Informe sobre la

cuantificación de proteínas
totales en hemolinfa de
abejas melíferas (Apis
Mellífera L.) en época
invernal

Bioq. M. Soledad Garcia paoloni

E.E.A. I.N.T.A. H. Ascasubi

0
 INTRODUCCIÓN

Este trabajo de investigación se desarrolla en el marco del Proyecto

Específico (PE) “Estrategia multidisciplinaria para lograr la colmena que
necesita una apicultura competitiva” que pertenece al Proyecto Integrado
(PI) “Investigación, desarrollo tecnológico e innovación para la mejora de
la competitividad de la cadena apícola” del Programa Nacional Apícola
2009-2012 coordinado por la Dra. M. Alejandra Palacio.

El objetivo general de este PE apunta a obtener la colmena ideal que

necesita la apicultura argentina para ser más competitiva a través del
desarrollo de estrategias multidisciplinarias. Uno de los objetivos
específicos planteados en el mencionado PE consiste en desarrollar
metodologías para estimar el status nutricional, su relación con aspectos
sanitarios y ambientales y con la respuesta productiva. Para ello,
previamente a este proyecto, se estuvo trabajando en la obtención de
hemolinfa (HL) y cuerpos grasos de abejas melíferas en la Fac. Cs.
Veterinarias UNCPBA (Dra. Marina Basualdo, Ing. Cristina García, Laura
Vanagas y Gastón Delpech). Paralelamente se comenzó a poner a punto la
técnica de cuantificación de proteínas totales probando los métodos
cuantitativos con ác. bicinconínico (BCA) y con coomassie G-250 (rvo. de
Bradford). También se desarrollaron técnicas electroforéticas de
determinación de vitelogenina en geles de poliacrilamida. Las muestras
obtenidas procedían de abejas de primavera-verano obtenidas de
colmenas a campo y mantenidas en cajas experimentales en un
laboratorio.

A partir del inicio de esta nueva etapa de proyectos (2009) se comenzó a

practicar la forma de extraer HL de larvas y pupas para la determinación
de proteínas totales. Ante la duda de la determinación del tamaño de
muestra ideal para la correcta interpretación de los resultados obtenidos
se decidió realizar una consulta con un especialista en estadística: MSc.

1
Med. Vet. Edgardo Rodríguez del Área de Bioestadística de la UNCPBA
(Tandil). Como se debía determinar el modelo experimental antes de la
primavera de 2010 se concretó una reunión para el invierno de ese año
junto a la Dra. Graciela Rodríguez. El objetivo de la consulta sería
determinar el número de colmenas a ensayar y la cantidad de abejas que
representarían la situación nutricional de toda la colmena.

Asumiendo que las abejas que integran la población de una colmena en

época invernal es “pareja” desde el punto de vista de proteína circulante
en HL (no existen diferencias etarias ni fisiológicas) se decidió realizar un
ensayo en agosto de 2010 al que, luego de obtener la cuantificación
proteica, se le haría el análisis estadístico.

1. DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO:

Se trabajó con 15 colmenas del apiario de la EEA INTA H. Ascasubi en

buenas condiciones sanitarias (libres de varroa y con muy bajo o nulo
nivel de recuento esporular de nosema). Asimismo se consideró que
tuvieran situaciones similares de población y reservas.

De cada colmena se tomó una muestra de abejas para obtener dos pooles
de HL. A su vez cada pool fue procesado por duplicado al momento de la
determinación cuantitativa de proteína (mét. de Bardford). Ver resultados
en el Anexo II.

El análisis estadístico consistió en estudiar las estimaciones de los

componentes de variancia para cada fuente de variación realizadas por
distintos métodos. Todos los métodos arrojaron resultados similares (ver
Anexo III). La conclusión se basó en las estimaciones obtenidas por
Máxima Verosimilitud Restringida (REML). La mayor variación estaba
dada por el efecto colmena. Dentro de la colmena, las muestras (pool de
abejas) presentaron una variación importante, mayor que la variación
debida a la técnica. Por lo tanto se recomendó realizar más pooles de

2
abejas por colmena y suprimir los duplicados al momento de las
determinaciones químicas.

En las páginas siguientes se describe los diferentes procedimientos

realizados desde la toma de muestra de abejas a campo hasta la técnica
utilizada en el laboratorio para la cuantificación de proteínas totales.

2. TOMA DE MUESTRA: Recolección de abejas en el apiario

Se colectan aproximadamente 40 abejas del interior de una colmena en

un frasco plástico con tapa a rosca. El mismo debe poseer algunas
perforaciones en las paredes como así también en la tapa para permitir la
entrada de aire. Asimismo debe estar rotulado con el número de colmena
de la que se tomó la muestra. En estas condiciones se traslada hasta el
laboratorio para su inmediato procesamiento.

No se tomarán más muestras de las que se puedan procesar en el día ya

que para la extracción de hemolinfa (HL) las abejas no pueden estar
muertas y no se pueden conservar con ningún líquido conservante ni
congeladas.

3
 3. EXTRACCIÓN DE HEMOLINFA EN EL LABORATORIO:

Tomar uno de los frascos y llevarlo unos minutos al congelador o freezer

con el fin de “anestesiar” las abejas. De esta manera pierden movilidad y
es más sencillo proceder a extraerles la HL. Se debe evitar que lleguen al
punto de congelación total (considerar una exposición al frío entre 5 y 10
minutos según el equipo utilizado).

Mientras tanto rotular 2 recipientes tipo eppendorf con la siguiente

numeración: nº de col. y nº de col. prima además de la fecha. Esto es
porque de cada frasco perteneciente a una colmena se realizarán dos
pooles de HL de abejas.

Ej: Colmena 2: se tomarán muestras de 40 abejas aproximadamente y se

obtendrán los pooles de HL 2 y 2` respectivamente.

Cada pool de la colmena muestreada contendrá la HL de 8 a 15 abejas tratando

de juntar un volumen aproximado de 50 ul (volúmenes muy variables en cada
abeja).

El método de extracción se realiza en base a una modificación de la descripta por

Chan, Howes & Fosters en su trabajo “Quantitative comparision of caste
differences in honeybee hemolymph” en la que se utilizan microcapilares
introducidos entre el 2º y 3º tergito del abdomen de la abeja. Dicho
4
procedimiento favorece la obtención de la HL por capilaridad. La variación de
esta técnica se debe a que se demoraba mucho tiempo en vaciar el volumen de
HL en el recipiente tipo eppendorf en el que se reservaría hasta el momento de la
cuantificación de proteínas. Esta situación se resolvió realizando una pequeña
incisión con una aguja entomológica entre los mencionados tergitos a partir de la
cual se obtiene una gota de HL de tamaño variable (de aquí la diferencia de
volumen obtenido por abeja).

Punción con aguja entomológica Extracción con micropipeta

Esta gota se extrae con una pipeta automática utilizando tips previamente
embebidos con una solución de N- feniltiourea (grado I 98%) al 0,1 % P/V. La
utilización de esta droga funciona como antioxidante de la HL obtenida que
comienza a oscurecerse a los pocos minutos de su obtención. Si bien la N-
feniltiourea retrasa este proceso conviene realizar el armado de cada pool lo
más rápido posible y llevar al freezer hasta el momento de la cuantificación de
proteínas.
La punción debe evitar romper tanto el buche melario como la ampolla rectal
para obtener HL lo más pura posible (líquido de aspecto acuoso, incoloro y
límpido). Si la gota obtenida es muy viscosa o amarillenta se descarta la abeja
como así también el tip utilizado.

5
 Muestras de HL en diferentes estados de oxidación

4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES:

La determinación de proteínas totales se realizó por el método de Bradford

(1976) utilizando una curva de calibración con estándar de seroalbúmina
bovina (BSA).
El método de Bradford es un método colorimétrico rápido para la
cuantificación de proteínas totales. El reactivo contiene principalmente
Coomassie G-250 que en medio ácido (ác fosfórico incluído en el reactivo) se
une a las proteínas. Esto provoca un desplazamiento espectral de la forma
rojizo amarronado del colorante (con máxima absorbancia a 465 nm) a la
forma azul del mismo (cuyo pico máximo de absorbancia es de 610 nm).

La diferencia entre las dos formas del colorante es mayor a 595 nm por lo que
se la considera la longitud de onda óptima para medir el color azul
desarrollado por la formación del complejo colorante-proteína (Cc-p). Si se
6
deseara podría medirse el color azul de dicho complejo a cualquier longitud
de onda comprendida entre 575 y 615 nm aunque en los mencionados valores
extremos existe una pérdida del 10% en la medida del color desarrollado
comparada con la obtenida a 595nm.
El desarrollo de color obtenido en la reacción de formación del Cc-p se ha
asociado con la presencia de ciertos aminoácidos básicos (principalmente
arginina, lisina e histidina) en la proteína, aunque también participan en dicha
unión las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrofóbicas. El número
de ligandos (Ver anexo IV) del colorante Coomassie que se une a cada
molécula de proteína es aproximadamente proporcional a la cantidad de
cargas positivas encontradas en esa proteína. Los aminoácidos libres,
péptidos y proteínas de bajo peso molecular no desarrollan color con
reactivos a base de colorante Coomassie; en general para la correcta
utilización de este reactivo, la masa del péptido o proteína a cuantificar debe
ser al menos de 3.000 daltons.

Curva de calibración:
Se arma una batería de 11 tubos de vidrio que se rotulan de la siguiente
manera: uno de ellos como “0” o “B” (blanco de reactivo) y 10 tubos más que
se marcan con números del 1 al 10 en el que se colocarán cantidades
crecientes de un patrón o solución estándar (st.) de concentración conocida.
En este caso se utilizó seroalbúmina bovina (SAB).
Se procesan de igual manera y en el mismo tiempo que las muestras incógnita.
A las lecturas de absorbancia obtenidas (leídas contra blanco de agua) se les
resta el blanco de reactivo.
Con estos valores se realiza una curva de concentración st. vs. absorbancia a
595 nm de la que se interpolarán los valores de las muestras incógnita.
Es conveniente realizar una curva de calibración cada vez que se procese una
batería de muestras de concentración desconocida.

7
 Curva calibración

0,600
y = 0,0266x + 0,0021
0,500

Abs. 595 nm
0,400

0,300

0,200

0,100

0,000
0 5 10 15 20 25

Conc. SAB

Reactivo de Bradford:

Para la preparación del reactivo se necesita:

Reactivo Cantidades para

Coomassie BBG 5 mg 10 mg 25 mg 100 mg
Etanol 95% 2,4 ml 4,75 ml 12 ml 48 ml
Ac. Fosfórico 85% P/V 5 ml 10 ml 25 ml 100 ml
Agua destilada c.s.p. 50 ml c.s.p. 100 ml c.s.p. 250 ml c.s.p. 1000 ml

Procedimiento de preparación:
1. Disolver muy bien el Coomassie en el etanol.
2. Agregar el Ac. Fosfórico y llevar a volumen con agua destilada.
3. Filtrar dos veces con papel de filtro Whatman Nº 1
4. Guardar en frasco oscuro y en la heladera.

Si el reactivo fue preparado con mucha anticipación conviene volver a filtrar

antes de usarlo. En el caso de utilizarse frecuentemente se aconseja mezclar
bien con suaves movimientos de inversión de la botella repitiendo este
movimiento varias veces sin agitar ya que debe prevenirse la formación de
espuma.

8
Asimismo el reactivo siempre debe alcanzar la temperatura ambiente antes de
su uso y tratar de mantener dicha temperatura constante durante el tiempo
que lleve el desarrollo de color hasta la finalización de la lectura de
absorbancias. Variaciones de la temperatura del reactivo en las diferentes
etapas de la reacción química influyen directamente en las mediciones
espectrofotométricas.
El material de vidrio que se utilizará para la cuantificación debe estar
perfectamente limpio. Se recomienda el uso de detergente no iónico y un
enjuague con abundante agua destilada para el acondicionamiento del mismo.
Esto se debe a que la mayoría de los detergentes iónicos causan interferencias
en el desarrollo de color (disminución) y, en algunos casos, pueden llegar a
producir la precipitación del reactivo.
El colorante coomassie puede teñir el vidrio de los tubos y las cubetas de
cuarzo usadas para realizar las lecturas en el espectrofotómetro. En el último
caso es recomendable el uso de cubetas de poliestireno para que no se
produzcan errores al momento de realizar los registros de absorbancia.

Técnica de laboratorio:
Se utilizan diluciones (1:10) de la muestra de HL original. Para ello se
preparan los tubos en los que se realizarán las mismas mientras se
descongelan las muestras que permanecieron freezadas. Se emplean
recipientes tipo eppendorf debidamente rotulados a los que se les incorpora
agua bidestilada. Una vez que la HL alcanza totalmente el estado líquido se
homogeiniza (preferiblemente con uso de vortex) y se realizan las diluciones
pertinentes. En este paso es crucial no dejar pasar mucho tiempo desde que la
HL es descongelada ya que rápidamente comienza a oscurecerse (oxidación).
Es recomendable tener todos los tubos de vidrio en los que se desarrollará la
reacción de color preparados con los correspondientes rótulos (incluídos los
de la curva patrón y el blanco de reactivo) para proceder a cargar los mismos
con las diluciones en el menor tiempo posible.
En los tubos destinados a las muestras se pipetean entre 3 y 5 ul de las
diluciones. La reacción de color se inicia con el agregado de 1 ml del reactivo
de Bradford. Es importante agitar los tubos luego de este paso evitando la
formación de espuma (es ideal el uso de vortex).

9
Luego de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente se considera que
la proteína existente en la muestra se unió al colorante desarrollando color
azul. Volver a pasar por el vortex todos los tubos antes de leer las
absorbancias a 595nm.
Considerar la utilización de cubetas de poliestireno en perfecto estado y
perfectamente limpias (transparentes) por lo se deberán descartar las que se
encuentren teñidas y/o rayadas para evitar errores de lectura.
Como las absorbancias se leen luego de llevar a cero el espectrofotómetro con
agua destilada, se registra el valor obtenido del blanco del reactivo (tubo “B” o
“0”) y luego se resta este valor a las demás absorbancias obtenidas.
Realizar la curva de calibración para determinar los valores de concentración
de proteína de las muestras incógnita (Ver técnica resumida en Anexo I).
En el caso que las lecturas obtenidas escapen a la linealidad de la curva de
calibración (obtención de valores negativos o de valores mayores al último
punto de la sustancia patrón) se deberá cambiar el valor de los ul de HL
diluída cargado en el correspondiente tubo en mayor o menor cantidad
respectivamente.

10
 ANEXO I

Técnica resumida de determinación de proteínas totales en HL de abejas

melíferas en época invernal:

TOMA DE MUESTRA:
 Se toman 40 abejas de una colmena y se arman dos pooles de hemolinfa
de cada una.
 Se mantienen en el freezer debidamente rotuladas hasta su
procesamiento químico.

CUANTIFICACIÓN QUÍMICA:
1. Descongelar la hemolinfa. Homogeneizar con vortex.
2. Preparar las diluciones 1:10 de las muestras incógnita.
3. Pipetear 3/5 ul de las diluciones de cada muestra en los respectivos
tubos. Asimismo cargar cantidades crecientes de la solución st. en los
tubos de la curva patrón (excepto en el destinado a “B”: blanco de
reactivo).
4. Agregar 1ml de reactivo de Bradford (previamente filtrado u
homogeneizado según la frecuencia de uso) a todos los tubos. Agitar con
vortex. Recordar que el reactivo debe estar a temperatura ambiente
durante el desarrollo de la cuantificación.
5. Incubar la batería de tubos 10 min. a temperatura ambiente para el
completo desarrollo de color de la reacción.
6. Leer las absorbancias a 595 nm contra blanco de agua (Antes de la
lectura espectrofotométrica volver a agitar todos los tubos con vortex).
7. Restar el valor del blanco (“B”) a todas las lecturas.
8. Realizar la curva de calibración.
9. Determinar las concentraciones de las muestras incógnitas.

11
 ANEXO II

Resultados de la determinación cuantitativa de proteínas totales (mét. de Bradford)

en HL de abejas en época invernal sobre el que se realizó análisis estadístico.

Colmena Muestra (Pool) Duplicado muestra ug/ul Promedio pool

2 1 1.1 13,05 14,63
1.2 16,21
2 2.1 24,93 25,27
2.1 25,60
15 1 1.1 18,62 19,93
1.2 21,24
2 2.1 21,24 23,26
2.1 25,27
26 1 1.1 25,27 28,93
1.2 32,58
2 2.1 31,78 33,09
2.1 34,40
28 1 1.1 20,44 24,06
1.2 27,68
2 2.1 19,03 23,36
2.1 22,18
31 1 1.1 21,71 21,11
1.2 20,50
2 2.1 23,72 27,42
2.1 31,11
33 1 1.1 20,50 22,25
1.2 23,99
2 2.1 19,43 21,28
2.1 23,12
39 1 1.1 32,18 33,96
1.2 35,74
2 2.1 36,68 36,95
2.1 37,21
40 1 1.1 18,15 20,13
1.2 22,11
2 2.1 23,05 26,61
2.1 30,17

12
59 1 1.1 15,92 16,90
1.2 17,88
2 2.1 9,22 9,50
2.1 9,78
73 1 1.1 26,98 26,79
1.2 26,59
2 2.1 27,77 26,65
2.1 25,53
87 1 1.1 20,61 21,54
1.2 22,46
2 2.1 20,45 22,01
2.1 23,58
90 1 1.1 31,68 31,70
1.2 31,73
2 2.1 35,81 32,04
2.1 28,27
109 1 1.1 33,35 33,91
1.2 34,47
2 2.1 35,81 35,45
2.1 35,08
115 1 1.1 27,93 31,34
1.2 34,75
2 2.1 22,51 24,05
2.1 25,59
63 1 1.1 25,81 25,53
1.2 25,25
2 2.1 20,50 22,35
2.1 24,19

13
 ANEXO III

Resultados del análisis estadístico realizado por el Vet. Edgardo Rodríguez

(UNCPBA).

Estimaciones de variancia para cada fuente de variación realizadas por distintos

métodos.

Variance Component Type 1 MIVQUE(0) ML REML

Var(colmena) 30.49829 30.22428 27.80365 29.83120

Var(muestra(colmena)) 8.29361 8.29361 9.60819 9.62042

Var(tecnica(muestra)) 2.45184 1.35578 1.75166 1.90208

Var(Error) 5.35229 6.44835 5.37387 5.36704

Variance Components Estimation Procedure

Class Level Information

Class Levels Values

colmena 15 2 15 26 28 31 33 39 40 59 63 73 87 90 109 115

muestra 2 12

tecnica 2 12

14
 Number of Observations Used 60

Dependent Variable: Proteinas

Type 1 Analysis of Variance

Source DF Sum of Squares Mean Square Expected Mean Square

colmena 14 2015.057424 143.932673 Var(Error) + 2 Var(muestra(colmena))

+ 4 Var(colmena)

muestra(colmena) 15 365.870043 24.391336 Var(Error) + Var(tecnica(muestra)) + 2

Var(muestra(colmena))

tecnica(muestra) 2 84.259673 42.129836 Var(Error) + 15 Var(tecnica(muestra))

Error 28 149.864096 5.352289 Var(Error)

Corrected Total 59 2615.051236

15
 ANEXO IV

Definición de ligando

I. En un compuesto inorgánico de coordinación, cada átomo o grupo de átomos

que está unido al átomo central.
II. Molécula, grupo, ión o átomo que está unido de forma covalente o no
covalente a una entidad molecular (que puede ser poliatómica), considerada
de forma arbitraria ‘central’ con respecto al ligando. Por ejemplo, un protón
(H+) puede ser ligando de una proteína, del citrato o del ión superóxido O2-.
Puede ser incluso ligando de una entidad monovalente, como el acetato; en
otras circunstancias, se considera que el acetato (AcO-) es ligando del H+,
dado que la definición de entidad central es arbitraria y puede cambiar por
conveniencia. Así, los ligandos de la calmodulina son cuatro iones de calcio si
la proteína se considera la entidad central, pero también puede decirse que
los ligandos de los iones de calcio son los grupos carboxilatos de la
calmodulina si el ión de calcio se considera la entidad central. Otros ejemplos
de sistemas de ligando-entidad central son los complejos constituidos por un
antígeno y un anticuerpo, una hormona y un receptor o un sustrato y una
enzima.

16