Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Docente responsable de la práctica:

Carolina Acuña González

Alumno:
López Portillo Felipe de Jesús

Práctica:
“Estudio de algunos factores que afectan el establecimiento de un método
espectrofotométrico”

Grupo: 5QM2 Sección: 3

Fecha de entrega: 20 de marzo, 2018.

Objetivos.
 Seleccionara tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el espectrofotómetro.
 Manejara algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un método
espectrofotométrico.
 Establecerá las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación del método.

Reacción en la determinación de fierro por el método de tiocianato.

Resultados.

En la práctica se seleccionaron tubos para usarse como cubetas, estos tenían que tener las mínimas
imperfecciones posibles con el mismo diámetro.

Tabla 1. Selección de los tubos que tengan superficies ópticamente equivalentes para usarlos como celdas y
que dan lecturas de 95 ± 2 %T.

Tubo %T400 (H2O) %T400 (NiSO4)

1 95.0 100
2 95.5 21.1
3 95.4 21.4
4 95.7 21.7
5 95.8 20.2
6 95.2 20.5
7 94.1 20.8
8 95.0 21.5
9 95.1 20.1
10 96.5 21.4
11 96.6 21.5
12 96.8 20.4
13 96.3 22.1
14 97.2 22.1
15 98.8 -
Una vez obteniéndose las celdas, se procede a realizar la curva de calibración; la cual es útil para: para la
determinación de la sensibilidad del método, la gama útil de concentración, el intervalo útil de valores A y el
límite de detección del método.

Tabla 2. Curva de calibración de Fe3+.por el método del NH4SCN con la cual da absorbancia a 480 nm y
posterior ajuste por regresión lineal.

Tubo Alícuota (mL) Fe3+ (μg/mL) y = As480 y’ = As480 ajustada (y – y’) (y – y’)2
por regresión
Blanco 0.00 - 0.000 -- -- --
1 0.05 0.1158 0.003 0.040 -0.037 0.0013
2 0.15 0.3475 0.047 0.074 -0.027 0.0007
3 0.30 0.6950 0.104 0.124 -0.020 0.0004
4 0.50 1.1583 0.179 0.192 -0.013 0.0001
5 0.75 1.7375 0.292 0.276 0.016 0.0002
6 1.00 2.3166 0.363 0.360 0.003 0.0000
7 1.25 2.8958 0.449 0.445 0.004 0.0000
8 1.50 3.4750 0.545 0.529 0.016 0.0002
9 1.75 4.0541 0.647 0.614 0.033 0.0010
10 2.00 4.6333 0.712 0.698 0.014 0.0001
11 2.50 5.7916 0.901 0.687 0.214 0.0457
12 3.50 8.1083 1.249 1.204 0.045 0.0020
13 5.50 12.7416 1.817 1.879 -0.062 0.0038
∑(𝐲 – 𝐲’)2 = 0.0555

Cálculos.
Ejemplo para el tubo 1:
De acuerdo a la definición de molaridad tenemos que: PMg – 1000mL – 1M, el PM del compuesto (Fe3+)
analizado es de 55.84 g, por lo que haciendo una regla de 3 obtenemos los gramos en 0.00025M.
55.84g = 1M
X g = 0.00025M
X = 0.0139g

 Sin embargo se utilizó únicamente 0.05 mL de alícuota por lo que:

0.0139g = 1000mL
X g = 0.05mL
X = 6.95 x 10-7g

 Para transformar g a μg se multiplica el resultado por 106; por lo que:

X = 6.95 x 10-7g = 0.695μg

  Finalmente se considera que en el tubo hay 6 mL, entonces, para determinar la concentración en 1
mL se divide el resultado entre 6 mL.
X = 0.695μg / 6mL = 0.1158 μg/mL

 Una manera resumida es:

(Alicuota)(0.0139)1000 μg
𝐓𝐮𝐛𝐨 𝟏 = = 𝐗
6 mL

 Absorbancia ajustada por regresión para el tubo 1 con base a la regresión lineal obtenida en
la gráfica 1:
Absorbancia ajustada = 0.1457(Concentración de Fe3+ (μg/mL)) + 0.0234
Absorbancia ajustada = 0.1457(0.1158) + 0.0234
Absorbancia ajustada = 0.040

 Obtención de la desviación estándar del blanco con base a la tabla 2:

̅ )2
∑(Di − D
SB = √
n−2

0.0555
SB = √ 𝟏𝟏
= 0.0710

 Determinación del límite de detección de un método analítico empleando la ecuación: y1 = (0.0234 =

ordenada al origen de la grafica1) + 3(SB)
y1 = 0.0234 + 3(0.0710)
y1 = 0.0234 + 3(0.0710)
y1 = 0.2424

 Calculo de la concentración de acuerdo a la absorbancia calculada en el punto anterior para determinar

la concentración mínima detectable.
Fe3+ (μg/mL) = (0.2424 = y1) – 0.0234 / 0.1457
Fe3+ (μg/mL) = 1.5030
Grafica 1. Obtención de la curva tipo para la realización de la gráfica de Ringbom (Grafica 2).

2
1.8
1.6
1.4
1.2
As 480 nm

1
0.8
y = 0.1457x + 0.0234
0.6 R² = 0.9965
0.4 R = 0.9982

0.2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Cantidad de Fe3+ (μg/mL)

 ¿Sigue esta reacción la ley de Bouger y Beer? Explique.

Podemos concluir que el coeficiente de correlación de la curva de calibración se aproxima al valor de uno, todos
los puntos siguen una tendencia lineal, por lo cual existe una relación de proporcionalidad entre la absorbancia
y la concentración del ión férrico y por lo tanto se cumple con la ley de Bouger y Beer.

Comente acerca de la sensibilidad del método, el intervalo de concentración y escala de lectura

útil del aparato.
Como sabemos el valor de la pendiente determina la sensibilidad del método, en este caso se tiene una
pendiente con un valor de 0.1457, es decir, se produce un cambio de absorbancia de 0.1457 por cada
incremento de concentración del analito de una unidad (1 μg/mL). Los intervalos de concentración son de:
0.0183 – 1.0883 μg/mL.

Tabla 3. Datos para aplicar el método de Ringbom en la determinación de Fe3+por el método de SCN-
Tubo Fe3+ (μg/mL) Log [Fe3+] As480 %T Absortancia
1 0.1158 -0.9362 0.003 99.31 0.69
2 0.3475 -0.4590 0.047 89.74 10.26
3 0.6950 -0.1580 0.104 78.70 21.30
4 1.1583 0.0638 0.179 66.22 33.80
5 1.7375 0.2399 0.292 51.05 48.95
6 2.3166 0.3648 0.363 43.35 56.50
7 2.8958 0.4617 0.449 35.56 64.44
8 3.4750 0.5409 0.545 28.51 71.49
9 4.0541 0.6078 0.647 22.54 77.46
10 4.6333 0.6658 0.712 19.40 80.60
11 5.7916 0.7627 0.901 12.56 87.44
12 8.1083 0.9089 1.249 5.63 94.37
13 12.7416 1.1052 1.817 1.52 98.48
Grafica 2. Obtención de la gráfica de Ringbom.

120

100

80
Absortancia

60

40
y = 73.516x + 30.631
R² = 0.9932
20 R = 0.9965

0
-1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5
Log [Fe3+]

Cálculos.
 Para el porcentaje de error fotométrico (%Ep) se utilizó la siguiente formula:
230.3
%𝐄𝐩 =
pendiente
230.3
%𝐄𝐩 =
73.51
230.3
%𝐄𝐩 =
73.51
%𝐄𝐩 = 3.1
Para determinar este porcentaje de error de obtuvo la regresión lineal de los puntos en los cuales se obtiene
una recta, estos se obtienen entre las absorbancia de 0.0630 – 0.9089.
Para ver el efecto de la concentración del cromógeno se prepararon una serie de tubos con FeCl3, H2O y
NH4SCN (distinta concentración), los cuales se leyeron absorbancias a 480 nm.

Tabla 4. Efecto de la concentración de SCN- en la determinación de Fe3+ para la obtención de la Grafica 3.

Tubo SCN- (μg/mL) Fe3+ (μg/mL) SCN-/ Fe3+ As480
Blanco 870 0 0 0
1 290 4.17 69.54 0.272
2 870 4.17 208.63 0.412
3 2900 4.17 695.44 0.532
4 5800 4.17 1390.88 0.644
5 8700 4.17 2086.33 0.702
6 11600 4.17 2781.77 0.732
7 14500 4.17 3477.21 0.758
Cálculos.
1. Ejemplo para el Fe3+ (μg/mL) del tubo 1 al 7:
De acuerdo a la definición de molaridad tenemos que: PMg – 1000mL – 1M, el PM del compuesto (Fe3+)
analizado es de 55.84 g, por lo que para determinar la concentración en microgramos con un volumen final de
5 mL. Usando la formula resumida, tenemos que:
(Alicuota)(0.0139)1000 μg
[𝐅𝐞] = = 𝐗
5 mL

(1.5)(0.0139)1000 μg
[𝐅𝐞] = = 4.17
5 mL

2. Ejemplo para el SCN- (μg/mL) del tubo 1:

De acuerdo a la definición de molaridad tenemos que: PMg – 1000mL – 1M, el PM del compuesto (Fe3+)
analizado es de 58 g, por lo que haciendo una regla de 3 obtenemos los gramos en 0.5M.

58g = 1M
Xg = 0.5M
X = 29g

 Usando la formula resumida:

(Alicuota)(29)1000 μg
[𝐒𝐂𝐍] = = X
5 mL

(0.05)(29)1000 μg
[𝐒𝐂𝐍] = = 290
5 mL
Grafica 3. Efecto del cromógeno de acuerdo a los resultados de la Tabla 4.

0.8

0.7

0.6

0.5
Absortancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
SCN/Fe3+

 ¿Qué concentración de tiocianato se recomienda?

Se prefiere que el cromógeno no sea un reactivo limitante, si se usa una solución saturada la reacción se
desplaza a la formación de productos completamente,

Tabla 5. Estabilidad del color respecto al tiempo.

Tiempo As480 nm
0 0.523
30 0.486
60 0.455
90 *
120 *
*Debido a un descuido por parte de los analistas no se obtuvieron estos resultados.

 ¿Es estable el color?

No, conforme pasa el tiempo pasa la absorbancia va disminuyendo por lo que la reacción no es estable.

 ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas?

El tiempo 0, porque es donde tenemos la mayor absorbancia.
Tabla 5. Efecto del pH.
Tubo As480 nm pH
1 0.890 0
2 0.920 1
3 0.875 2
4 0.013 7
5 0.021 8

 ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido?

A pH alcalino el hidróxido reacciona con el fierro formando hidróxido de fierro, por lo que al añadir el tiocianato
ya no reacciona con el fierro ocasionando ausencia de color.
A pH acido se forma más rápido el complejo colorido ya que el fierro reacciona con el tioacianato.

 ¿Cuál es el pH recomendado para que se efectué la reacción Fe3+ - SCN-?

A un pH acido inferior de 3.

Tabla 6. Efecto de algunos aniones en la reacción de Fe3+ - SCN-

Tiempo As480 nm Inicial As480 nm final ∆As480 nm
Fluoruro 0.871 0.084 0.787
Oxalato 0.828 0.083 0.745
Tartrato 0.891 0.887 0.004
Fosfato 0.842 0.785 0.057

Grafica 4. Efecto de algunos aniones en la reacción de Fe3+ - SCN- de acuerdo a la tabla Tabla 6.

Fosfato

Tartrato
Anión

Oxalato

Fluoruro

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

∆As480 nm
  ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción entre el ion férrico y el tiocianato?
El efecto es una competencia entre algunos aniones, como el fluoruro o el oxalato por el hierro.

 ¿A qué se debe este efecto?

A la diferencia de electronegatividades, mientras mayor sea la electronegatividad del anión en comparación con
la del SCN-, se favorecerá el desarrollo de otra reacción a la que se quiere estudiar.

Tabla 7. Parámetros óptimos para el método del sulfocianuro de amonio para determinar fierro-férrico:
Condiciones óptimas para la determinación de fe3+ con NH4SCN.

Parámetro Valor Optimo

pH
Tiempo
Concentración de SCN-
Límite de concentración con % Ep mínimo
Aniones que interfieren (en orden creciente)
Límite de detección del método (LDD)
<3
0 minutos
Una concentración saturada de tiocianato, ya que a
concentraciones muy altas se da la mayor
absorbancia por parte del complejo colorido.
0.0183 - 1.0883 μg/mL con 3.1% de error.
Tartrato, fosfato, oxalato, fluoruro
1.50 µg/mL

Discusión.
Por razones de economía se utilizan a veces celdas cilíndricas. Se debe tener particular cuidado en reproducir
la posición de tales celdas con respecto al haz: de lo contrario las variaciones de camino óptico y las pérdidas
por reflexión en las superficies curvas pueden causar errores significativos.1 La calidad de los datos
espectroscópicos depende críticamente de la forma como que usen y conserven las cubetas contrastadas.
Hullas de dedos, grasa, ralladuras, u otros depósitos en sus paredes modifican notablemente las características
de transmisión de una celda.1 El ancho del tubo también afecto a la transmisión de la luz. Por lo que se
seleccionaron aquellos tubos tubos que tengan superficies ópticamente equivalentes, es decir, que el vidrio
posea una superficie homogénea y paredes de igual grosor en toda la circunferencia del tubo. Como se
mencionó anteriormente es importante reproducir la posición de las celdas para evitar cambios en los datos
obtenidos, por lo que se marcaron la posición de los tubos donde dieron un intervalo de transmitancia del 93 –
97% como se puede observar en la tabla 1, con el fin de utilizar estas celdas en los experimentos posteriores.
La ley de Beer afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie absorbente. Si de
una serie de soluciones de una misma sustancias de la absorbancia de cada una de ellas a la misma longitud
de onda, temperatura y condiciones de disolución, y se representa la absorbancia de cada solución en función
de su concentración, se obtendrá, por lo general una línea recta que pasa por el origen por lo que se dice que
esta línea recta cumple la ley de beer en el margen de concentración investigado. 2 Por lo que la gráfica 1
cumple perfectamente con esta ley. La sensibilidad se describe como la capacidad para discriminar entre
pequeñas diferencias en la concentración de un analito. Este parámetro se ve reflejado en la pendiente de la
recta de calibrado. Así, a mayor pendiente en la curva de calibración, mayor sensibilidad del detector.3 La
sensibilidad del detector no debe confundirse con el límite de detección. Por lo que en la gráfica 1 se puede
observar que el método tiene sensibilidad. Las gráficas de Ringbom en contra parte se construyen al
correlacionar los porcientos de las transmitancias vs. los logaritmos de las concentraciones. Así se obtiene una
sigmoide, la cual tiene una porción recta, con un valor de pendiente elevado; es en éste intervalo de
concentraciones donde el error fotométrico es poco significativo. A transmitancias muy altas y muy bajas, la
curva de Ringbom tiene baja pendiente. Cuando la transmitancia se aproxima a cero o a cien, la curva de
Ringbom se aproxima a los ejes asintóticamente, la pendiente se aproxima a cero y el error relativo a la
concentración tiende a infinito. Las gráficas de Ringbom permiten evaluar la sensibilidad del método, las
pendientes varían con la longitud de onda empleada; a mayor pendiente es posible analizar menor cantidad de
muestra y/o menor concentración de analito.5 De acuerdo a los resultaos de la gráfica 2 y comparando con la
curva tipo de la gráfica 1 se puede afirmar nuevamente que el método es sensible y que de acuerdo con la
pendiente es posible analizar pocas concentraciones de fierro con un porcentaje de error mínimo de 3.1%.
De acuerdo a la gráfica 3, se observa que al aumentar la concentración del cromógeno (SCN-) aumenta la
absorbancia, es menester mencionar que la concentración de fierro se hace constante para visualizar este
efecto, por lo que la concentración de fierro varía de acuerdo a la concentración del cromógeno. Se prefiere
que el cromógeno no sea un reactivo limitante, si se usa una solución saturada la reacción se desplaza a la
formación de productos completamente, midiendo todo el fierro presente en la muestra.
Respecto a la tabla 5, se observar que la reacción no es estable, conforme pasa el tiempo disminuye la
absorbancia, desplazando la reacción hacia reactivos. Por otro lado el efecto del pH interfiere en la reacción,
en el caso de un pH alcalino encontramos hidróxido que reacciona con el fierro produciendo hidróxido de fierro
y evitando que reaccione con el tiocianado por lo que hay ausencia de color rojo, por otro lado, la reacción se
lleva bien a pH acido, favoreciendo la reacción y posterior color rojo intenso (tabla 5). Algunos aniones como
el oxalato y el fluoruro que debido a su electronegatividad interfieren en la reacción con el tiocianato, evitando
la formación de color, esto se observa en la absorbancia de la tabla 6.
Por ultimo en la tabla 7 se resumen los parámetros óptimos obtenidos durante la determinación de fierro férrico.

Conclusiones.

 Se seleccionaron los tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el
espectrofotómetro.
 Se manejaron algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un método
espectrofotométrico.
 Se establecieron las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación del método.

Bibliografía.

1. Scoog, D. West, D. (2015). Fundamentos de química analítica. México: Cengage Learning. Pág(s)
709-710.
2. Connors, K. (1981).Curso de análisis farmaceutico. España: Reverté. Pág(s) 205.
3. Sogorb, M. (2015). Técnicas analíticas de contaminantes químicos: Aplicaciones toxicológicas.
España: Díaz santos. Pág(s) 205.
4. Perez, F. (1983). Análisis de elementos-traza por espectrofotometría de absorción molecular UV-Vis.
España: Díaz santos. Pág(s) 78.
5. Villegas, A. (2006). Análisis ultravioleta-visible. México: Universidad Autónoma de Yucatan. Pág(s) 4-
25.