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02-03-2018

BIOQUÍMICA CLÍNICA Y DIAGNÓSTICO


DE LABORATORIO I
Mónica Brito Wittwer
Clase 2

MIBW, 2018 1

Fases de un examen de laboratorio

Pre - Analítica Analítica Post - Analítica

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Métodos instrumentales de análisis


usados en BQ Clínica

Técnicas
Métodos
Electroforesis inmunométricas
electroquímicos
(inmunológicas)

Técnicas
Cromatografía
fotométricas

¿Cuantitativas?
¿Semi-cuantitativas?
¿Cualitativas? MIBW, 2018 4

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Técnicas fotométricas
Basadas en la interacción de las radiaciones
electromagnéticas con las moléculas

MUY Importantes en BQ Clínica

Espectrofotometría de absorción UV-visible


Turbidimetría
Nefelometría

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Recordar
• Lab. Bioquímica básica
• Clase de Instrumentación
• Espectro electromagnético
• Absorbancia
• Transmitancia
• Ley de Lambert - Beer

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Interacción entre ondas


electromagnéticas y moléculas

Luz incidente
Luz transmitida

Luz absorbida

Luz reflejada

Luz dispersada

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¿Qué tipo de “luz”?

Espectrofotometría
Colorimetría (moléculas coloreadas)

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Ley Lambert Beer


A = εcl
Absorbancia es directamente proporcional a la
concentración del analito

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Espectrofotómetro - Fotómetro

Selector de Cubeta Detector Sistema de


Lámpara
longitud de onda registro
LUZ BLANCA
LUZ POLICROMÁTICA
Tungsteno: VIS – UV cercano (360-950nm)
Hidrógeno y Deuterio: UV (220 a 360nm)

FILTRO (FOTÓMETRO)
MONOCROMADOR (ESPECTROFOTÓMETRO)

Vidrio: 320-950 nm
Plástico: 320-950 nm
Cuarzo: <320 nm (Ac. Nucleicos)
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Ley Lambert Beer


A = εcl
Absorbancia es directamente proporcional a la
concentración del analito

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Selección del analito

Medición de
Absorbancia del
producto de una
reacción
química/enzimática
donde participa la
molécula de interés y
se genera un producto
medible

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Curva calibración
¿Cómo cuantificar? Calibrador o estándar

Calibrador
Estándar
Solución de concentración
conocida del analito

Curva de calibración Analito en Calibrador  Abs. Calibrador


m = pendiente Analito en Muestra  Abs. Muestra
n = coef. posición

Ecuación de la recta
y = mx + n
y = mx
Regla de tres
A = mC
FACTOR x Abs. Muestra
C = A/m MIBW, 2018 14

Etapas

Desarrollar técnica

Calibrar Técnica

Controlar Técnica

Procesar Muestras

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Blancos
Blanco de agua (Abs del agua)
Blanco de reactivo (Abs reactivo)
Blanco de muestra (Abs muestra s/rx)

Calibración de Técnicas
Solución Estándar
Calibrador Universal

Control de Técnicas
Control Normal
Control Patológico

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Controles
• Control calidad interno:
– Uso de Control Normal y Control Patológico
– Carta control de Levey-Jennings
– Reglas de Westgard

• Control calidad externo


– Programa externo de evaluación de calidad
(PEEC), ISPCH

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Carta control de Levey-Jennings


Método gráfico que muestra los resultados de los controles.
Los resultados se grafican secuencialmente en el tiempo (eje X),
y el resultado de la medición (eje Y).

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Reglas de Westgard
Serie de reglas de control usadas en el
procedimiento de control de calidad para
analizar la medición del control

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En este curso: 13s

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Clasificaciones de técnicas usadas en


Fotometría UV-visible
Punto final Visible
Química
Dos puntos (Colorimétricas)
Enzimática
Cinética UV

Crecientes Detección de formación de producto


Decrecientes Detección de desaparición de sustrato

Directa (Una Rx) Detección analito


Indirecta (Rxs acopladas) Determinación actividad enzimática

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Química
Enzimática

Albúmina + Verde de Bromocresol (BCG)  Complejo BCG-Albúmina


l 630nm

l 405nm

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Detección analito
Directa (Una Rx)
Determinación actividad
Indirecta (Rx acopladas, Rx “reveladora) enzimática

l 500nm

l 405nm

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Curva de progreso de una reacción


enzimática

Cinética enzimática
se estudia en
estado estacionario

Estado estacionario
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Visible
Crecientes Detección de formación de producto
(Colorimétricas)
Decrecientes Detección de desaparición de sustrato
UV

Fosfatasa Alcalina

Creciente, relación directa Absorbancia – Actividad enzimática 405 nm

¿Reactivos vs Muestra?

Lactato deshidrogenasa

NADH = 340nm Decreciente, relación inversa Absorbancia – Actividad enzimática

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Espectro de absorción NAD+ y NADH

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Punto final
Dos puntos
Cinética

Dos puntos • A
Cinética
• DA/min

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CK

determinación = 340nm

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Colesterol

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Caracterización de cada técnica


(características de desempeño)
1. Límite de detección (“sensibilidad”)
2. Linealidad
3. Estabilidad de la muestra
4. Reactivo listo para usar o se debe preparar
5. Estabilidad de reactivos
6. Efecto de interferentes
7. Estabilidad de la reacción
8. Precisión
9. Repetibilidad
10. Reproducibilidad
11. Exactitud
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Límite de detección: es el valor mínimo de la magnitud que puede


medir dicho procedimiento (“sensibilidad”)

Linealidad: es el valor máximo de la magnitud que puede medir


dicho procedimiento
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Impreciso e Precisión (Imprecisión): grado


inexacto de dispersión de los resultados
obtenidas bajo condiciones
específicas (parámetros
estadísticos que la definen:
desviación estándar y
Preciso e coeficiente de variación).
inexacto

Exactitud (Inexactitud): grado de


concordancia entre el resultado
Preciso y de una medición y el valor
Exacto verdadero.
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Desviación estándar –
Coeficiente de variación

• Repetibilidad
• Reproducibilidad
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-.Clasificar y definir componentes de reactivos y


de muestra.-

Determinación de
Glucosa plasmática

Determinación de LDH
plasmática

Determinación de
CK plasmática

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Turbidimetría y Nefelometría

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Turbidimetría
Inmunoturbidimetría (ag – ac)

• La turbidimetría mide la reducción de la intensidad de la luz en su paso a través de una


suspensión, a causa de las partículas presentes en esta.

•Determinación de proteínas totales en LCR u orina (haciendo que las proteínas precipiten
con TCA o ácido sulfosalicílico)

•Uso de fotómetro.-

Inmunoturbidimetría

MAU
PCR
ASLO
Factor reumatoídeo
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Nefelometría
Inmunonefelometría (Ag – Ac)
• La nefelometría mide la luz desviada en diversos ángulos (entre
15º y 90º) por las partículas presentes en esta suspensión.

• Nefelómetro  las lecturas se dan en NTU (Unidades


Nefelométricas de Turbidez)

• Se suele utilizar para


soluciones con
concentraciones
más diluidas

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