Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA

Escuela Académico Profesional de Farmacia Y Bioquímica

FRACCIONAMIENTO CELULAR. DETERMINACIÓN DE SU

CONTENIDO PROTÉICO

INFORME N°03

CURSO: Bioquímica I

DOCENTE: Q.F. Mg. Yadira Fernández Jerí

ALUMNOS:

ALDERETE ESPEJO, Hattie.

MOLEROS CORAL, Diego Alejandro.
PORRAS COCHACHI, Katia Rubí.
QUIÑONES HUAYANEY, María.
TOLENTINO CHÁVEZ, Jorge Luis.

MESA: N° 03

AÑO: Tercero

SEMESTRE: 2013-I
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

INTRODUCCIÓN
Por definición, y a diferencia de las células procariontes, las células eucariontes poseen un
núcleo que contiene la mayoría del DNA envuelto en una membrana. Esto deja al material
genético en un compartimento separado del resto de los contenidos de la célula o
citoplasma, donde ocurren las reacciones metabólicas. En el citoplasma se pueden distinguir
varios organelos: cloroplastos, mitocondrias, retículo endoplásmico, aparato de Golgi,
ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales cumplen funciones específicas
dentro de la célula.

Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas
adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la
componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento
Subcelular, que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y
con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y
Christian Duve entre1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula
en base a su tamaño y densidad.

Finalmente, cabe resaltar que una separación pura de una proteína es esencial para poder
determinar sus propiedades y su actividad. Puesto que las células las contienen miles de tipos
de diferentes proteínas.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

I. OBJETIVOS
Adquirir destrezas en el manejo y en la obtención de órganos y fracciones celulares a partir de
un ratón de laboratorio.
Obtener homogenizados de hígado de rata.
Separar fracciones subcelulares del homogenizado de hígado de rata mediante el proceso de
centrifugación diferencial.
Determinar el contenido de proteínas en las diferentes fracciones obtenidas.
Aplicar el método de Biuret en la cuantificación de proteínas totales.

II. MARCO TEÓRICO

El fraccionamiento celular permite separar los componentes de las células. Las membranas y
organelos celulares suelen separarse mediante centrifugadoras, aparatos que hacen girar tubos de
ensayo. Esto ejerce una fuerza centrífuga en el contenido de los tubos, que sedimenta las partículas
suspendidas en la solución (como los organelos y membranas de células).
Algunas de estas partículas, como las mitocondrias, son organelos completos. Otras son pequeñas
vesículas cerradas, llamadas microsomas, constituidas por membranas de Retículo
Endoplasmático, complejo de Golgi y membrana plasmática. Después de la centrifugación
algunas de las partículas forman un condensado en el fondo del tubo. Las diferentes partes celulares
tienen densidad distinta, lo que permite separarla en fracciones celulares al centrifugar la suspensión
a velocidad creciente (centrifugación diferencial).
Las membranas y los organelos de los condensados resuspendidos pueden purificarse después
mediante centrifugación por gradiente de densidad, que se ilustra como el último paso en la figura. El
condensado resuspendido se dispone en una capa en la parte superior de un gradiente de densidad,
por lo general compuesto de una solución de sacarosa y agua. Dado que las densidades de los
organelos y las membranas difieren, cada uno emigrará durante la centrifugación y formará una
banda a una altura distinta en el gradiente. (1)

Centrifugación Diferencial o Pelleting

En este método, el tubo de la centrífuga es llenado inicialmente con una mezcla uniforme de la
solución de la muestra, a través de la centrifugación se obtiene una separación de dos fracciones: Un
pellet (sedimento) que contiene la partícula sedimentada y un sobrenadante con la fracción no
sedimentada de la solución. Un particular componente puede terminar en el sobrenadante o en el
pellet, o podría estar distribuido en ambas fracciones, dependiendo de su tamaño y/o de las
condiciones de centrifugación.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

FIGURA 1 ESQUEMA DE
FRACCIONAMIENTO CELULAR

El pellet es una mezcla de todos los componentes sedimentados y está contaminado con cualquier
partícula no sedimentada que estuviera en el fondo del tubo. Las dos fracciones son recuperadas por
decantación de la solución sobrenadante del pellet.
El sobrenadante puede ser recentrifugado a altas velocidades para obtener una mayor purificación
con la formación de nuevo pellet y sobrenadante. El pellet puede ser resuspendido en un pequeño
volumen y recentrifugado dependiendo de lo que se desee separar.

FIGURA 2: CENTRIFUGACION
DIFERENCIAL
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

Otro método de separación es por gradiente de densidad, un método que es más complicado que la
centrifugación diferencial pero tiene algunas ventajas: el método de gradiente de densidad permite la
completa separación de algunos o todos los componentes de la mezcla y también permite que se
puedan realizar mediciones analíticas.
Hay dos métodos básicos de centrifugación por gradiente de densidad: La centrifugación zonal y la
centrifugación isopícnica o al equilibrio.

Centrifugación Zonal

Es Cuando se coloca una pequeña cantidad de la disolución con las moléculas que se quieren
caracterizar sobre la superficie de un gradiente de densidad previamente formado a lo largo de un
tubo de centrifugación, en la superficie siempre hay una densidad menor que la existente en la parte
superior del gradiente y cuando se centrifuga el tubo las moléculas de la capa superior sedimentan a
través del gradiente. Si todas ellas tienen el mismo coeficiente de sedimentación sedimentarán en una
estrecha franja, sin embargo, si hay moléculas con distintos coeficientes de sedimentación, se
separaran unas de otras a medida que se produzca la centrifugación y finalmente los diferentes
componentes se resolverán en una serie de zonas o bandas, de ahí el nombre de centrifugación
zonal.

Una vez completada la centrifugación, se fracciona el contenido del tubo generalmente por
recolección de las gotas cuando se hace un orificio en el fondo del tubo y el goteo es lo
suficientemente lento para no producir turbulencias. Cada gota representa una lámina del tubo y una
fracción está representada por una o varias gotas. (2)

FIGURA 3: CENTRIFUGACIÓN ZONAL

 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

La separación zonal es ideal para separar partículas de tamaño definido (ejemplo: proteínas, RNA y
ribosomas), sin embargo, las partículas del mismo tipo son heterogéneas; en este caso, la separación
por centrifugación zonal no es eficiente y es más apropiado separar las partículas en base a otro
parámetro como la densidad; por lo tanto se recurre a la separación isopícnica.

Separación isopícnica

En este tipo de separaciones, partículas de una densidad en particular se hunden durante la

centrifugación hasta que se alcanza una posición donde la densidad de la solución que las rodea es
exactamente igual a la de las partículas. Una vez que se alcanza este cuasi equilibrio, la longitud de la
centrifugación ya no influye en la migración de partículas. Un ejemplo común para este método es la
separación de ácidos nucleicos en un gradiente CsCl. La Figura 4 ilustra la separación isopícnica y los
criterios para su éxito.

FIGURA 4: ISOPYCNIC

Criterios para el éxito de la separación isopícnica:

 La densidad de las partículas utilizadas debe estar dentro de los límites de las densidades de los
gradientes.
 Se admite cualquier longitud de gradientes.
 El tiempo de ejecución debe ser suficiente para que las partículas se agrupen en el punto isopícnica.
No se producen efectos adversos ante el exceso de tiempo. (3)
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

USO DE COMPUESTOS PARA EL FRACCIONAMENTO CELULAR

Sacarosa:

La sacarosa posee propiedades para ser un ideal medio para la formación de gradiente y es el más
utilizado en la centrifugación zonal. Este material tiene aplicación en el fraccionamiento de organelos
celulares y virus. La razón de su gran utilidad es su comportamiento inerte ante la presencia del
material biológico, su bajo costo y su naturaleza estable. Debido a su gran uso, se han caracterizado
las propiedades de la sacarosa y de sus soluciones con respecto a sus relaciones de concentración y
viscosidad, densidad e índice de refracción en un gran rango de temperaturas, y es posible encontrar
las descripciones de los gradientes disponibles y condiciones de centrifugación para la separación de
un gran tipo de muestras biológicas.

La principal desventaja de la sacarosa son algunas de sus propiedades fisicoquímicas. Las soluciones
de sacarosa tienen alta fuerza osmótica y las soluciones por arriba del 9% (p/V) son hipertónicas y
solo tienen una densidad de 1.03 g/cm3 lo que reduce su uso en la separación de partículas
osmóticamente sensibles. Las soluciones concentradas de sacarosa requeridas para separaciones
isopícnicas son muy viscosas, por lo que, las partículas pequeñas son incapaces de alcanzar su
posición isopícnica en el gradiente.

La sacarosa es muy susceptible a hidrólisis de los enlaces glicosílicos a pH menores a 3. Cuando se

calientan, y a menos que se ajuste el pH a 5-6, las soluciones concentradas tienden a caramelizarse
por arriba de los 100 0C.

Los gradientes de sacarosa pueden ser preformados para fraccionamiento zonal de macromoléculas y
complejos macromoleculares, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, ribosomas y polisomas,
también se utiliza gradientes de sacarosa para la separación isopícnica de virus, organelos celulares y
de células si la viabilidad no es esencial.

Sales de sodio y potasio:

El cloruro de sodio y el cloruro de potasio son soluciones poco densas para bandear la mayoría de las
macromoléculas.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

METODOS DE DETERMIANCION DE PROTEINAS

Método de BIURET

El método comprende un ensayo colorimétrico de un paso donde se cuantifica la formación de un

complejo estable entre proteínas y cobre (II). El complejo presenta un color violeta característico, que
se puede observar a 310nm o 540-560nm, el cual se da por la coordinación de un átomo de cobre con cuatro
átomos de nitrógeno. El complejo se basa en la desprotonación de los grupos amida para formar el enlace
con el cobre (II)o por el establecimiento de un enlace coordinado entre el metal y los pares de
electrones libres de los átomos de oxígeno y de nitrógeno del péptido. Después de la adición del
reactivo de cobre se requiere de tiempo para desarrollar una coloración de Biuret estable; es
necesario considerar la posible influencia de aminoácidos libres que forman buffer en configuración
tris y amoniaco. (4)

FIGURA 5: Estructura complejo entre el CU y los enlaces peptídicos

 El método Biuret se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos

NH de los enlaces peptídicos en medio básico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
 La intensidad de coloración es directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces
peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas sustancias interfieren.
 La sensibilidad del método es muy baja y sólo se recomienda para la cuantificación de
proteínas en preparados muy concentrados (por ejemplo en suero).
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE DIVERSOS METODOS DE DETERMINACION PROTEICA

Tabla 1: comparación entre métodos usados para la determinación de proteínas

 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

III. RESULTADOS

BLANCO

1 2 3 4 5 6

estándar (mL) - 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8

Agua (Ml) 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2

Concentración (mg/mL) - 10 20 40 60 80

NaCl 0.9% (mL) 4 4 4 4 4 4

Biuret(mL) 5 5 5 5 5 5

ABSORBANCIA 0.074 0.077 0.128 0.172 0.226 0.283

 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

Solución Absorbancia Absorbancia Real (Abs. experimental –

Abs. Del blanco)

Blanco 0.074 -

Cst1 0.077 0.003

Cst2 0.128 0.054

Cst3 0.172 0.098

Cst4 0.226 0.152

Cst5 0.283 0.209

MUESTRA PROBLEMA

Blanco Homogenizado Pellet A Pellet B Sobren. A Sobren. B

Vol. M.P - 0.2 1 1 0.5 1

Sucrosa 0.25 1 0.8 - - 0.5 -

Sol. De NaCl 0.9% 4 4 4 4 4 4

Reactivo de Biuret 5 5 5 5 5 5

ABSROBANCIA 0.107 0.263 0.373 0.137 0.215 0.332

 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

Solución Absorbancia Absorbancia Real (Abs. experimental –

Abs. Del blanco)

Blanco 0.107 -

Homogenizado 0.263 0.156

Pellet A 0.373 0.266

Pellet B 0.137 0.030

Sobrenadante A 0.215 0.108

Sobrenadante B 0.332 0.225

CONTENIDO PROTÉICO OBTENIDO EN CADA

M.P

Blanco Homogeniza Pellet A Pellet B Sobren. A Sobren. B

do
REFERENCIA:

Curva de
calibración - 300 mg/mL 90mg/mL 12mg/mL 84 mg/mL 82 mg/mL
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

IV. DISCUSIONES

Dos de las lecturas correspondientes a la muestra problema se salieron del rango trabajado
con los estándares pero usamos el método geométrico para estimar una concentración en
mg/mL, entonces para evitar este problema en futuras prácticas tendríamos que revisar bien la
dilución a la que vamos a llevar cada muestra para que de preferencia tengamos resultados
dentro del rango trabajado con estándares. Las concentraciones determinadas para cada
muestra problema guardan relación a lo referido teóricamente y no hubo mayor discusión
respecto a los resultados ya que si bien la absorbancia no corresponde a la concentración
exacta, esto último se debe a pequeños errores de medición o manipulación, teniendo en
cuenta la calidad de las mediciones espectrofotómetricas a causa del equipo y el manejo de
las muestras debido a nuestra inexperiencia justifican dicha desviación.

A pesar de tener indicada la aceleración centrifuga aplicada respecto a cada velocidad en

RPM y observando las diferentes lecturas obtenidas, surge la pregunta si en verdad tenemos
en cada sedimento o sobrenadante lo que decimos tener, es por ello que averiguamos si
existen técnicas para identificar en cada fracción celular el respectivo contenido, encontramos
que se puede hacer un análisis con el microscopio electrónico pero esta técnica en la mayoría
de los casos resulta cara y se necesita una preparación especial de la muestra.

Otra técnica consiste en el uso de marcadores enzimáticos de organelas:

Fracción nuclear: medimos la concentración de ADN de las distintas fracciones. La mayor

concentración de ADN debe estar en la fracción nuclear.

Fracción mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las

fracciones, una mayor actividad corresponde a la fracción mitocondrial.

Fracción lisosomal: mayor actividad de la fosfatasa ácida o alcalina.

Fracción microsomal: mayor actividad de la glucosa-6 fosfatasa.

Fracción soluble: mayor actividad del lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad
de actividad de las otras enzimas porque supondría que algunos orgánulos se han roto.

Empleando dichas técnicas podríamos determinar si hemos llevado a cabo correctamente

todos los procedimientos desde la homogenización en solución isotónica hasta la correcta
centrifugación.

Si bien hemos usado la centrifugación diferencial averiguamos qué otras técnica de

centrifugación se usa generalmente en el fraccionamiento subcelular y consultando en la web
algunos otros manuales de prácticas de bioquímica notamos que la otra técnica que más se
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

usa es la centrifugación isopicnica que consiste en separar las partículas en función a su

densidad. Dicha separación tiene lugar en el seno del disolvente que presenta un gradiente
continuo de densidad. El desplazamiento de la partícula se detiene cuando ésta encuentra un
medio cuya densidad es igual a la propia.
Además este tipo de centrifugación también se usa para purificar cada sedimentado obtenido
en cada centrifugación diferencial, ya que así se pueden separar partículas de igual
coeficiente de sedimentación según su diferente densidad.

Otra duda que surgió fue sobre la importancia del tiempo, si tendríamos los mismos resultados
duplicando el tiempo de centrifugación o si detuviéramos el proceso a la mitad; pues la
respuesta se halla en la Ley de Stokes. Ya que no hemos modificado ni el diámetro ni la
densidad de las partículas, ni la densidad ni viscosidad del medio; la única variable a la que le
podemos hacer cambios es a la gravedad y esto se logra con las diferentes fuerzas de
centrifugación aplicadas a cada tubo en cada parte del experimento. Si cambiásemos el tiempo
de centrifugación nos distanciaríamos del objetivo que realmente queremos retener en cada
pellet o mantener en cada sobrenadante.

V. CONCLUSIONES

El método de centrifugación diferencial es el adecuado para separar fracciones subcelulares

previas a una homogenización.
Se determinó fracciones celulares como núcleos, mitocondrias, lisosoma por centrifugación
diferencial.
El contenido proteico fue determinada por el método de Biuret y se obtuvo lo siguiente:
Homogenizado >Pellet A>Sobrenadante A>Pellet B>Sobrenadante B.

VI. CUESTIONARIO

1. ¿Con qué fin obtenemos fracciones celulares?

Las fracciones celulares son ampliamente usados para la investigación en la bioquímica y fisiología
de organelos fuera del ambiente complejo de la célula intacta. El objetivo principal de este
experimento es aislar los cloroplastos, núcleo y mitocondria del tejido de plantas por el método de
fraccionamiento celular. Los otros objetivos son examinar esas fracciones microscópicamente y
estimar el coeficiente de sedimentación de los organelos.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

2. ¿Qué se supone determinar en cada una de las fracciones obtenidas?

Las células se lisan y los componentes subcelulares se separan mediante una serie de
centrifugaciones que van aumentando de velocidad. Después de cada centrifugación, los orgánulos
que se han sedimentado en el fondo del tubo, se recogen en forma de precipitado sólido. El
sobrenadante se centrifuga a una mayor velocidad para sedimentar la siguiente organela más grande.
Se sedimentan las estructuras más grandes y pesadas con mayor rapidez.

Se puede determinar de las fracciones:

Uso enzimas marcadoras de orgánulos: Consiste en que cogemos una fracción de cada precipitado

y medimos la actividad característica de un orgánulo.

Fracción nuclear: medimos la concentración de ADN de las distintas fracciones. La mayor

concentración de ADN debe estar en la fracción nuclear.

Fracción mitocondrial: medimos la actividad de la glutamato deshidrogenasa en todas las

fracciones, el mayor pico debe salir en la fracción mitocondrial.

Fracción lisosomal: actividad de la fosfatasa ácida o alcalina.

Fracción microsomal: actividad de la glucosa-6 fosfatasa.

Fracción soluble: lactato deshidrogenasa. No debe haber gran cantidad de actividad de las otras
enzimas porque supondría que algunos orgánulos se han roto.
FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

3. Explique el fundamento de la determinación de proteínas por el método de Biuret.

Los péptidos y proteínas producen una reacción del Biuret .Las proteínas por sus uniones
peptídicas reaccionan con los iones cúpricos del reactivo en medio alcalino formando un
complejo de color violeta .Se necesita 2 o más uniones peptídicas para que se forme el
complejo coloreado.

4. ¿Cuál es el coeficiente de sedimentación de los lisosomas y mitocondrias?

Coeficientes de Sedimentación:

 Mitocondrias: Entre 105 y 107 S.

 Lisosomas: entre 50 y 9000 S.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR Y DETERMINACIÓN DE SU CONTENIDO PROTEICO

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Villee, Cluade. Biología. Fraccionamiento celular; 1998.

2. Montero Hilda. Métodos. Centrifugación. Disponible en

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Centrifugacion.pdf

3. THERMO. Conceptos Básicos de centrifugación. Disponible en

http://www.coleparmer.com/TechLibraryArticle/910

4. PAPIME. Análisis de alimentos, fundamentos y técnicas. Disponible en

http://es.scribd.com/doc/42854211/43/Metodo-de-Biuret.

5. Pruebas cualitativas .Identificación de compuestos bioquímicos.Disponible en

http://docencia.izt.uam.mx/japg/RedVirtualJAP/CursoDRosado/2_EstructuradeCompue

stosBioquimicos/9-1_ReaccionesIdentificacion.pdf

6. Laboratory Investigations in Cell and Molecular Biology, Allyn Bregma. cell

fractionation. Link available at:

http://facultad.bayamon.inter.edu/amlugo/LAB%20DESTREZAS%20III/FRACCEL.htm

7. Marino Villavicencio Núñez. Bioquímica. Tomo primero. Capítulo V. Universidad

Nacional Mayor de San Marcos.