deseado se selecciona para clonación y producción de anticuerpos
contra un fármaco de planta. Este proceso se facilita preparando colonias de células
individuales que crecerán y se pueden usar para el cribado de hibridomas
productores de anticuerpos.
vi. Las células de hibridoma seleccionadas se cultivan para la producción de
anticuerpos monoclonales en gran cantidad contra las drogas de plantas específicas.
vii. Los anticuerpos monoclonales se usan para determinar fármacos similares en la
mezcla de extracto de plantas a través de un ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzimas (ELISA).

Ensayo de cribado fitoquímico

Los fitoquímicos son sustancias químicas derivadas de las plantas y el término se utiliza a
menudo para describir la gran cantidad de compuestos metabólicos secundarios que se
encuentran en las plantas. El ensayo de cribado fitoquímico es un procedimiento simple,
rápido y económico que brinda al investigador una respuesta rápida a los diversos tipos de
fitoquímicos en una mezcla y una herramienta importante en el análisis de compuestos
bioactivos. Un breve resumen de los procedimientos experimentales para los diversos
métodos de cribado fitoquímicos para los metabolitos secundarios se muestra en la Tabla
2 . Después de obtener el extracto crudo o la fracción activa del material vegetal, se puede
realizar un examen fitoquímico con las pruebas apropiadas como se muestra en la Tabla
2 para tener una idea con respecto al tipo de fitoquímicos existentes en la mezcla o fracción
de extracto.
Tabla 2
Un breve resumen de la detección fitoquímica de metabolitos secundarios

Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)

secundario

1) Alcaloide Prueba de Dragendorff Encuentra una gota de Mancha ( Kumar et al.,

extracto en un pequeño naranja 2007 );
trozo de placa de TLC
prerrevestida. Rocíe la
placa con el reactivo de
Dragendorff.
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

Prueba Wagner Agregue 2 ml de filtrado Precipitado ( Chanda et al.,

con 1% de HCl + vapor. A rojo parduzco 2006 ).
continuación, agregue 1 ml
de la solución con 6 gotas
del reactivo de Wagner.

TLC método 1 Sistema de disolvente: Mancha ( Tona et al.,

cloroformo: metanol: 25% naranja 1998 )
de amoníaco (8: 2:
0,5). Los puntos se pueden
detectar después de
pulverizar con reactivo de
Dragendorff

TLC método 2 Se humedecen las muestras Mancha (Mallikharjuna

de prueba en polvo con naranja et al., 2007 ).
NH _ { 4}OH medio
diluido y se lixivia con
EtOAc durante 24 horas a
temperatura
ambiente. Separar la fase
orgánica del filtrado
acidificado y basificar con
NH 4OH (pH 11-
12). Luego, extraer con
cloroformo (3X),
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

condensar por evaporación

y usar para
cromatografía. Separar las
manchas de alcaloide
utilizando la mezcla de
solvente cloroformo y
metanol (15: 1). Rocía las
manchas con el reactivo de
Dragendorff.

2) Prueba de Borntrager Calentar aproximadamente Coloración rosa ( Kumar et al.,

antraquinona 50 mg de extracto con 1 ml o rojo intenso 2007 )
de solución de cloruro de la capa
férrico al 10% y 1 ml de acuosa
ácido clorhídrico
concentrado.Enfríe el
extracto y el filtro. Agite el
filtrado con la misma
cantidad de éter
dietílico. Extraiga más el
extracto de éter con
amoníaco fuerte.

Prueba de Borntrager Agregue 1 ml de amoníaco Un color rojo ( Onwukaeme et

diluido (10%) a 2 ml de rosado en la al., 2007 ).
extracto de cloroformo.
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

capa amoniacal
(inferior)

3) Kellar - Prueba Kiliani Agregue 2 ml de filtrado Coloración (Parekh y

glucósidos con 1 ml de ácido acético verde-azul de la Chanda, 2007).
cardíacos glacial, 1 ml de cloruro solución
férrico y 1 ml de ácido
sulfúrico concentrado.

Prueba Kellar-Kiliani Disuelva 50 mg de Anillo marrón ( Onwukaeme et

extracto metanólico en 2 en interfase al., 2007 ).
ml de cloroformo.Agregue
H 2 SO4 para formar una
capa.

Método TLC Se extraen las muestras de Los valores (Mallikharjuna

prueba en polvo con EtOH decolor y et al., 2007 ).
al 70% en un agitador hR fde estos
rotatorio (180 puntos pueden
descongelaciones / min) registrarse bajo
durante 10 horas. Agregue luz ultravioleta
70% de acetato de plomo (UV254 nm)
al filtrado y centrifugue a
5000rpm / 10
min. Centrifugar Además
el sobrenadante mediante
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

la adición de 6,3% de
Na 2 CO 3 a 10.000 rpm /
10 min. Secar el
sobrenadante retenido y
redisolverse en cloroformo
y usar para
cromatografía. Separar los
glucósidos usando
una mezcla de disolventes
de EtOAc-MeOH-H 2O
(80:10:10).

4) Prueba Shinoda A 2-3 ml de extracto Coloración roja ( Kumar et al.,

Flavonoide metanólico, agregue un o roja rosada de 2007 ).
trozo de cinta de magnesio la solución
y 1 ml de ácido clorhídrico
concentrado.

Método TLC Extraiga 1 g de muestras Los valores de (Mallikharjuna

de prueba en polvo con 10 color y hRf de et al., 2007 ).
ml de metanol en baño de estos puntos se
agua (60 ° C / 5 pueden
min). Condensa el filtrado registrar bajo
por evaporación, y agrega luz ultravioleta
una mezcla de agua y (UV254nm)
EtOAc (10: 1 mL), y
mezcla bien. Retenga la
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

fase de EtOAc y utilícela

para la
cromatografía. Separar los
puntos flavonoides usando
cloroformo y metanol (19:
1) mezcla de disolventes.

Prueba de NaOH Trate el extracto con Una solución ( Onwukaeme et

NaOH diluido, seguido de amarilla con al., 2007 ).
la adición de HCl diluido. NaOH, se
vuelve incolora
con HCl
diluido

5) Fenol Prueba de fenol Encuentra el extracto en un Coloración azul ( Kumar et al.,

papel de filtro. Agregue del punto 2007 );
una gota de reactivo de
ácido fosfomolíbdico y
exponga a los vapores de
amoníaco.

6) - Se hirvieron 2 ml de Formación de ( Edeoga et al.,

Phlobatannin extracto con 2 ml de ácido precipitados 2005 ).
clorhídrico 1% HCl. rojos
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

7) alcaloide - Prepare 1 ml de agente Los picos se ( McGaw et al.,

de oxidante, que consiste en compararon 2007 ;Mattocks,
pirrolizidina 0,01 ml de peróxido de con la 1967 ;Holstege
hidrógeno (30% p / v) biblioteca GC- et al., 1995 )
estabilizado con MS
pirofosfato tetrasódico (20
mg / ml) y se completa con
20 ml de isoamilacetato y
se agrega a 1 ml de
extracto de planta. Vortex
la muestra y agregue 0,25
ml de anhídrido acético
antes de calentar la
muestra a 60 ° C durante
50-70 s. Enfríe las
muestras a temperatura
ambiente. Agregue 1 ml de
reactivo Ehrlich y coloque
los tubos de ensayo en un
baño de agua (60 ° C)
durante 5 minutos.Mida la
absorbancia a 562 nm. El
método de Holstege et
al. (1995) se debe utilizar
para confirmar los
resultados del método de
detección
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

8) azúcar Prueba fehling Agregue 25 ml de ácido Ladrillo rojo ( Akinyemi et

reductora sulfúrico diluido precipitado al., 2005 )
(H 2 SO 4 ) a 5 ml de
extracto de agua en un
tubo de ensayo y hiérvalos
durante 15 minutos. Luego
enfríe y neutraliza con
10% de hidróxido de sodio
a pH 7 y 5 ml de solución
de Fehling.

9) saponina Prueba de espuma / Agregue 0.5 ml de filtrado Persistencia de ( Parekh y

Prueba de espuma con 5 ml de agua destilada espuma Chanda, 2007).
y agite bien.

Método TLC Se extraen dos gramos de Los valores de (Mallikharjuna

muestras de prueba en color (amarillo) et al., 2007 ).
polvo con 10 ml de EtOH y hRf de estos
al 70% por reflujo durante puntos se
10 minutos. Condense el registraron al
filtrado, enrriquezca exponer el
con n- BuOHsaturado y cromatograma
mezcle bien. Retenga el a los vapores
butanol, condensar y usar de yodo
para la
cromatografía. Separar las
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

saponinas usando
cloroformo, ácido acético
glacial, metanol y agua
(64: 34: 12: 8) mezcla de
disolventes. Exponer el
cromatograma a los
vapores de yodo.

10) Prueba Liebermann- A 1 ml de extracto Coloración ( Kumar et al.,

esteroides Burchardt metanólico, agregue 1 ml verde oscuro 2007 ).
de cloroformo, 2-3 ml de
anhídrido acético, 1 a 2
gotas de ácido sulfúrico
concentrado.

- A 1 ml de extracto, Cambio de ( Edeoga et al.,

agregue 2 ml de anhídrido color a azul o 2005 ).
acético y 2 ml de ácido verde
sulfúrico concentrado
H2SO4.

Método TLC Extraiga dos gramos de Los valores de color (Mallikharjuna

muestras de prueba en (negro verdoso a negro et al., 2007 ).
polvo con 10 ml de rosáceo) y hR fde estos
metanol en baño de agua
(80 ° C / 15 min). Use el
Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

filtrado condensado para puntos se pueden registrar

cromatografía. Los bajo luz visible
esteroles se pueden
separar usando
cloroformo, ácido
acético glacial, metanol
y agua (64: 34: 12: 8)
mezcla de
disolventes. Los valores
de color y hRf de estos
puntos se pueden
registrar bajo luz visible
después de pulverizar
las placas con reactivo
de ácido
anisaldehídesulfúrico y
calentamiento (100 ° C /
6 min)

11) Tanino Prueba de Braemer Se agregará cloruro férrico Coloración gris ( Kumar et al.,
alcohólico al 10% a 2-3 ml azulada o gris 2007 ); (Parekh
de extracto metanólico (1: verdosa de la y Chanda,
1) solución 2007).

12) Prueba Liebermann- A 1 ml de extracto Coloración ( Kumar et al.,

Terpenoide Burchardt metanólico, agregue 1 ml rosada o roja 2007 ).
de cloroformo, 2-3 ml de
 Metabolito Nombre de la prueba Metodología Resultado (s) Referencia (s)
secundario

anhídrido acético, 1 a 2
gotas de ácido sulfúrico
concentrado.

Prueba de Salkowski Se añadieron 5 ml de Color marrón ( Edeoga et al.,

extracto con 2 ml de rojizo de la 2005 ).
cloroformo y 3 ml de ácido interfaz
sulfúrico concentrado
H2SO4.

13) aceite - Agregue 2 ml de extracto Formación de ( Dahiru et al.,

volátil con 0,1 ml de NaOH precipitados 2006 ).
diluido y una pequeña blancos
cantidad de HCl
diluido.Agite la solución.

Abrir en una ventana separada

Espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier (FTIR )

FTIR ha demostrado ser una herramienta valiosa para la caracterización e identificación de
compuestos o grupos funcionales (enlaces químicos) presentes en una mezcla desconocida
de extracto de plantas ( Eberhardt et al., 2007 ; Hazra et al., 2007).) Además, los espectros
FTIR de compuestos puros son generalmente tan únicos que son como una "huella digital"
molecular. Para los compuestos vegetales más comunes, el espectro de un compuesto
desconocido puede identificarse por comparación con una biblioteca de compuestos
conocidos. Las muestras para FTIR se pueden preparar de varias maneras. Para muestras
líquidas, lo más fácil es colocar una gota de muestra entre dos placas de cloruro de
sodio. La gota forma una fina película entre las placas. Las muestras sólidas pueden
molerse con bromuro de potasio (KBr) y luego comprimirse en una pastilla delgada que
puede analizarse. De lo contrario, las muestras sólidas se pueden disolver en un disolvente
como el cloruro de metileno, y la solución se puede colocar en una única placa de sal. El
solvente se evapora luego, dejando una película delgada del material original en la placa.

Conclusión
Como los compuestos bioactivos que se encuentran en el material vegetal consisten en
mezclas de componentes múltiples, su separación y determinación aún crea
problemas. Prácticamente la mayoría de ellos debe purificarse mediante la combinación de
varias técnicas cromatográficas y varios otros métodos de purificación para aislar
compuesto (s) bioactivo (s).
Ir:

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