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HISTOLOGIA
Prof. M.sc Luciana Lima de A. da Veiga
1- Célula
◦ A invenção de lentes de aumento e
a sua combinação no microscópio
permitiu uma maior compreensão
dos constituintes dos organismos.
MICROSCOPIA CONFOCAL
•Varredura a laser
2.4- Técnicas de Microscopia
◦ Os tecidos a serem processados para estudo ao microscópio
devem ser preparados de modo a preservar sua estrutura
original ao máximo possível.
◦ Entretanto, isso não é possível e todos os preparados
apresentam artefatos, que são alterações produzidas nas
células pelas técnicas utilizadas.
◦ Podemos resumir os passos das técnicas histológicas com a
seguinte sequência:
Fixação dos tecidos, desidratação, inclusão, microtomia (corte
em fatias finas), coloração e montagem de lâminas.
◦ Para a formação da imagem ao microscópio de luz, o material biológico
deve ser fino o suficiente para a luz atravessá-lo.
◦ Podem ser realizados esfregaços de sangue e sêmen, por exemplo.
◦ A gota do material é espalhada na lâmina com o auxílio de uma outra
lâmina posicionada em ângulo de 45º.
◦ Células obtidas por raspagem da mucosa oral ou do colo uterino no exame
de Papanicolau são espalhadas na lâmina com a própria espátula da
coleta.
◦ Órgãos ou parte destes, no entanto, devem ser cortados em fatias bem finas.
◦ Para a obtenção de cortes histológicos, o primeiro passo é fixar o material
coletado para evitar a autólise e preservar a morfologia e a composição
química do tecido. Fixadores bastante usados são o formol (ou
paraformaldeído), o glutaraldeído e misturas fixadoras, como o líquido de
Bouin, que é preparado com formol, ácido acético e ácido pícrico, onde
cada substância tem uma qualidade e corrige o defeito da outra.
◦ Para a formação da imagem ao microscópio de luz, o material biológico deve
ser fino o suficiente para a luz atravessá-lo.
◦ Podem ser realizados esfregaços de sangue e sêmen, por exemplo.
◦ A gota do material é espalhada na lâmina com o auxílio de uma outra lâmina
posicionada em ângulo de 45º.
◦ Células obtidas por raspagem da mucosa oral ou do colo uterino no exame de
Papanicolau são espalhadas na lâmina com a própria espátula da coleta.
◦ Órgãos ou parte destes, no entanto, devem ser cortados em fatias bem finas.
◦ Para a obtenção de cortes histológicos, o primeiro passo é fixar o material
coletado para evitar a autólise e preservar a morfologia e a composição
química do tecido. Fixadores bastante usados são o formol (ou
paraformaldeído), o glutaraldeído e misturas fixadoras, como o líquido de Bouin,
que é preparado com formol, ácido acético e ácido pícrico, onde cada
substância tem uma qualidade e corrige o defeito da outra.
a) FIXAÇÃO
◦OBTENÇÃO DO MATERIAL E FIXAÇÃO:
◦ Uma boa preparação histológica se inicia com o uso
correto das técnicas de obtenção do material.
◦ Os cuidados devem ser observados já no sacrifício dos
animais de laboratório para o estudo histológico de seus
tecidos.
◦ Em se tratando de animais de laboratório o sacrifício pode
ser obtido através de técnicas como, traumatismo brusco,
intoxicação (overdose de anestésico) e perfusão/imersão.
◦ Objetivos da fixação
◦ A fixação paralisa o metabolismo celular e preserva as estruturas do tecido para os
tratamentos posteriores.
◦ A fixação evita a autólise celular, impede a proliferação de microrganismos, leva ao
endurecimento do tecido para que resista ao tratamentos posteriores.
◦ O fixador deve causar o mínimo de dano ao tecido e produzir o mínimo de artefatos.
◦ A escolha adequada da solução fixadora irá variar de acordo com o material que irá
ser usado para a inclusão.
◦ A solução de glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4 ou a solução
“formalina neutra tamponada” (NBF) são comumente usadas.
◦ Os fixadores preservam a estrutura dos tecidos ao interagirem com os grupos aminos das
proteínas, através de pontes de hidrogênio.
◦ O glutaraldeído possui dois grupos aldeídos um em cada extremidade de sua estrutura
molecular que podem estabelecer pontes de hidrogênio entre as proteínas.
◦ As moléculas de formaldeído, no entanto, possuem apenas um grupamento aldeído,
sendo um fixador menos eficiente para alguns tipos de proteínas.
Tipos de fixação
◦ A técnica da perfusão para lavagem e fixação do tecido.
◦ A técnica de fixação por imersão
b) DESIDRATAÇÃO , INCLUSÃO E MICROTOMIA
◦ Objetivos
◦ Para a observação ao microscópio de luz a espessura da
secção do tecido presente em uma lâmina deve ser delgada
o suficiente para que possa ser atravessado por um raio de luz.
Para tal os tecidos devem ser criteriosamente preparados para
receber um meio endurecedor, ou seja meio de inclusão.
Desta forma será possível a obtenção de cortes delgados,
obtidos no processo de microtomia.
Tipos de inclusões e a importância da desidratação
◦ A inclusão pode ser feita utilizando a parafina (mais comumente usada) e as
resinas plásticas, como o glicol metacrilato.
◦ Após a fixação com as soluções aquosas de glutaraldeído ou formalina, os
tecidos devem ser desidratados, uma vez que a água presente nos tecidos não
é miscível em substancias apolares como a parafina e as resinas de inclusão.
◦ A desidratação será feita através de imersão numa bateria de soluções
alcoólicas em concentrações graduais e crescentes.
◦ A graduação pode ser iniciada, se necessário, a partir de 50% e terminando
finalmente em álcool absoluto.
◦ A graduação nas concentrações é imprescindível para que ocorra a
desidratação homogenia dos tecidos, evitando que ocorram danos na estrutura
tecidual.
◦ Algumas particularidades podem ser citadas quanto ao material de inclusão.
◦ Caso de parafinas:
O tecido deve ser tratado com uma substância de transição.
A inclusão em parafina é precedida pelo uso de substâncias químicas como o xilol, este miscível
tanto em álcool quanto em parafina.
Após a remoção do álcool, o tecido passa por uma infiltração em parafina líquida, esta mantida
em estufa a 56°C (ponto de fusão) e posteriormente o mesmo é transferido para o molde contendo
parafina líquida.
Em poucos minutos a parafina endurecerá e obter-se-á portanto, o "bloco" de parafina contento o
fragmento do tecido em seu interior.
◦ No caso da inclusão em resina como o glicol metacrilato:
O tecido é infiltrado com uma resina de infiltração por uma noite, e então incluído no molde
contendo a resina ainda líquida, sendo que esta endurece após algumas horas.
Como no caso da parafina, após o endurecimento, obtém-se um bloco de resina que contém o
fragmento de tecido em seu interior.
Os blocos serão a partir desta etapa levados para a microtomia e consequente obtenção das
secções, que serão então coletadas em lâminas de vidro.
No caso de inclusão em parafina, após a microtomia, o tecido é tratado com xilol novamente para
remoção da parafina e rehidratado, para que possa ser submetido à coloração.
c) COLORAÇÃO
◦ Objetivos
◦ Os cortes de tecidos apresentam-se incolores após a
microtomia.
◦ A coloração visa contrastar as estruturas teciduais.
◦ A ação da maioria dos corantes se baseia na interação entre
os radicais ácidos ou básicos dos elementos químicos dos
mesmos com os dos tecidos.
◦ No entanto existem outros tipos de corantes.
◦ Corantes ácidos e básicos
◦ Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga
positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido.
◦ Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os quais
incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos
carboxila das proteínas.
◦ A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia,
estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas.
◦ Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem
heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A
hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul.
◦ Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando
usados juntamente com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma,
filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares.
◦ A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.
◦ Outros exemplos: corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos: azul
de metileno, verde metil e azul de toluidina.
◦ Corantes ácidos e básicos
◦ Eosina e Hematoxilina: A hematoxilina é um corante básico que carrega uma carga
positiva na porção da molécula que irá conferir cor ao tecido.
◦ Corantes básicos reagem com componente aniônicos das células e tecidos, os quais
incluem grupos fosfatos, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanas e grupos
carboxila das proteínas.
◦ A habilidade de grupos aniônicos reagirem com corantes básicos é chamada basofilia,
estruturas celulares que se coram com corantes básicos são denominadas basófilas.
◦ Estruturas celulares que podem ser coradas com corantes básicos incluem
heterocromatina, nucléolo, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem. A
hematoxilina cora geralmente as estruturas em azul.
◦ Corantes ácidos reagem com componentes catiônicos das células e tecidos. Quando
usados juntamente com corantes básicos como a hematoxilina, coram o citoplasma,
filamentos citoplasmáticos e fibras extracelulares.
◦ A eosina geralmente cora as estruturas em vermelho ou rosa.
◦ Outros exemplos: corantes ácidos: fucsina ácida, azul de anilina e orange G; básicos: azul
de metileno, verde metil e azul de toluidina.
◦ Outras técnicas de coloração
◦ Hematoxilina e eosina são corantes adequados para evidenciar características estruturais,
mas eles não são capazes de revelar todos componentes celulares. Outras técnicas de
coloração são disponíveis para evidenciar diferentes componentes.
Após a coloração as lâminas são montadas ou seja, os fragmentos são protegidos pela
cobertura com lamínulas de vidro.
Esta é colada na lâmina através de substâncias selantes como por exemplo o Entellan. Após
a secagem, as lâminas podem ser observadas ao microscópio de luz.
POR QUÊ?
A IMAGEM É INVERTIDA NO MICROSCÓPIO?
Para a forma que as lentes estão, ele é composto por duas
lentes uma ocular e outra objetiva, mas os raios de luz
quando passam essas lentes se invertem já que as lentes são
convergentes, esse mesmo fenômeno pode ser observado na
luneta.
Mas no microscópio a imagem é aumentada e na luneta é aproximada.
Resumo completo de um corte
histológico
3- Morfologia Celular
◦ O tamanho e a forma da célula estão relacionados à sua função
e são determinados por fatores extrínsecos e intrínsecos, como,
por exemplo, pressões externas, organização do citoesqueleto,
quantidade de citoplasma e de organelas e acúmulo de
produtos de reserva ou secreção.
◦ As células epiteliais são geralmente poliédricas, ou seja, com
várias faces.
◦ Quando a largura e o comprimento da célula são maiores que a
sua altura, a célula é dita pavimentosa.
◦ Quando a altura é igual à largura e ao comprimento, é
denominada cúbica.
◦ Quando a altura da célula é maior que a sua largura e o seu
comprimento, a célula é colunar (cilíndrica ou prismática).
◦ As células pavimentosas facilitam a passagem de substâncias
como ocorre com as células dos vasos sanguíneos (endotélio).
◦ As células cúbicas e colunares têm a altura aumentada pela
maior presença de organelas para exercer atividade de
secreção, absorção ou transporte de íons.
◦ O núcleo geralmente reflete a morfologia da célula, pois seu maior eixo é
paralelo ao eixo longitudinal da célula.
◦ Como frequentemente não se veem os limites das células (a membrana
plasmática é muito fina e não é visível ao microscópio de luz), pode-se ter
uma ideia da forma da célula pelo núcleo.
◦ Isso não é válido para células que retêm seus produtos de secreção ou de
reserva, porque o núcleo fica comprimido por essas substâncias. É o caso
da célula caliciforme do intestino, que sintetiza e armazena glicoproteínas
◦ No tecido conjuntivo, há uma grande variabilidade de células e
consequentemente formas celulares.
◦ Ocorre inclusive mudanças na morfologia em um tipo celular conforme o
estado funcional e o ambiente.
◦ Por exemplo, as células adiposas, inicialmente fusiformes, adquirem uma
forma esférica com o armazenamento de lipídios (Figura 1.4) e, no tecido
adiposo, por causa da compactação, podem ser poliédricas.
◦ No tecido nervoso, é muito comum células irregulares, com
prolongamentos que permitem o contato com outras células
◦ As células musculares têm uma maior constância na morfologia, sendo
adaptadas à atividade contrátil.
◦ São alongadas: fusiformes ou cilíndricas e, quando se contraem,
promovem o encurtamento do tecido (Figura 1.6)
4- Componentes celulares
◦ Consultar material de referência:
MONTANARI, T. Histologia: texto, atlas e roteiro de aulas práticas. 3. ed. Porto Alegre:
Edição do Autor, 229 p. digital, 2016. Disponível em: http://www.ufrgs.br/livrodehisto/
Sites consultados:
◦ https://www.biomedicinapadrao.com.br/2013/10/por-que-utilizar-oleo-de-imersao-na.html
◦ http://www.portalsaofrancisco.com.br/biologia/microscopio
◦ http://fap.if.usp.br/~nandast/mev.html
◦ http://depto.icb.ufmg.br/dmor/pad-morf/histologicabasica.htm
◦ http://www.vidrariadelaboratorio.com.br/exercicio-de-visualizacao-microscopio-letras/