INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

QUIMICO BACTERIOLOGO PARASITOLOGO

DETERMINACIÓN DE AMINOÁCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO LIBRE. MÉTODO DE

SANGER.

ALUMNOS: GRUPO: 4QV2 SECCIÓN: 02 Posteriormente se coloca el cromatograma en una cámara pre-
viamente saturada con solvente de ácido cítrico y citrato de so-
INTRODUCCIÓN. dio, saturar durante dos horas y desarrollar la cromatografía en
forma ascendente durante 4 o 5 horas. Medir las distancias co-
La determinación de la estructura primaria de una proteína
rrespondientes y calcular los valores de RF.
suele denominarse secuenciación. Existen varias maneras de
determinar la secuencia de aminoácidos. El primero en lograr Después de obtener los valores de Rf correspondientes, se ob-
esto fue Frederick Sanger, quién diseño un método, el cual con- serva similitud entre la marca 3 de la muestra problema con el
siste en el marcaje del amino terminal a través del uso de DNFB. valor de la muestra de DNP-Val, por lo que se puede decir que
Este compuesto químico color amarillo reacciona con los gru- la Valina es el aminoácido N-terminal de la hemoglobina,
pos amino libres en condiciones ligeramente básicas formando mismo que es reportado en la bibliografía. Las otras dos marcas
los dinitrofenil derivados (DNP-aa), también reaccionará con obtenidas en la muestra problema presentan un valor de Rf si-
los grupos imidazol, fenólicos y epsilonamino, por lo que se milares a los de las muestras de DNFB (Similar a P1) y DNP-Ala
dará una dinitrofenilación en la cadena lateral de la tirosina, (Similar a P2), esto puede deberse a que existió contaminación
histidina y lisina. de ambas muestras a la hora de extraer el aminoácido N-termi-
nal.
OBJETIVOS.
CONCLUSIÓN.
Identificar el aminoácido alfa-amino terminal de las cadenas de
la molécula de hemoglobina mediante el método de Sanger. El aminoácido N-terminal de la hemoglobina es la Valina. La
técnica de Sanger permitió extraer dicho aa.
RESULTADOS.
BIBLIOGRAFÍA.
FOTO DEL CROMATOGRAMA O ESQUEMA
Fonaguera J. y G. Gómez (2004), “BIOQUIMICA: LACIENCIA DE
Imagen 1. Cromatograma. Se colocaron DNP-Ala, DNP-Val,
LA VIDA”, Editorial de la Universidad Estatal a Distancia (2004).
DNP-Phe, DNFB y mi muestra problema de izquierda a derecha.
Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger “Principios de Bio-
MUESTRA dm (cm) dsoluto(cm) Rf
química” 4ª Edición. Ed. Omega.
DNP-Ala
DNP-Val PREGUNTAS EXTRA.
DNP-Phe
DNFB
P1
P2
P3
TABLA 1. Cromatografía en papel. Valores de Rf.

ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Se colocaron 30 mg de hemoglobina en un tubo y se disolvió

con bicarbonato de sodio al 4.2%, esto debido a que la reacción
con el DNFB se lleva a cabo en condiciones ligeramente básicas.
Después de esto se agregó al tubo DNFB al 1% y se agitó, pro-
curando mantener el pH entre 8 y 9. Se agregó HCL 3N, con la
finalidad de detener la reacción de dinitrofenilacion, después
se realizaron 3 extracciones con éter y solución acuosa de
FeSO4, posteriormente se evaporaron los residuos de éter y
posteriormente se agrega HCL 6N y se coloca el tubo en la au-
toclave a 15lb/in^2 durante 3 horas, con esto se logra la rup-
tura de los enlaces peptídicos de la hemoglobina, obteniéndose
un “caldo” de aminoácidos que contiene al amino ácido n-ter-
minal, mismo que se extrae con éter, se pasa a una parrilla y se
evapora casi a sequedad , el residuo se disuelve en 5 ml de eta-
nol y se aplica en una tira de papel Whatman junto con otros
DNP derivados.