BIOQUÍMICA I Guía de Laboratorio

Bioquímica I
Autores: Juan Salazar Sánchez
Lima – Perú
2017
~1~
GUÍA DE PRÁCTICAS DE BIOQUIMICA I
© Derechos Reservados 2012
© Área de Química
Segunda Edición
Primera reimpresión
Diseño, Diagramación e Impresión
Universidad Científica del Sur
Panamericana Sur Km. 19. Lima-Perú 610-6400
Tiraje 1500 ejemplares
IMPRESO EN PERÚ
~2~
Luis Javier Cardó Soria
Presidente Ejecutivo
Dra. Josefina Takahashi Sato

Rectora
José Agustín Ortiz Elías

Vicerrector Académico
M Sc. Alejandro Fukusaki

Coordinador de Cursos Básicos de Ciencias
Q.F. Juan Salazar Sánchez

Coordinador de Área Química
Autor
Q.F. Juan Salazar Sánchez
Reservados todos los derechos: ningún material de este manual puede ser reproducido sin autorización expresa por escrita por los
autores. La autorización será en hoja aparte y firmada y adosada a este material. Todo compromiso suscrito aparte, no se refiere a este
manual. Queda exento del compromiso, el fotocopiado interno en una cantidad no mayor de 100, solo para uso con fines educativos y
sin lucro.
~3~
"Me lo contaron y lo olvidé, lo vi y lo entendí, lo hice y lo aprendí"
Confucio
INDICE
Página
Práctica 0. Bioseguridad 5
Práctica 1. Preparación de soluciones amortiguadoras 9
Práctica 2 . Espectrofotometría 15
Práctica 3. Determinación de Ácido Úrico en suero sanguíneo 20
Práctica 4. Determinación de proteínas plasmáticas 24

Factores que afectan la Velocidad de Reacción Enzimática
Práctica 5. Determinación de Hemoglobina, Determinación de Urea en orina 33
Práctica 6. Cálculo del balance Energético / EVALUACIÓN FORMATIVA 38
Práctica 7. Digestión Enzimática del Almidón 47
Práctica 8. Evaluación de la Glicemia 52
Práctica 9 . Efecto del ayuno sobre el contenido de glucógeno hepático 56
Práctica 1 0 . Determinación de triglicéridos y colesterol en plasma 61
Práctica 1 1 . Hidrólisis enzimática de los lípidos 66
Práctica 1 2 . Determinación de Vitamina C en alimentos vegetales 70
Práctica 13. EVALUACIÓN SUMATIVA
SISTEMA DE EVALUACION:
Laboratorio 36%
BLOQUE I
Rubro (Biología y
Química)
Evaluación permanente 7
Control de aprendizaje 1 10
Control de aprendizaje 2 10
Informes 7
Actitudinal 2
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~5~
INSTRUCCIONES GENERALES y MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
LABORATORIO DE QUÍMICA 1, 2, 3 y 4 UCSUR
El Laboratorio es un ambiente físico estratégico donde se desarrolla diferentes

experimentos, con la finalidad que el alumno complemente conocimientos, genere
habilidades y destrezas en la manipulación de materiales, equipos e instrumental de
laboratorio, incentivando así la adquisición de los hábitos del método científico-
observando los fenómenos que ocurren en los ensayos respectivos y tomando datos
necesarios para obtener resultados confiables.
INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
 Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).

 Leer con anticipación la Práctica a realizar.
 Cada sesión de Laboratorio se generará un Informe; el que será entregado en la
siguiente práctica en su respectivo horario. Es la única fecha y la entrega es de
carácter obligatorio. El Informe se debe desarrollar de acuerdo al formato que se
establecerá en clases.
 La inasistencia injustificada a cualquier práctica impide al alumno la presentación
del informe correspondiente y por lo tanto tendrá la nota mínima de cero.
 El alumno con inasistencia justificadas deberá recuperar la práctica durante la misma
semana para lo que recabará de su profesor de prácticas el formato de autorización
correspondiente.
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
a) DE LA HIGIENE PERSONAL
 Queda prohibido fumar, comer y/o beber durante las prácticas en el laboratorio. Así
mismo el uso de celulares y otros equipos electrónicos.
 Se debe lavar las manos al finalizar el trabajo de laboratorio y cada vez que se
sospecha que ha estado en contacto con algún material contaminado.
 Al entrar en contacto la piel con ácidos o bases fuertes, lavarse inmediatamente con
abundante agua. Para el caso de ácidos aplicarse una solución saturada de
bicarbonato, para las bases utilice una solución al 5 % de ácido acético (vinagre).
 Para quemaduras leves el área afectada se debe aplicar inmediatamente una crema
de picrato de Butesín.
 Mantener limpio el área de trabajo. Al derramar alguna sustancia limpiar
inmediatamente. Al final de la práctica dejar todo el material limpio y ordenado.
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b) DEL COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS DURANTE LAS
PRÁCTICAS
 Está terminantemente prohibido ingresar a l Laboratorio mochilas, carteras o

bolsos, teléfono celulares, animales domésticos, etc.
 Una vez que el alumno haya ingresado al laboratorio no puede salir por ningún
motivo.
 El trabajo con sustancias volátiles se debe realizar haciendo uso de la
campana extractora.
 Para diluir ácidos, siempre se debe agregar los ácidos al agua, y no en
sentido contrario.
 Cuidar como propio todo bien que encuentre o utilice en el laboratorio. El alumno
es responsable de los materiales asignados para el desarrollo de la práctica, el
deterioro implica su reposición obligatoria.
 El manejo de materiales, reactivos y el desarrollo de los experimentos sólo se
realizan con autorización del profesor. Los experimentos no autorizados están
prohibidos.
 Observar cuidadosamente que los frascos con reactivos estén etiquetados
indicando el contenido y la concentración respectiva, antes de ser usados. Obtener
las sustancias químicas de los frascos de reactivos, en un vaso de precipitados o
en un tubo de ensayos limpio, cuidando de no usar cantidades mayores
que las necesarias, está terminantemente prohibido regresar sustancia alguna
no utilizada al frasco original.
 Al encender el mechero Bunsen, primero encender el fósforo y luego abrir la
llave de gas.
ELIMACIÓN DE RESIDUOS
 Los desechos sólidos, líquidos y sales solubles deben ser depositados en los
recipientes indicados por el profesor para su posterior tratamiento.
 Todo desperdicio de papel o residuo sólido debe dirigirse al recipiente de basura
situados en ambas paredes laterales de cada Laboratorio.
 No se debe arrojar residuos sólidos al lavadero.
ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS
a) MANDIL
Para cada sesión de prácticas el estudiante debe llevar un mandil (guardapolvo), el
cual es de carácter obligatorio. Cuando el experimento lo amerite, los estudiantes
usarán lentes de seguridad industrial tipo MERCK. Los estudiantes vestirán sus
mandiles antes de ingresar al Laboratorio y dejarán de vestirlos a la finalización de
las actividades correspondientes.
~7~
b) LENTES DE SEGURIDAD Y RESPIRADORES
Se debe usar lentes de seguridad cuando sea necesario proteger la cara de
salpicaduras y/o sustancias corrosivas. Igualmente se utilizará respiradores cuando
sea necesario. En ambos casos el estudiante tiene a su disposición estos materiales
y los solicitará al responsable del laboratorio.
En la parte lateral central del Laboratorio se encuentra la ducha española, la que
será usada para casos de salpicaduras o derrames en el cuerpo de la víctima con
sustancias ácidas, básicas o corrosivas. Así mismo a la entrada parte izquierda se
encuentra un kit lavador de ojos que se aplicará directamente al ojo de la víctima
en caso de salpicadura de alguna sustancia dañina al ojo.
c) EXTINGUIDORES CONTRA INCENDIOS

El alumno debe conocer el uso y la ubicación de los extintores contra incendios que
en caso de emergencia se descolgará de la pared con cuidado. El extintor, en la parte
superior tiene una palanca circular que se saca (se tira) para activar y se presiona la
manija con la mano derecha y con la mano izquierda se coge la manguera la cual se
orientará hacia la fuente de peligro.
En el caso de incendiarse la ropa de una persona, se deberá pedir ayuda
inmediatamente, se debe estirar en el piso y rodar sobre sí mismo para apagar las
llamas. No se recomienda utilizar el extintor sobre el cuerpo o rostro de una persona.
d) BOTIQUÍN DE PRIMEROS AUXILIOS

Existe un botiquín identificado y de fácil acceso con elementos necesarios para
prestar primeros auxilios en el Laboratorio.
Será responsabilidad de todos los usuarios del Laboratorio conocer la ubicación y el
uso del botiquín y de los elementos de protección personal.
TOMA DE DATOS
 Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los diferentes materiales de

laboratorio.
 Desarrollar los experimentos en forma ordenada y con
mucha responsabilidad.
 Observar con mucho cuidado los fenómenos que ocurren durante el desarrollo de
los experimentos.
 Realizar las mediciones con precisión y efectuar las anotaciones
pertinentes, para obtener resultados satisfactorios disminuyendo el margen de
error. “un error mínimo al principio puede ser máximo al final” (Aristóteles).
 Todo alumno deberá contar con una calculadora personal que contenga como
mínimo funciones de potencia y logaritmo. No se permitirá usar celulares
como calculadora personal.
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MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA PRACTICA N° 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
MATERIALES EN LA MESA DEL ALUMNO
01 Gradilla
04 Tubos de ensayo
05 Beaker de 100mL
01 Bagueta de 20cm largo
12 Cinta indicadora de pH (PANPEHA)
01 Piseta con agua destilada
03 Pipeta 10mL
03 Micropipeta
01 Probeta de 25mL
REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES
11mL Hidróxido de sodio NaOH 0.01M

11mL Ácido clorhídrico HCL 0.01M
10mL Ácido acético CH3COOH 0.1M
10mL Hidróxido de amonio NH4OH 0.1M
10mL Cloruro de amonio NH4CL 0.1M
10mg Benzoato de sodio en polvo NAC6H5CO2
3mL Solución de Albúmina
01 Gotero (25 mL) de anaranjado de metilo
01 Gotero (25 mL) de Fenolftaleína
MATERIALES EN LA MESA CENTRAL (DEL PROFESOR)
01 Gotero (25 mL) de ácido clorhídrico concentrado (HCL)

01 pH-metro
PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DE REACTIVOS
La preparación de todo reactivo expresado en Molaridad (M) se realiza utilizando la siguiente

fórmula:
~ 10 ~
“Hidróxido de sodio” NaOH 0.01M
Pesar 0.4g de NaOH en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta completar un
volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, la reacción es exotérmica, es decir que desprende calor).
“Ácido clorhídrico” HCL 0.01M

Medir un volumen de 0.32mL en una pipeta de 1mL, luego agregar agua destilada hasta completar
un volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, el reactivo es fumante, es decir que desprende gases).
“Ácido acético” CH3COOH 0.1M

Medir un volumen de 5.7mL en una pipeta de 10mL, luego agregar agua destilada hasta completar
un volumen de 1L.
“Hidróxido de amonio” NH4OH 0.1M

Medir un volumen de 3.98mL en una pipeta de 10mL, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 1L.
“Cloruro de amonio” NH4CL 0.1M

Pesar 5.35g en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta completar un volumen de
1L.
“Solución de albúmina” (micela)

Prepare una solución de cloruro de sodio al 0,9% (solución salina fisiológica, SSF). Agregue 100mL
de clara de huevo sobre 900mL de SSF. Agite lentamente (no debe formar espuma). El producto
debe ser transparente, NO TURBIO u OPACO.
Anaranjado de metilo
“Fenolftaleína”
Pesar 1.25gr de fenolftaleína y diluir con etanol al 95% hasta un volumen de 250mL.
~ 11 ~
El poder amortiguador de los cambios de pH en un determinado sistema; es una expresión
simple de reacciones fundamentales reversibles que se establecen en el equilibrio y que se
basan en la teoría ácido-base. Nuestro organismo cuenta con sistemas amortiguadores tanto
intracelular como extracelular:
1. Ecuación de Henderson-Hasselbach
La ecuación de Henderson-Hasselbach, ha sido derivada de la Ley de acción de masas de

Gulberg y Waage, del concepto de constante de equilibrio y de la ionización de ácidos y
bases débiles. Se utiliza para calcular el pH teórico de una mezcla de ácidos débiles y sus
sales.
Para el siguiente sistema en equilibrio:
HA(ac) <====> (H)1+(ac) + A1−(ac)
Calculando Ka para el ácido débil, HA:
H1 A1
Ka
HA
Despejando la concentración de iones hidrógeno se tiene:
HA Ka
H1
A1-
Aplicando logaritmo y multiplicando por (-1), se obtiene:
 HA 
log H1 - log Ka - log 1- 
 A 

Reemplazando:
1
A
pH = pKa + log
HA
Expresión conocida como ecuación de Henderson-Hasselbach, para un ácido débil.
~ 12 ~
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1.- DETERMINAR el pH TEÓRICO y PRÁCTICO en las

SIGUIENTES SOLUCIONES:
NaOH 0,01 M
HCl 0,01 M
CH3COOH 0,1 M
NH4OH 0,1 M
NH4Cl 0,1 M
Determinar el valor del pH teórico según la ecuación de Henderson-Hasselbach.

Tomar 10 mL de cada solución y determinar el valor del pH práctico utilizando el
pH-metro.
EXPERIMENTO 2.- INFLUENCIA DEL pH EN LA SOLUBILIDAD DE

SUSTANCIAS ORGÁNICAS – SOLUBILIDAD DEL
BENZOATO DE SODIO
En un vaso de precipitados de 100 mL de capacidad disolver 10 mg de benzoato de
sodio con 10 mL de agua destilada, inmediatamente medir su pH, luego adicionar 5
gotas de HCl concentrado agitar y observar. Medir nuevamente el pH de la
solución final.
EXPERIMENTO 3.- NATURALEZA AMORTIGUADORA de la ALBÚMINA

Preparar 4 tubos de prueba con los siguientes reactivos:
Tubo 1.- 1 gota de HCl 0,1 M + 1 gota de anaranjado de metilo + 2 mL de H2 0
Tubo 2.- 1 gota de HCl 0,1 M + 1 gota de anaranjado de metilo + 2 mL de H2 0
Tubo 3.- 1 gota de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftaleína + 2 mL de H20
Tubo 4.- 1 gota de NaOH 0,1 M + 1 gota de fenolftaleína + 2 mL de H20
A los tubos 1 y 3 agregar 3 mL de solución de albúmina, agitar y observar.
A los tubos 2 y 4 agregar 3 mL de H2 O, agitar y observar.
Explicar sus resultados.
~ 13 ~
PRÁCTICA 1
INFORME
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS
Apellidos Nombre(s) Mesa Nº Fecha
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 14 ~
~ 15 ~
ESPECTROFOTOMETRÍA
01 Gradilla
05 Tubos de ensayo (13 x 100mm o 15 x 150mm)
02 Pipeta de 10mL
12mL Solución de azul de metileno (10mg/dL)
01 Espectrofotómetro
01 Micro-pipeta 10-100 µL y/o de 5-50µL
12 Puntas descartables respectivas
12 Cubetas para espectrofotometría
“Solución azul de metileno” (10mg/dl):

- En la balanza analítica pesar 10mg de azul de metileno.
- Mezclar los 10mg de azul de metileno previamente pesados en 100mL de agua destilada.
Agitar hasta que se disuelva completamente.
~ 16 ~
Entre los diversos métodos de análisis de tipo cuantitativo que se utilizan para la
determinación de moléculas o elementos constitutivos de los organismos se encuentra
la espectrofotometría, que utiliza la medición de la intensidad de la luz transmitida
y/o absorbida, a determinada longitud de onda, por compuestos químicos en solución.
El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a través de una

solución es reflejada en parte, mientras que la mayor fracción de esta es absorbida por
la sustancia disuelta. La absorción es proporcional a la concentración del soluto.
La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una determinada l o ng i t ud

de onda es dependiente de su estructura química. La ley de Lambert y Beer expresa las
relaciones antes mencionadas mediante la siguiente ecuación:
Io
Long --------- = ε.l.c.
It
Io = Luz incidente It = Luz transmitida

ε = Coeficiente de extensión c= concentración de la solución
l = Distancia recorrida por la luz a través de la solución.
El log Io/It también se conoce como densidad óptica (D.O.) ó absorbancia de la solución
y es directamente proporcional a la concentración del soluto.
Para determinar la concentración de una determinada sustancia puede hacerse uso del
factor de calibración o de una curva de calibración.
La preparación de una curva de calibración se realiza utilizando concentraciones
conocidas de la sustancia cuya concentración deseamos conocer. Luego se determina
la absorbancia de cada una de dichas concentraciones y se procede a preparar un
gráfico, donde en el eje de abscisas se disponen las concentraciones de la sustancia y
en el eje de ordenadas la absorbancia.
Factor de Calibración.-
Se define como la relación que existe entre la concentración del estándar y su
respectiva absorbancia. Este factor puede obtenerse de la manera siguiente:
Factor de calibración = Concentración de estándar

----------------------------------------
Absorbancia
La concentración del estándar pude expresarse como: mg/dL, ug/dL, mEq/L, U/L,
etc. Para encontrar la concentración de una sustancia problema se multiplica el factor
de calibración por la Absorbancia del problema, operación que se realiza de acuerdo al
siguiente procedimiento.
~ 17 ~
Experimento 1: Preparación de una curva de Absorción
Para elaborar una curva de absorción se preparará el siguiente sistema:

Solución de azul de metileno (10 mg/dL) 1 mL.
Agua destilada 4 mL.
Luego se procederá a realizar lecturas en el espectrofotómetro a las siguientes

longitudes de onda: 560, 580, 600, 620 640, 660, 680 y 700 nm.
Graficar utilizando papel milimetrado las absorbancias en función de las longitudes de

onda y determinar el pico de máxima absorción del azul de metileno, el cual
corresponde al mayor valor de la absorbancia.
Experimento 2: Preparación de una curva de calibración
Preparar un experimento de la siguiente manera:
Tubo Nº 1 2 3 4 5
Reactivos
0.5 1 2 3 4
mL Azul de metileno (10mg/dL)
4.5 4 3 2 1
mL Agua destilada
Con agua destilada llevar el espectrofotómetro a cero

Luego leer los tubos a una longitud de onda de 660 nm.
Graficar en un papel milimetrado los resultados, disponiendo las concentraciones en el
eje de abscisas y las absorbancias en el eje de las ordenadas, luego trazar una recta a
través de los putos obtenidos experimentalmente.
Utilizando la curva de calibración o el factor de calibración determinara la
concentración de la sustancia problema que recibirán en la presente práctica.
~ 18 ~
PRÁCTICA 2
INFORME
ESPECTROFOTOMETRÍA
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 19 ~
~ 20 ~
DETERMINACIÓN DE ACIDO URICO EN SUERO
01 Gradilla
03 Tubos de ensayo
03 Pipetas de 5mL
03 Propipetas
0.02mL Suero o plasma

0.02mL Estándar de ácido úrico
3mL Reactivo de trabajo de úrea
01 Baño maría a 37°C
El personal técnico colocará en las mesas TODO el material requerido.
~ 21 ~
El ácido úrico es un compuesto que se forma en el organismo como producto de excreción de
las purinas. Los niveles séricos se encuentran elevados en diversas enfermedades tales como:
insuficiencia cardiaca crónica, leucemia, gota, síndrome de Lesch-Nyhan, etc.
Determinación enzimática de ácido úrico en suero:
La determinación de ácido úrico en suero se realiza utilizando dos enzimas, la uricasa que
transforma el ácido úrico en alantoína y la enzima peroxidasa, que en presencia de 4-
aminofenazona forma quinonimina de color rojo.
Uricasa
Ácido úrico + 2H2O + O2 Alantoína + H2 O2 + CO2
POD
2 H2O2 + 4-AF Quinonimina roja
Preparar lo siguientes medios de ensayo:
B X St
Suero o plasma ----- 20 L -----
Estándar ----- ----- 20 L
Reactivo de Trabajo (mL) 1.0 1.0 1.0
Mezclar suavemente e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37° C. Enfriar y leer la
densidad óptica en el espectrofotómetro a 505 nm.
Valores de referencia:
Hombres: 2 . 5 – 6.0 mg/dL
Mujeres: 2 . 0 – 5.0 mg/dL
~ 22 ~
PRÁCTICA 3
INFORME
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO ÚRICO EN SUERO
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 23 ~
}
~ 24 ~
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PLASMÁTICAS
01 Gradilla
06 Tubos de ensayo
03 Pipetas de 5mL
03 Propipetas
2mL Suero
2mL Suero estandar
1mL Estándar de proteínas
11mL Reactivo BCF
11mL Reactivo EDTA/Cu
01 Centrífuga
01 Baño María a 37°C
~ 25 ~
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
01 Gradilla
17 Tubos de ensayo
01 Hígado de pollo (enzima fosfatasa ácida del hígado)
01 Termómetro
02 Pipeta de 10mL
01 Probeta 25mL
20mL Tampón citrato 0.1M pH 5.0

2mL p-nitrofenil fosfato 0.001M
5mL p-nitrofenil fosfato 0.01M
01 Baño María con temperatura a 37°C
“Tampón citrato” 0.1M pH 5.0
Para obtener soluciones de buffer citrato 0.1M de pH5.0 se deberá pesar 0.7gr de ácido cítrico y
1.86g de citrato trisódico dihidratado. Colocar ambos en una fiola de 100mL y aforar con agua
destilada (es decir colocar 100ml de agua destilada). (Para otro pH y concentración ver el Anexo 1)
“p-nitrofenil fosfato” 0.001M
Pesar 74.22g de p-nitrofenil fosfato en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 200mL.
“p-nitrofenil fosfato” 0.01M

Pesar 742.20g de p-nitrofenil fosfato en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta
completar un volumen de 200mL.
~ 26 ~
Las proteínas plasmáticas cumplen diversas funciones que son muy importantes para un
apropiado funcionamiento de los diversos tejidos del organismo. Pueden cumplir funciones de
transporte, catalíticas, coagulación, etc. Su determinación cuantitativa es muy útil para el
diagnóstico de algunas patologías como: desnutrición, deshidratación, cirrosis, etc.
Determinación de proteínas plasmáticas total (Método de Biuret):
La determinación de las proteínas totales se realiza utilizando iones cúpricos que en medio
alcalino reacciona con las proteínas formando compuestos de coordinación de color violeta,
cuyo pico de máxima absorción es de 540 nm y su intensidad es proporcional a la concentración
de proteínas.
Preparar los siguientes medios de reacción:
B X St
Agua destilada 50 L ---- ----

Suero ---- 50 L ----
Standard de proteínas ---- ---- 50 L
Reactivo EDTA/Cu (mL) 3.5 3.5 3.5
Incubar durante 15 minutos a 37º C y leer en el espectrofotómetro a 540 nm.
Determinación de albúmina:
La albúmina reacciona con el Bromo cresolsulfonftaleína a pH 3.8 formando un compuesto

coloreado que absorbe a 625 nm. Preparar el siguiente sistema:
B St X
Suero estándar ---- 10 L ----

Suero ---- ----- 10 L
Reactivo BCF (mL) 3.5 3.5 3.5
Colocar los tubos en una gradilla a temperatura ambiente durante 10 minutos y leer en el
espectrofotómetro a 625 nm.
~ 27 ~
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las enzimas son compuestos de naturaleza proteica que tienen la propiedad de acelerar las
reacciones químicas sin modificar la constante de equilibrio del sistema. Su actividad es
afectada por diversos factores: concentración de sustrato, pH, concentración de enzima,
temperatura, inhibidores, fuerza iónica, constante dieléctrica, etc.
Efecto de la concentración del sustrato
La velocidad de una reacción catalizada por enzimas es dependiente de la concentración del

sustrato. Esta dependencia es lineal cuando la concentración de sustrato es menor que el valor
Km, perdiéndose esta relación cuando la concentración es muy cercana a Km, para finalmente
tornarse independiente de la concentración de sustrato.
El experimento se realizará utilizando la enzima Fosfatasa ácida de hígado de pollo, enzima que
tiene la propiedad de hidrolizar el p-nitrofenil fosfato en medio ácido formando como productos
de la reacción fosfato inorgánico y p-nitrofenol. Este último compuesto absorbe a 405 nm. Con
tal propósito se prepararán los siguientes medios de reacción:
B-1 1 B-2 2 B-3 3 B-4 4
mL. Tampón citrato 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.1M pH 5.0
mL. p-nitrofenil 0.2 0.2 0.4 0.4 ---- ---- ---- ----
fosfato 0.001 M
mL. p-nitrofenil ---- ---- ---- ---- 0.1 0.1 0.2 0.2
fosfato 0.01 M
mL. agua destilada 0.8 0.7 0.6 0.5 0.9 0.8 0.8 0.7
Colocar los tubos en baño maría a 37° C durante 2 minutos, luego adicionar la enzima conforme
se indica a continuación:
mL. de enzima ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1 ---- 0.1
Detener la reacción EXACTAMENTE a los 2 minutos, mediante la adición de 1 mL de NaOH 1

N. Leer en el espectrofotómetro a 405 nm
Determinar la velocidad de reacción de cada uno de los tubos y luego graficar:
a.- velocidad en función de la concentración de sustrato.

b.- 1/v versus 1/[S].
c.- Calcular los valores de Vmax y Km de la enzima.
Determinar la velocidad máxima y el Km de la enzima utilizando ambos gráficos.
~ 28 ~
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA
La velocidad de una reacción enzimática depende directamente de la concentración de enzima.

Los experimentos deben realizarse en condiciones de velocidad inicial. Para este propósito se
preparan los siguientes medios de reacción:
B 1 2 3
mL. de tampón citrato 0.1 M pH 5.0 1.0 1.0 1.0 1.0

mL. p-nitrofenil fosfato 0.01 M 0.2 0.2 0.2 0.2
mL. agua destilada 0.8 0.75 0.7 0.65
Los tubos de ensayo se incubarán durante 2 minutos a 37 °C a cuyo término se adicionará la

enzima, que dará inicio a la reacción.
mL. de enzima ---- 0.05 0.1 0.15
Se colocarán nuevamente los tubos en el baño maría durante 2 minutos EXACTAMENTE y se

detendrá la reacción mediante la adición de 1 mL de NaOH 1 N. Se leerán las densidades
ópticas a 405 nm.
Graficar la actividad enzimática o la velocidad de la reacción en función de la concentración de

enzima expresada como mL de enzima.
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA.-
El pH del medio de reacción afecta la velocidad con que una enzima cataliza una reacción. La
variación en la velocidad de catálisis ocurre debido a que el pH puede afectar la estabilidad de la
enzima, los grupos ionizables en la enzima, los grupos ionizables del sustrato, etc. Con la
finalidad de observar este efecto se prepararán los siguientes medios de reacción:
pH
3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

mL. tampón citrato 0.1M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
mL. p-nitrofenil fosfato 0.01M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
mL. de agua destilada 0.7 0.7 0.7 0.7 0.7
Colocar los tubos en el baño maría a 37º C durante 2 minutos e iniciar la reacción mediante la
adición de la enzima:
mL. de enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
~ 29 ~
La reacción se detiene transcurrida EXACTAMENTE 2 minutos, mediante la adición de 1 mL
de NaOH 1 N, luego leer en el espectrofotómetro a 405 nm.
Graficar actividad enzimática en función del pH.
~ 30 ~
PRÁCTICA 4
INFORME
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 31 ~
PRÁCTICA 4
INFORME
FACTORES QUE AFECTAN LA ACTVIDAD ENZIMÁTICA
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 32 ~
~ 33 ~
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA. DETERMINACIÓN DE UREA EN ORINA
01 Gradilla
05 Tubos de ensayo
01 Pipetas de 5mL
01 Pipetas de 10mL
02 Propipetas
1mL Sangre
1mL Estándar de hemoglobina
11mL Reactivo de trabajo para hemoglobina
1mL Estándar de urea (0.60 g/L)
1mL Orina diluida
1mL Ureasa
12mL Reactivo 1
12mL Reactivo 2
01 Baño María a 37°C
~ 34 ~
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA
La hemoglobina es una proteína que tiene un papel muy importante en el transporte de gases en
todo el organismo. Sus niveles en sangre mantiene una estrecha relación con la anemia,
policitemia o deshidratación.
Determinación de hemoglobina (Método de Drabkin):
La determinación de hemoglobina se realiza utilizando el reactivo de Drabkin, en cuya

composición se encuentra el ferricianuro de potasio, cianuro de potasio y bicarbonato de sodio.
El ferricianuro transforma las hemoglobinas en metahemoglobina, compuesto que luego
reacciona con el cianuro de potasio para formar cianometahemoglobina, que tiene la propiedad
de absorber a 540 nm.
Preparar el siguiente sistema:
X St
Sangre 20 L ----
Standard de hemoglobina ---- 20 L
Reactivo de trabajo (mL) 5.0 5.0
Mezclar y después de 3 minutos leer en el espectrofotómetro a 540 nm llevando el equipo a

cero con el Reactivo de trabajo.
DETERMINACIÓN DE UREA
La urea es un compuesto nitrogenado que se sintetiza en el hígado a partir del ion amonio,
bicarbonato y ATP. La enzima que cataliza esta primera reacción es la carbamoil fosfato
sintetasa I, cuya actividad es regulada por el N-acetil glutamato. La excreción de urea por la
orina depende fundamentalmente de la ingesta proteica. Un incremento de urea en sangre puede
ocurrir a causa de una probable disfunción renal.
Determinación de urea en orina.-
La determinación de urea en orina se fundamenta en la acción que ejerce la enzima ureasa sobre
la urea, descomponiéndola en anhídrido carbónico y amoniaco. Este amoniaco reacciona con
hipoclorito y fenol en medio alcalino, formando un compuesto azul denominado azul de
indofenol, cuya intensidad es proporcional a la concentración de urea.
Blanco Estándar Problema

Estándar (0.60 g/L) --- 20 L ---
Orina diluida --- --- 20 L
Ureasa I gota I gota I gota
Mezclar mediante agitación e
incubar a 37º C x 5 minutos
Reactivo 1 1 mL 1 mL 1 mL
Reactivo 2 1 mL 1 mL 1 mL
Mezclar e incubar a 37º C por
5 minutos, luego agregar:
Agua destilada 10 mL 10 mL 10 mL
~ 35 ~
Mezclar los tubos por inversión, retirar del baño maría, dejar en reposo durante 10 minutos y
leer en el espectrofotómetro a 540 nm.
Nota.- Debido a que la densidad de la orina está relacionada con la concentración de urea, es
necesario diluirla de acuerdo al esquema siguiente:
Densidad hasta 1.015 …………………. Diluir 1/10

Densidad de 1.016 a 1.025 …………... diluir 1/20
Densidad mayor a 1.025 ………………. diluir 1/40
Es necesario preparar un Blanco de orina. El procedimiento difiere ligeramente del

correspondiente al Blanco. La diferencia radica en que debe añadirse al tubo de ensayo 20 L
de orina después de haber añadido el Reactivo 1, es decir, antes de añadir el Reactivo 2. Con el
Blanco se lleva el espectrofotómetro a Cero.
~ 36 ~
PRÁCTICA 5
INFORME
DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA Y UREA
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 37 ~
~ 38 ~
CALCULO DEL BALANCE ENERGETICO
Esta práctica no requerirá de materiales ni reactivos de laboratorio. Únicamente del Manual de

laboratorio de Bioquímica.
El docente podrá solicitar materiales adicionales, previo requerimiento anticipado.
~ 39 ~
El Balance Energético es el equilibrio que debe existir entre el Gasto Energético diario de un
individuo, de acuerdo a su metabolismo basal, edad, sexo y actividad física, y la Ingesta
Energética diaria a través de los macronutrientes de los alimentos consumidos.
Si predomina el gasto energético sobre la ingesta energética, en un tiempo prolongado, el

individuo tiende a perder sus reservas, y como consecuencia se adelgaza. Por otro lado, si
predomina la ingesta, el exceso de energía se acumulará en el cuerpo, en forma de triglicéridos,
en el tejido adiposo, observándose un aumento de peso.
Para realizar este balance, es necesario calcular, en forma independiente, el Gasto Energético
en las 24 horas de cualquier día rutinario, de acuerdo a la Tasa Metabólica Basal (TMB) y la
Actividad Física realizada, luego compararlo con la Ingesta Energética que proporcionaron los
alimentos consumidos el mismo día, utilizando la Tabla de Composición Química de los
Alimentos de Mayor Consumo en el Perú, Tabla de Medidas Caseras, y los Factores de
Conversión de Peso de Alimentos Cocidos a Crudos.
OBJETIVOS:
1. Calcular las propias Necesidades Energéticas (Gasto Energético) del alumno.

2. Calcular la Ingesta Energética del alumno.
3. Establecer el Balance Energético.
MATERIALES:
Calculadora electrónica de bolsillo.
Lista detallada de las actividades realizadas durante las 24 horas, de un día rutinario
(6:00 a m - 6:00 a m).
Lista detallada de alimentos consumidos durante las 24 horas del mismo día.
Peso real actual.
PROCEDIMIENTO:
1. Calcular la Ingesta Energética, utilizando:
1.1. La Tabla de Trabajo.
1.2. Listado de alimentos consumidos en 24 horas.
~ 40 ~
1.3. Tabla de medidas caseras (ANEXO Nº1).
1.4. Tabla de Factores de Conversión de peso de alimentos cocidos a crudos (ANEXO Nº2).
1.5. Tabla de Composición Química de Alimentos de mayor consumo en el Perú (ANEXO
Nº3 y Nº4).
2. Calcular el Gasto Energético, utilizando:
2.1. Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) de la Tabla Nº1.
2.2. Tabla de Categorías y Factores de la Actividad Física (Tabla Nº2).
3. Calcular el Balance Energético:
Balance Energético = Ingesta Energética - Gasto Energético
4. Obtener la respuesta respetando el signo (+) (exceso) ó (-) (déficit)

4.1. EQUILIBRIO: Ingesta Energética = Gasto Energético.
4.2. BALANCE (+): Ingesta Energética Gasto Energético.
4.3. BALANCE (-): Ingesta Energética Gasto Energético.
5. Calcular el Porcentaje de Adecuación de la Dieta:
% de Adecuación = (Energía ingerida / Energía requerida (*)) x 100
(*) Gasto Energético = Necesidades energéticas ó Energía requerida.

6. Analizar el Porcentaje de la Adecuación de la Dieta obtenido, según los siguientes
parámetros:
6.1 Valores normales = 90 - 110%.
6.2 Déficit = 90%
6.3 Exceso = 110%
“CÁLCULO DE LA INGESTA ENERGÉTICA”
a) En la lista de consumo de alimentos, desglosar las preparaciones de todo el día en cada uno
de sus constituyentes. En columnas ordenadas calcular mediante regla de tres el contenido de
proteínas, grasas y carbohidratos de cada alimento respectivamente, según la cantidad que se
haya consumido.
Ejemplo1: ingesta de leche fluida de vaca = 250 mL.

Leche fluida de vaca: proteínas en 100 mL 3.1 g
Para calcular la cantidad de proteína que existe en 250 mL de leche fluida de vaca:
~ 41 ~
1 ---- X X = 250 x
0 3.1 / 100
0
X = 7,75 g de proteínas
m
L
Ejemplo2:
. Ingesta de pulpa de carne de vacuno = 90 g.
Pulpa de carne de vacuno: proteínas en 100 g de porción comestible. 21.3g.
d
Para
e calcular la cantidad de proteína que existe en 90 g de pulpa de
carne de vacuno:
l
e 100 g. de pulpa de carne de vacuno(*) --------- 21.3 g. de proteína
c
h 90 g. --------- X
e X = 90 x 21.3 / 100
- X = 19.17 g de proteínas
-
-
(*)
- La tabla de Composición química de los alimentos indica los valores
-
en 100 g de porción comestible cruda (a menos que indique los valores en
-
cocido).
-
-
-
b) Totalizar luego cada una de las tres columnas, y el valor obtenido en
3
. gramos de cada macronutriente se multiplica por el factor respectivo.
1 Proteína x 4,0 Kcal
g Grasa x 9,0 Kcal

Carbohidrato x 4,0 Kcal
d
c)
e Sumar los totales, y el resultado obtenido corresponde a la cantidad de
energía (Kilo/calorías) que aportaron los alimentos consumidos ese día.
p
r TABLA DE TRABAJO
o
t
e
í
n
a
2
5
0
m
L
.
-
-
-
-
- ~ 42 ~
INGESTA ENERGÉTICA =  (kcal)/d
“CÁLCULO DEL GASTO ENERGÉTICO”
G.E. = TMB Factor de Actividad
a) Se calcula la Tasa Metabólica Basal (TMB) o gasto en reposo, aplicando la

fórmula de la siguiente tabla.
TABLA Nº1
Ecuaciones para calcular la Tasa de Metabolismo Basal (TMB) a partir del peso corporal (P)
Rango de edad (años) kcal/día

Hombres:
0 -3 60,9 P - 54
3 - 10 22,7 P + 495
10 - 18 17,5 P + 651
18 - 30 15,3 P + 679
31 - 60 11,6 P + 879
> 60 13,5 P + 487
Mujeres:
0-3 61,0 P - 51
3 - 10 22,5 P + 499
10 – 18 12,2 P + 746
18 - 30 14,7 P + 496
30 - 60 8,7 P + 829
> 60 10,5 P + 596
OMS(1985)
Ejemplo: La TMB para una estudiante de 19 años de edad , con 55 kg. de peso, será:
TMB = 14.7 P + 496
~ 43 ~
TMB = 14.7 55 + 496
TMB = 1 305 kcal/d
b) Con la lista de actividades, se agrupan éstas por categorías, tomando en cuenta el tiempo
empleado (en minutos) y multiplicándolas por el múltiplo de la TMB o factor de actividad
(o gasto de energía promedio por actividad).
Las categorías de actividad física son las siguientes:
TABLA Nº2
Actividad Física Categoría Múltiplo de la TMB o

Factor por actividad
Dormir, descansar. Reposo 1,0
Manejando automóvil, escribiendo a máquina, Muy ligera 1,5
atendiendo clase, trabajando en laboratorio, viendo TV,
cocinando, planchando, jugando cartas, tocando un
instrumento musical .
Caminando a 4 - 5 km/h, atendiendo al público, Ligera 2,5
limpieza de la casa, cuidando niños, trabajo de
carpintería y electricidad, jugar tenis de mesa.
Caminando a 5.5 - 6.5 km/h ,Manejando bicicleta, Moderada 5,0
bailando, trabajando en jardinería, cargando bultos
pesados.
Jugando fútbol, vóley, básquet, caminando con carga Pesada 7,0
pesada cuesta arriba, cortando árboles, trabajo de
excavación manual.
* Asignar 1/3 de hora para el mantenimiento cardiovascular y muscular.
Recomendación FAO/OMS 1985.
Ejemplo:
1) Ordenar las actividades de acuerdo al tiempo empleado:

HORA ACTIVIDAD TIEMPO
06:00 a.m. a 06:15 a.m. Aseo personal 15 ‘
06:15 a.m. a 06:45 a.m. Tomar desayuno 30 ‘
06:45 a.m. a 07:00 a.m. Caminar para tomar el bus 15 ‘
~ 44 ~
07:00 a.m. a 08:00 a.m. Viajar en bus 60 ‘
08:00 a.m. a 10:00 a.m. Asistir a clase 120 ‘
etc. (Debe completar 1440 minutos).
2) Agrupar por categoría de actividad:
Categoría de actividad Tiempo Múltiplo de la TMB Factor de TMB

empleado o factor por ponderado
(Horas) actividad
En reposo 8 1,0 8,0
Muy ligera 14 1,5 21,0
Ligera 2 2,5 5,0
TOTAL 34,0
Promedio / hora 1.417
(Factor de TMB/ 24 h)
Gasto Energético 1 850,0
(1.417 x TMB)*
GASTO ENERGÉTICO = 1.417 TMB

= 1.417 1 305
GASTO ENERGÉTICO = 1 850,0 kcal/d
~ 45 ~
PRÁCTICA 6
INFORME
CÁLCULO DEL BALANCE ENERGÉTICO
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 46 ~
~ 47 ~
DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDON
01 Gradilla
03 Tubos de ensayo
01 Beaker de 50mL
01 Pipeta de 10mL
01 Pipeta de 5mL
02 Propipetas
3mL Tampón fosfato 0.1M pH 6.5

6mL Almidón 1%
7.5mL Ácido clorhídrico 0.5N (HCl)
01 Gotero de solución de Lugol
01 Baño María con temperatura a 37°C
“Tampón Fosfato” 0.1M pH 6.5
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 6.5, se mezcla 68.5mL de Solución 1 y
31.5mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de 200mL con agua destilada.
(Para otro pH y concentración ver el Anexo 1).
Solución 1: 0.2M de NaH2PO4
Disuelva 24g de NaH2PO4 y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
Solución 2: 0.2M de Na2HPO4

Disuelva 53.6g de Na2HPO4*7H2O y lleve a un volumen de 1Litro con agua destilada.
“Almidón” 1%
Colocar 1L de agua en una plancha de calentamiento hasta llegar a ebullición. Luego,
añadir 10 gr de almidón hasta su disolución.
Conservación: Con el objetivo de que el almidón dure más tiempo, luego de la ebullición
se puede agregar 3gr de NaCl, disolver y añadir 10gr de almidón.
Verificación: Colocar en un tubo de ensayo 10 mL de la solución de almidón y agregar 2-3
gotas de Lugol. La reacción positiva dará una coloración azul-violeta.
~ 48 ~
“Ácido clorhídrico” HCL 0.5N
Medir un volumen de 16.27mL en una probeta, luego llevar a un recipiente y agregar agua
destilada hasta completar un volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, el reactivo es fumante, es decir
que desprende gases).
~ 49 ~
El almidón constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El proceso
de digestión de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que actúa la alfa-amilasa
salivar, enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces alfa 1,4 del almidón y formar
polisacáridos de menor peso molecular.
HIDROLISIS DEL ALMIDON POR LA AMILASA SALIVAR
Para realizar el experimento se prepararán los siguientes medios de reacción:
1 2 3
mL. tampón fosfato 0.1 M pH 6.5 1.0 1.0 1.0

mL. de almidón al 1% 2.0 2.0 2.0
mL. ácido clorhídrico 0.5 N --- --- 1.5
mL. de agua destilada 2.0 1.5 ---
Colocar los tubos de ensayo en el baño maría a 37° C durante 2 min, luego adicionar:
mL. solución de saliva --- 0.5 0.5
Colocar nuevamente los tubos en baño maría y sacar alícuotas de 0.5 mL. de cada uno de los
tubos a los 5, 10, 15 y 20 minutos, y adicionarlos a los tubos previamente preparados que
contienen 2.0 mL de ácido clorhídrico 0.05 N, de acuerdo al siguiente esquema:
Tubo N° 1 2 3
mL de ácido clorhídrico 2.0 2.0 2.0
Luego adicionar a cada tubo:
Gotas de solución de Lugol I gota I gota 1 gota
Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Durante el desarrollo del experimento se observarán modificaciones del color inicial de los
tubos como consecuencia de la acción de la alfa-amilasa salivar.
El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo claro.
~ 50 ~
PRÁCTICA 7
INFORME
DIGESTIÓN ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 51 ~
~ 52 ~
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
01 Gradilla
03 Tubos de ensayo
03 Pipetas de 5mL
03 Propipetas

0.02mL Estándar de glucosa 100mg/dL
6mL Reactivo de trabajo para glucosa
“Estándar de glucosa” 100mg/dL
Se debe preparar con al menos 1 día de anticipación.

En la balanza analítica pesar 0.1g de glucosa (se puede emplear azúcar normal). Mezclar en 100mL
de agua destilada. Agitar y calentar. Dejar que disuelva completamente y enfriar.
~ 53 ~
La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un indicio, que podría
permitir diagnosticar diversas patologías: diabetes mellitus, mixedema, hipopituitarismo, etc.
Determinación enzimática de glucosa en sangre (Método de Trinder).
La determinación enzimática de glucosa sanguínea se realiza utilizando 2 enzimas: glucosa

oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalíticas en presencia de apropiados reactivos químicos,
permitirán la formación de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la
glucosa existente en el medio de reacción.
Glucosa oxidasa
Glucosa + H2O + 02 Acido glucónico + H2O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
Preparar los siguientes medios de ensayo:
B X St
Suero o plasma ---- 20 L ----

Standard ---- ---- 20 L
Reactivo de trabajo (mL) 2.0 2.0 2.0
Incubar en baño maría a 37º C durante 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 505 nm.
~ 54 ~
PRÁCTICA 8
INFORME
DETERMINACIÓN DE GLUCEMIA
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 55 ~
~ 56 ~
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCÓGENO HEPÁTICO
01 Gradilla
04 Tubos de ensayo
04 Embudos para tubos de ensayo
01 Plancha de calentamiento
01 Beaker de 250mL
03 Pipetas de 5mL
03 Propipetas
1mL Estándar de glucosa 5mg/dL

5mL Alcohol etílico
6mL Hidróxido de Potasio KOH 30%

30mL Reactivo de Antrona
01 Agua helada o hielo (colocar cuando sea solicitado por el docente)
3g Hígado de roedor en ayunas por 24h
3g Hígado de roedor alimentado Ad libitum
01 Centrifuga
“Hígado de roedor”
Se deberán de solicitar los roedores con 3 días de anticipación a los colaboradores de veterinaria.
“Hidróxido de Potasio” KOH al 30%

En un beaker de 250mL colocar 75gr de KOH y luego agregar agua destilada hasta llenar 250mL.
Agitar hasta lograr una mezcla completa.
“Estándar de glucosa” 5mg/dL
Se debe preparar con al menos 1 día de anticipación.

En la balanza analítica pesar 0.005g de glucosa (se puede emplear azúcar normal) y luego agregar
100mL de agua destilada. Agitar y calentar. Dejar que disuelva completamente y enfriar.
~ 57 ~
“Reactivo de Antrona”
Una hora antes de usarlo, pesar 100mg de antrona y disolverla en 50mL de ácido sµLfúrico
concentrado grado analítico.
Recomendaciones para el reactivo de antrona:
a) Es deseable que la preparación de antrona sea lo más próxima a la práctica ya que el reactivo
antrona es estable durante 1 semana.
b) El reactivo antrona deberá transferirse a un tubo tipo falcón. El tubo deberá cubrirse con papel
aluminio y conservarse a 4°C en refrigeración
Fig2 .Tubo tipo falcón
c) Las medidas de seguridad para la preparación de antrona incluyen el uso de ropa protectora,
guantes y trabajar usando una campana de extracción.
~ 58 ~
El hígado es el órgano que almacena glucógeno como un elemento de particular importancia
energética, que le permite al organismo mantener la glicemia durante los periodos en que no
ingiere alimentos. A diferencia del tejido muscular, el hígado puede degradar el glucógeno y
liberar glucosa a la sangre.
Extracción de glucógeno de hígado de rata.-
Preparación de los animales de experimentación.- Se dispondrán de 2 ratas en jaulas

individuales, una de las cuales recibirá su dieta habitual, mientras que la otra será sometida a un
ayuno de 24 horas. A ambas se les proporcionará agua "ad libitum".
Extracción del glucógeno.- Se sacrificarán ambos animales previamente anestesiados

con cloroformo y se procederá a extraerles el hígado. Luego, se realizará una observación del
tamaño y color del mencionado órgano. Se pesará 0.5 g de hígado de cada animal se colocarán
en tubos de boca ancha. y se les adicionará 1 mL de KOH al 30%. Se colocará en la boca de
cada tubo un embudo pequeño y se les someterá al baño maría hirviente durante 30 minutos.
Después de enfriar, se les adicionará 3 mL de agua destilada y 5 mL de alcohol etílico. Se
formará precipitado en aquel hígado que contenga glucógeno. Se centrifugará durante 10
minutos a 3000 rpm a cuyo término se eliminará el sobrenadante. Disolver el precipitado en 200
mL de agua destilada. La determinación del glucógeno se realizará con la antrona.
Se prepararán los siguientes medios de reacción:
1 2 3 4
mL disolución rata en ayunas 1.0 --- --- --- mL

disolución rata normal --- 1.0 --- ---
mL estándar de glucosa (5mg/dL) --- --- 1.0 ---
mL agua destilada --- --- --- 1.0
Colocar los tubos en agua helada y adicionar 5.0 mL del reactivo de antrona. Llevar los tubos al
baño maría durante 15 minutos, enfriar y leer a 660 nm.
~ 59 ~
PRÁCTICA 9
INFORME
EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 60 ~
~ 61 ~
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS Y COLESTEROL EN SUERO

01 Gradilla
06 Tubos de ensayo
03 Pipetas de 5mL
03 Propipetas
0.02mL Estándar de triglicéridos
36mL Reactivo de trabajo para triglicéridos
0.02mL Estándar de colesterol
36mL Reactivo de trabajo para colesterol
~ 62 ~
DETERMINACIÓN DE TRIGLICÉRIDOS
La determinación de triglicéridos en plasma constituye un dato muy importante en el manejo de

ciertas dislipidemias. Su incremento en el plasma constituye un factor de riesgo positivo para
aterosclerosis.
Los triglicéridos del plasma son hidrolizados por una lipoproteína lipasa (LPL) que forma como
productos glicerol y ácidos grasos. El glicerol en presencia de ATP por acción de la glicerol
quinasa es convertido en glicerol-1-fosfato, compuesto que es convertido por la glicerol fosfato
oxidasa (GPO) en dihidroxiacetona fosfato y peróxido de hidrógeno, este compuesto en
presencia de 4-aminofenazona (4-AF), clorofenol y peroxidasa (POD) es transformado en una
quinonimina de color rojo.
LPL
Triglicéridos Ácidos grasos + Glicerol
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP ADP + Glicerol-1-fosfato
GPO
Glicerol-1-fosfato + O2 Dihidroxiacetona fosfato + H2 O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + clorofenol Quinonimina roja
B X St
Suero o plasma --- - 20 L ----

Standard ---- ---- 20 L
Reactivo de Trabajo 2 mL 2 mL 2 mL
Mezclar e incubar durante 5 minutos en baño maría a 37º C, luego leer en el espectrofotómetro a
505 nm.
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL
El colesterol es una sustancia cuyos niveles en la sangre mantienen una estrecha relación con
diversas patologías, por cuyo motivo su determinación puede contribuir al diagnóstico de:
aterosclerosis, mixedema, diabetes mellitus, nefrosis, hipertiroidismo, etc.
Determinación de colesterol total en sangre
La técnica utilizada para la determinación se fundamenta en la hidrólisis previa de los ésteres

de colesterol por la colesterol esterasa, la posterior acción de la enzima colesterol oxidasa que
formará peróxido de hidrógeno en cantidades estequiométricas y finalmente la participación de
~ 63 ~
la peroxidasa que en presencia de reactivos químicos formará un compuesto coloreado
proporcional a la cantidad de colesterol existente en la muestra de sangre.
Colesterol esterasa
Esteres de colesterol + H2O Colesterol + AGNE
Colesterol oxidasa
Colesterol + O2 colesten-3-ona + H2O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
B X St
Suero o plasma ---- 20 L ----

Standard ---- ---- 20 L
Reactivo de trabajo (mL) 2.0 2.0 2.0
Incubar durante 5 minutos en baño maría a 37º C y leer en el espectrofotómetro a 505 nm.
~ 64 ~
PRÁCTICA 10
INFORME
DETERMINACIÓN DE TGC Y COLESTEROL EN SUERO
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 65 ~
~ 66 ~
HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE LOS LÍPIDOS
01 Gradilla
04 Tubos de ensayo
01 Bureta de 25mL

01 Gotero de fenolftaleína
01 Gotero con 30mL de hidróxido de sodio NaOH 0.05N

90mL Solución de Pancreatina al 1%
36mL Sales biliares al 1%
30mL Aceite vegetal
36mL Tampón fosfato 0.1M pH7.8
“Fenolftaleína”
Pesar 1.25gr de fenolftaleína y diluir con etanol al 95% hasta un volumen de 250mL.
“Hidróxido de sodio” NaOH 0.05N

Pesar 1.9g de NaOH en la balanza analítica, luego agregar agua destilada hasta completar un
volumen de 1L. (¡PRECAUCION!, la reacción es exotérmica, es decir que desprende calor).
Es recomendable almacenar en envases de plástico para mayor duración del reactivo.
“Pancreatina” al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Pancreatina y luego agregar agua destilada hasta llenar 1L.
“Sales biliares” al 1%
En un beaker de 1L colocar 10gr de Sales Biliares y luego agregar agua destilada hasta llenar 1L.
“Tampón fosfato” 0.1M pH7.8

Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 7.8, se mezcla 8.7mL de Solución 1 y
91.3mL de la Solución 2. Luego se completa a un volumen total de 200mL con agua destilada.
(Para otro pH y concentración ver el Anexo 1).

~ 67 ~
Hidrólisis de los lípidos por la lipasa pancreática.-
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa pancreática.
En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares, compuestos que tienen la
propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente acción de la lipasa pancreática.
Con la finalidad de mostrar experimentalmente la acción hidrolítica de esta enzima se

prepararán los siguientes medios de reacción:
B 1 2 3
mL. de tampón fosfato 0.1 M pH 7.8 2.0 2.0 2.0 ---
mL. de aceite 1.0 1.0 1.0 1.0
mL. de sales biliares al 1% 2.0 2.0 --- 2.0
mL de agua 5.0 --- 2.0 2.0
Añadir II gotas de fenolftaleína a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una
solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca una coloración débilmente grosella estable, luego
adicionar:
mL. de solución de pancreatina al 1% --- 5.0 5.0 5.0
Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitándolos cada 5 minutos.
Al finalizar el tiempo de incubación adicionar nuevamente a cada tubo II gotas de

fenolftaleína y proceder a titular, utilizando una bureta, con una solución de NaOH 0.05 N
hasta que aparezca nuevamente la coloración ligeramente grosella.
Los resultados se expresarán como miliequivalentes de ácido esteárico liberado por acción de la
lipasa pancreática.
~ 68 ~
PRÁCTICA 11
INFORME
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA DE LOS LÍPIDOS
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 69 ~
~ 70 ~
DETERMINACIÓN DE VITAMINA C EN ALIMENTOS VEGETALES
01 Gradilla
03 Tubos de ensayo
03 Pipetas de 2mL
03 Propipetas
02 Beakers de 50mL
01 Jugo de fruta diluido (puede emplearse “Tampico”)

6mL Folin-Ciocalteu al 10%
1mL Estándar de ácido ascórbico 0.1mg/mL
01 Centrífuga
01 Baño María a 100°C o planchas de calentamiento y termómetros
“Folin-Ciocalteu” al 10%
Pesar 20gr de Folin-Ciocalteu. Luego mezclar con 200mL de agua destilada hasta su total
disolución.
“Ácido ascórbico” 0.1mg/mL

Pesar 0.01gr de ácido ascórbico en la balanza analítica. Luego mezclar con 100mL de agua
destilada hasta su total disolución.
~ 71 ~
La vitamina C es un compuesto que el ser humano debe ingerir necesariamente en su dieta
habitual, debido a que no dispone de las enzimas necesarias para sintetizarlo, como ocurre en las
ratas.
Determinación de vitamina C en frutas cítricas
La vitamina C puede determinarse cuantitativamente utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu,

para cuyo propósito se procederá de la siguiente manera:
Preparación de la muestra.-
Se procederá a extraer el jugo de una fruta cítrica como el limón o la naranja y se procederá a
diluirlo al 1/2 con ácido tricloroacético al 10%, luego se filtrará y centrifugará a 2500 rpm
durante 10 minutos.
Para la determinación cuantitativa de vitamina C se procederá de la siguiente manera:
B P St
mL. del jugo de fruta diluido --- 0.1 ---

mL. del reactivo de Folin-Ciocalteu al 10% 0.2 0.2 0.2
mL. de estándar de ácido ascórbico (0.1 mg/mL) --- --- 0.1
mL. de agua destilada 1.8 1.7 1.7
Dejar en reposo durante 10 minutos y proceder a leer en el espectrofotómetro a 750 nm.

Para realizar los cálculos es necesario considerar la dilución de la muestra problema.
Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la vitamina C en frutas.-
En un tubo de cultivo con tapa rosca medir 2 mL del jugo de fruta diluido y luego colocarlo en
un baño maría a 100º C. Determinar el contenido de vitamina C de acuerdo a la técnica antes
descrita a los 20 minutos y luego a los 40 minutos de incubación, para cuyo propósito se
tomarán alícuotas de 0.1 mL.
En un papel milimetrado graficar el % del contenido de vitamina C en función del tiempo ó el

logaritmo del porcentaje de vitamina C remanente en función del tiempo.
~ 72 ~
PRÁCTICA 12
INFORME
DETERMINACIÓN DE VITAMINA C EN ALIMENTOS VEGETALES
1. Objetivos
2. Resultados
3. Conclusiones
~ 73 ~
ANEXO 1
PREPARACIÓN DE BUFFERS
BUFFER CITRATO (0.1M y 0.2M)
Para obtener soluciones de buffer citrato 0.1M y 0.2M de pH 3 a 6, pese las cantidades que se
indican a continuación de ácido cítrico y de citrato trisódico dihidratado, trasváselas a un matraz
aforado de 100mL y afore con agua destilada.
Fuente: https://books.google.com.pe/books?id=FanXSdIC-
oIC&pg=PA147&dq=tampon+fosfato+preparacion&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiV0ITZt5TOAhUD5yYKHc0AA4wQ6AEIJTAC#v=onepage&q=tampon%20f
osfato%20preparacion&f=false
BUFFER FOSFATO (0.1M y 0.2M)
Preparación de buffer fosfato 0.1M o 0.2M a partir de mezclas de soluciones de NaH2PO4 y

Na2HPO4
En primer lugar se debe preparar:


a) “Buffer fosfato 0.1M”
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.1M a pH de 5.7 a 8, se mezcla las cantidades que se
indican en la tabla de las Soluciones 1 y 2. Luego se completa a un volumen total de 200 mL con
agua destilada.
b) “Buffer fosfato 0.2M”
~ 74 ~
Para obtener las soluciones buffer fosfato 0.2M a pH de 5.7 a 8, únicamente se mezcla las
cantidades que se indican en la tabla de las Soluciones 1 y 2.
Fuente: https://books.google.com.pe/books?id=FanXSdIC-
oIC&pg=PA147&dq=tampon+fosfato+preparacion&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiV0ITZt5TOAhUD5yYKHc0AA4wQ6AEIJTAC#v=onepage&q=tampon%20f
osfato%20preparacion&f=false
~ 75 ~

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Bioquímica I

Autores: Juan Salazar Sánchez

© Derechos Reservados 2012

Diseño, Diagramación e Impresión

Universidad Científica del Sur

Panamericana Sur Km. 19. Lima-Perú 610-6400

Tiraje 1500 ejemplares

Dra. Josefina Takahashi Sato

José Agustín Ortiz Elías

M Sc. Alejandro Fukusaki

Q.F. Juan Salazar Sánchez

Práctica 1. Preparación de soluciones amortiguadoras 9

Práctica 3. Determinación de Ácido Úrico en suero sanguíneo 20

Práctica 4. Determinación de proteínas plasmáticas 24

Práctica 5. Determinación de Hemoglobina, Determinación de Urea en orina 33

Práctica 6. Cálculo del balance Energético / EVALUACIÓN FORMATIVA 38

Práctica 7. Digestión Enzimática del Almidón 47

Práctica 8. Evaluación de la Glicemia 52

Práctica 9 . Efecto del ayuno sobre el contenido de glucógeno hepático 56

Práctica 1 0 . Determinación de triglicéridos y colesterol en plasma 61

Práctica 1 1 . Hidrólisis enzimática de los lípidos 66

Práctica 1 2 . Determinación de Vitamina C en alimentos vegetales 70

Práctica 13. EVALUACIÓN SUMATIVA

LABORATORIO DE QUÍMICA 1, 2, 3 y 4 UCSUR

El Laboratorio es un ambiente físico estratégico donde se desarrolla diferentes

INSTRUCCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

 Llegar puntual a las prácticas (tolerancia 5 minutos).

MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

 Está terminantemente prohibido ingresar a l Laboratorio mochilas, carteras o

ELEMENTOS DE PROTECCIÓN PERSONAL Y DE LOS EQUIPOS

c) EXTINGUIDORES CONTRA INCENDIOS

d) BOTIQUÍN DE PRIMEROS AUXILIOS

 Manipular con habilidad, criterio y en forma adecuada los diferentes materiales de

REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

11mL Hidróxido de sodio NaOH 0.01M

MATERIALES EN LA MESA CENTRAL (DEL PROFESOR)

01 Gotero (25 mL) de ácido clorhídrico concentrado (HCL)

PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DE REACTIVOS

La preparación de todo reactivo expresado en Molaridad (M) se realiza utilizando la siguiente

“Ácido clorhídrico” HCL 0.01M

“Ácido acético” CH3COOH 0.1M

“Hidróxido de amonio” NH4OH 0.1M

“Cloruro de amonio” NH4CL 0.1M

“Solución de albúmina” (micela)

La ecuación de Henderson-Hasselbach, ha sido derivada de la Ley de acción de masas de

HA(ac) <====> (H)1+(ac) + A1−(ac)

Calculando Ka para el ácido débil, HA:

Despejando la concentración de iones hidrógeno se tiene:

Expresión conocida como ecuación de Henderson-Hasselbach, para un ácido débil.

EXPERIMENTO 1.- DETERMINAR el pH TEÓRICO y PRÁCTICO en las

Determinar el valor del pH teórico según la ecuación de Henderson-Hasselbach.

EXPERIMENTO 2.- INFLUENCIA DEL pH EN LA SOLUBILIDAD DE

EXPERIMENTO 3.- NATURALEZA AMORTIGUADORA de la ALBÚMINA

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Apellidos Nombre(s) Mesa Nº Fecha

MATERIALES EN LA MESA DEL ALUMNO

REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

12mL Solución de azul de metileno (10mg/dL)

MATERIALES EN LA MESA CENTRAL (DEL PROFESOR)

PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACIÓN DE REACTIVOS

“Solución azul de metileno” (10mg/dl):

El paso de un haz de luz de una longitud de onda determinada a través de una

La propiedad de una sustancia para absorber radiación de una determinada l o ng i t ud

Io = Luz incidente It = Luz transmitida