Trombose e Hemostase

Escola Superior de Saúde
Politécnico do Porto
Relatório de Estágio
Hemostase
Sérgio José Pinto Teixeira

10120508
Análises Clínicas e Saúde Pública, 4º Ano
26 de setembro a 21 de outubro de 2016
Índice Geral
ÍNDICE GERAL ....................................................................................................................................................... II
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................. IV
ÍNDICE DE QUADROS............................................................................................................................................ V
SIGLAS E ABREVIATURAS..................................................................................................................................... VI
INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................................... 1
ENQUADRAMENTO TEÓRICO - HEMOSTASE ........................................................................................................ 3

RESPOSTA VASCULAR .................................................................................................................................................... 3
HEMOSTASE PRIMÁRIA ................................................................................................................................................. 3
Adesão e ativação plaquetárias .......................................................................................................................... 3
Secreção e agregação plaquetárias .................................................................................................................... 4
HEMOSTASE SECUNDÁRIA .............................................................................................................................................. 6
Fase de iniciação ................................................................................................................................................. 7
Fase de amplificação ........................................................................................................................................... 7
Fase de propagação ............................................................................................................................................ 8
MECANISMOS DE REGULAÇÃO ........................................................................................................................................ 9
Antitrombina ..................................................................................................................................................... 10
Proteína C .......................................................................................................................................................... 10
Proteína S .......................................................................................................................................................... 11
Fator inibidor da via do fator tecidual .............................................................................................................. 12
Prostaciclina ...................................................................................................................................................... 13
Óxido nítrico ...................................................................................................................................................... 13
Ecto-ADPase (CD39) .......................................................................................................................................... 13
Fibrinólise .......................................................................................................................................................... 13
ENSAIOS LABORATORIAIS .................................................................................................................................. 16
AMOSTRAS PARA ESTUDOS DE COAGULAÇÃO ................................................................................................................... 16
RECEÇÃO DE AMOSTRAS .............................................................................................................................................. 17
VERIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS NO LAB-4 ......................................................................................................................... 18
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ................................................................................................................................. 18
ANÁLISES AUTOMÁTICAS ............................................................................................................................................. 19
Testes de rastreio .............................................................................................................................................. 20
Tempo de protrombina (TP) / Teste de Quick (TQ) ..........................................................................................................20
International Normalized Ratio (INR) ...............................................................................................................................20
Tempo de Trombina .........................................................................................................................................................21
Tempo de Reptilase ..........................................................................................................................................................22
Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (aPTT) ...........................................................................................................23
Mistura de estudos (D+N) ................................................................................................................................................24
Tempo de protrombina e proconvertina (P&P)................................................................................................................24
Valores de referência .......................................................................................................................................................25
Testes específicos .............................................................................................................................................. 25
Fibrinogénio .....................................................................................................................................................................25
Fatores da coagulação ......................................................................................................................................................25
Antitrombina ....................................................................................................................................................................26
Proteína C .........................................................................................................................................................................27
Proteína S .........................................................................................................................................................................28
RPCA .................................................................................................................................................................................29
D-dímero ..........................................................................................................................................................................30
Anticoagulante lúpico ......................................................................................................................................................31
ii
Relatório de estágio – Trombose e Hemostase
Fator de von Willebrand...................................................................................................................................................33

Doseamento de FvW (FvW:Ag) ....................................................................................................................................34
Determinação da atividade coagulante do FVIII (FVIII:C) .............................................................................................34
Atividade cofatora da ristocetina (VWF:RCo) ..............................................................................................................35
Anti-Xa ..............................................................................................................................................................................35
Valores de referência .......................................................................................................................................................36
ANÁLISES SEMIAUTOMÁTICAS ....................................................................................................................................... 37
Avaliação da função plaquetária. ..................................................................................................................... 37
Tromboelastografia/Tromboelastometria ........................................................................................................ 38
TESTES IMUNOENZIMÁTICOS ........................................................................................................................................ 41
Deteção de anticorpos anti heparina/PF4 ........................................................................................................ 41
Deteção de anticorpos anti plaquetários .......................................................................................................... 43
CONTROLO DA QUALIDADE ............................................................................................................................... 44
CONTROLO DA QUALIDADE INTERNO ............................................................................................................................. 44
CONTROLO DA QUALIDADE EXTERNO ............................................................................................................................. 44
VALIDAÇÃO E ENVIO DE RESULTADOS ............................................................................................................................. 45
CONCLUSÃO ....................................................................................................................................................... 46
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................................................... 47
iii
Índice de Figuras
Figura 1. Base bioquímica da ativação e secreção plaquetárias-------------------------------------------------5
Figura 2. Representação esquemática da cascata da coagulação------------------------------------------------6
Figura 3. Fases da coagulação de acordo com a nova cascata---------------------------------------------------7
Figura 4. Visão atual da cascata da coagulação--------------------------------------------------------------------9
Figura 5. Complexos procoagulantes Protrombinase e Tenase Intrínseca------------------------------------11
Figura 6. Representação esquemática do processo de fibrinólise----------------------------------------------14
Figura 7. Gráfico para a correção do volume de anticoagulante-----------------------------------------------17
Figura 8. Equipamentos para análise automática no Lab-4-----------------------------------------------------19
Figura 9. Investigação do Tempo de Trombina prolongado----------------------------------------------------22
Figura 10. Investigação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada prolongado------------------------23
Figura 11. Investigação da presença de LA no plasma----------------------------------------------------------33
Figura 12. Traçado tromboeslastométrico e seus parâmetros--------------------------------------------------39
Figura 13. Kit de imunoensaio “STic Expert® HIT------------------------------------------------------------41
Figura 14. Princípio do método do Kit de imunoensaio ELISA “Asserachrom HPIA – IgG”------------42
Figura 15. Programas de CQE em que o Lab-4 participa. -----------------------------------------------------44
iv
Índice de Quadros
Quadro 1. Agonistas fisiológicos para a ativação plaquetária---------------------------------------------------4
Quadro 2. Mecanismos antitrombóticos naturais das células endoteliais--------------------------------------9
Quadro 3. Possíveis causas para ocorrência de fenómenos trombóticos--------------------------------------12
Quadro 4. Equipamentos de análise automática e semi-automática do Lab-4-------------------------------19
Quadro 5. Valores de INR a manter relativamente à condição clínica----------------------------------------21
Quadro 6. Patologias associadas a INR prolongado-------------------------------------------------------------21
Quadro 7. Avaliação de alterações hemostáticas com três testes de rastreio---------------------------------24
Quadro 8. Valores de referência de alguns testes executados no Lab-4--------------------------------------25
Quadro 9. Deficiência congénitas da antitrombina--------------------------------------------------------------26
Quadro 10. Deficiência congénitas de PC------------------------------------------------------------------------27
Quadro 11. Deficiência congénitas de PS-------------------------------------------------------------------------28
Quadro 12. Apresentação de resultados para o teste da RPCA------------------------------------------------30
Quadro 13. Valores de referência de alguns testes específicos executados no Lab-4. ---------------------36
Quadro 14. Interpretação do traçado tromboelastográfico------------------------------------------------------39
Quadro 15. Validação dos resultados analíticos-----------------------------------------------------------------45
v
Siglas e abreviaturas
ADP – adenosina difosfato
AMP – adenosina monofostato
AMPc – monofosfato de adenosina cíclico
aPTT – tempo de tromboplastina parcial ativado
AT – antitrombina
C4b-BP – proteína ligada ao C4b
CHSJ – centro hospitalar de São João
CQE – controlo da qualidade externo
CQI – controlo da qualidade interno
DIC – coagulação intravascular disseminada
DRVVT – “dilute Russell’s viper venon”
DvW – doença de von Willebrand
EP - embolismo pulmonar
FIX – fator IX
FIXa – fator IX ativado
FT – fator tecidual
FV – fator V
FVa – fator V ativado
FVII – fator VII
FVIIa – fator VII activado
FVIII – fator VIII
FVIIIa – fator VIII activado
FVLeiden – fator V de Leiden
FvW – fator de von Willebrand
FX – fator X
FXa – fator X activado
FXI – fator XI
FXIa – fator XI activado
FXII – fator XII
FXIIa – fator XII activado
FXIII – fator XIII
FXIIIa – fator XIII ativado
HBPM – heparina de baixo peso molecular
HIT – Trombocitopenias induzidas por heparina
HMWK – cininogénio de alto peso molecular
HNF – heparina não fracionada
INR – international normalized ratio
LA – anticoagulante lúpico
Lab-4 – laboratório de trombose e hemostase do SIH do CHSJ
LES – lupus eritematoso sistémico
LMWH – heparina de baixo peso molecular
NO – óxido Nítrico
vi
NOAC – novos anticoagulantes orais

OMS – organização mundial de saúde
P&P – tempo de protrombina e proconvertina
PAI – inibidores dos ativadores do plasminogénio
PC – proteína C
PCA – proteína C ativada
PFA –
PGI2 – Prostaciclina
pNA – paranitroanilina
PPP – plasma pobre em plaquetas
PS – proteína S
rpm – rotações por minuto
SIH – serviço de imunohemoterapia
TA – temperatura ambiente
TA2 – tromboxano A2
TACSP – técnico de análises clínicas e saúde pública
TAFI – fator inibidor de fibrinólise mediado pela trombina
TEV – trombose venosa profunda
TFPI – fator inibidor da via do fator tecidual
TP – tempo de protrombina
tPA – ativador do plasminogénio tecidual
TQ – teste de Quick
TR – tempo de reptilase
TT – tempo de trombina
UFH – heparinas não fraccionadas
UK – urocinase
VVR – veneno de víbora de Russel
vii
Introdução
Serve o presente relatório para descrever, sinteticamente, o trabalho realizado ao longo

do estágio da valência de Trombose e Hemostase, que faz parte da Unidade Curricular de
Educação Clínica III, e relacioná-lo com os conhecimentos apreendidos.
A Educação Clínica III é uma unidade curricular de regime obrigatória e anual, inserida
no plano de estudos do 4º ano da Licenciatura de Análises Clínicas e Saúde Pública da Escola
Superior de Saúde do Porto (ESS) do Politécnico do Porto (P. Porto).
O estágio proporciona ao aluno, futuro profissional de Análises Clínicas, o contacto
alargado com a prática profissional, permitindo que este aprofunde e integre os conhecimentos
adquiridos ao longo da sua formação académica, no âmbito do exercício profissional,
supervisionado.
Realizado num período de quatro semanas, de 26 de setembro a 21 de outubro de 2016,
no Serviço de Imunohematologia (SIH) do Centro Hospitalar de São João - EPE Porto (CHSJ) e
orientado pelo Técnico de Análises Clínicas e Saúde Pública deste serviço, Dr. Fábio
Guimarães.
O SIH, é o serviço do CHSJ responsável por colher, estudar, processar e armazenar
sangue humano e/ou seus componentes com o objetivo de os transfundir a doentes que deles
necessitam. Também é da responsabilidade deste serviço, o diagnóstico e tratamento de
coagulopatias congénitas e adquiridas, bem como o dos estados de hipercoagulabilidade e
trombofilia. Este serviço, que faz parte do Centro de Medicina Laboratorial do CHSJ
(juntamente com os serviços de Anatomia Patológica e Patologia Clínica) engloba o
processamento de dádiva e os laboratórios de Imunohematologia (Lab-1), Imunoquímica (Lab-
2), Hemostase (Lab-4), e Biologia Molecular (Lab-5).
Os objetivos desta valência de estágio são os seguintes:
 compreender o funcionamento do laboratório de hemostase:
 tomar conhecimento dos testes realizados e dos estudos;
 compreender o princípio dos métodos usados para determinação do Tempo de
Protrombina (TP), do Tempo de Tromboplastina Parcialmente ativado (aPTT) e do
Fibrinogénio nos diferentes equipamentos;
 compreender a seleção de métodos de avaliação e diagnóstico de doenças
tromboembólicas (ex: Proteína C antigénica, Proteína C funcional, Proteína S,
Antitrombina, Resistência da Proteína C Ativada, anticorpos antifosfolípidos);
1
 proceder à realização de métodos de avaliação e diagnóstico de doenças hemorrágicas:

doseamento de fatores (das vias intrínseca e extrínseca) e despiste da doença de von
Willebrand.;
 tomar conhecimento do controlo de qualidade usado;
 interpretar os resultados face ao método laboratorial utilizado e ao diagnóstico clínico;
 compreender o processo de validação de resultados.
2
Enquadramento Teórico - Hemostase

A hemostase consiste num conjunto de processos estreitamente regulados que
governam a coagulação sanguínea, a ativação plaquetária e a reparação vascular(1). Na
sequência de uma lesão num vaso sanguíneo, os mecanismos hemostáticos desencadeados
permitem controlar a hemorragia, reparar os tecidos lesados e restabelecer as funções perdidas,
mantendo a fluidez do sangue(2). A existência de um desequilíbrio entre estes mecanismos pode
desencadear fenómenos trombóticos ou hemorrágicos(1)(3)(4).
O sistema hemostático depende de complexas interações, que envolvem componentes
celulares e bioquímicos, entre o endotélio vascular, as plaquetas e os processos de coagulação e
fibrinólise(5).
As três principais fases do mecanismo da hemostase são:
 Resposta vascular – constrição do vaso lesado;
 Hemostase primária – formação do trombo plaquetário;
 Hemostase secundária – formação do coágulo de fibrina(5).
Resposta Vascular
Em resposta a uma lesão, há uma constrição das paredes do vaso sanguíneo(4)(5). Essa
vasoconstrição permite que haja uma redução do fluxo sanguíneo na área afetada, mantendo-se
as superfícies endoteliais opostas unidas entre si(1). Esta resposta apenas se mostra eficaz nos
pequenos vasos da microcirculação(5).
Hemostase Primária
O processo de formação do trombo plaquetário nos locais de lesão vascular designa-se
hemostase primária(5). Em condições normais, as plaquetas circulam livremente na circulação
sanguínea sem interagir com outras plaquetas ou com o endotélio vascular. Na presença de uma
lesão vascular, desencadeia-se uma sequência de eventos que levam à formação de um coágulo
rico em plaquetas. Esses eventos representam uma série complexa de processos bioquímicos e
celulares, que podem ser divididos em quatro categorias: adesão e ativação, secreção e
agregação(4).
Adesão e ativação plaquetárias

Nos primeiros segundos após ocorrer uma lesão vascular, as plaquetas acumulam-se e
aderem ao colagénio, fibronectina, laminina, vitronectina e trombospondina do subendotélio
vascular, através de recetores plaquetário específicos(5). A ativação e adesão plaquetária
envolvem os seguintes recetores e os seus respetivos ligandos(6):
3
 GPIb/V/IX - fator von Willebrand (FvW);

 GPVI - colagénio;
 aIIbb3 - fibrinogénio, FvW, fibronectina, vitronectina;
 a2b1 - colagénio;
 avb3 - vitronectina, trombospondina, FvW, fibronectina, fibrinogénio;
 PAR1, PAR4 - trombina(6).
Os fios de colagénio expostos no endotélio dos vasos lesados, ativam as plaquetas e
estas aderem à parede do vaso(2). Nesta fase, a principal ligação ocorre entre o colagénio da
superfície endotelial e o recetor de membrana das plaquetas – glicoproteína GPIb/IX(5). Esta
ligação é fortemente estabilizada pelo FvW(4) e inicia a hemostase primária, principalmente em
condições de elevado fluxo vascular (alta força de cisalhamento)(7).
O FvW participa também na hemostasia secundária, transportando o fator VIII na
circulação, que quando livre é rapidamente inativado(7).
Secreção e agregação plaquetárias
Após os primeiros eventos de adesão plaquetária, as plaquetas sofrem uma alteração

morfológica com invaginação da membrana plaquetária, facilitando a abertura do sistema
canicular que a constitui, libertando o seu conteúdo granular(8). Os produtos secretados recrutam
mais plaquetas para o local da lesão vascular e causam a agregação plaqueta a plaqueta através
dos seus recetores membranares (glicoproteína IIb/IIIa)(8) usando o fibrinogénio como ponte
intercelular(3)(5). Nesta última ligação também intervêm o FvW, que, também em condições de
alta força de cisalhamento, estabiliza as ligações entre os recetores plaquetários e o
fibrinogénio(7). A estimulação das plaquetas leva a um aumento das moléculas de GP IIb/IIIa e
a sua maior disponibilidade de ligação a moléculas de fibrinogénio(4). A ativação plaquetária por
diversos agonistas (quadro 1) induz a sinalização intracelular levando à libertação do conteúdo
dos grânulos das plaquetas (alfa e delta)(4).
Quadro 1. Agonistas fisiológicos para a ativação plaquetária [Bhatt DL, 2008].
Agonista Origem Recetor(s)
Trombina Produto final da cascata da coagulação PAR-1, PAR-4 GPIbα
ADP Grânulos densos das plaquetas P2Y1, P2Y12
Colagénio Componente do subendotélio vascular GPIa/IIa, GPIIb/IIIa, GPIV, GPVI
Serotonina Grânulos densos das plaquetas recetor 5HT2
Tromboxano A2 Produzido por outras células recetor PGH2, TXA2
PFA Lípido mediador produzido por outras recetor PAF
células
4
O conteúdo dos grânulos alfa desempenha um papel importante na formação e

estabilização dos agregados plaquetários(9). O ADP libertado dos grânulos densos desempenha
um papel fundamental no reforço dos estímulos celulares. O TXA2 formado amplifica e reforça
a agregação plaquetária e é um vasoconstritor importante na manutenção da estabilidade do
trombo plaquetário(8). A ligação dos agonistas (incluindo o FvW) aos recetores membranares
específicos das plaquetas ativa enzimas que degradam fosfolípidos (fosfolipases C e A2), e que
suprimem a formação de AMPc (AMP cíclico) iniciando a reação de libertação(5). A eficácia do
trombo plaquetário é reforçada pela capacidade de contração das plaquetas. Este mecanismo
requer a presença de cálcio(3).
Assim, ativação e secreção plaquetárias são reguladas pelo nível de nucleótidos cíclicos,
influxo de cálcio, hidrólise dos fosfolípidos de membrana e fosforilação de proteínas
intracelulares (figura 1)(5).
Figura 1. Base bioquímica da ativação e secreção plaquetárias. [Moreira AL, 2001]. Abreviaturas: AC-
adenilciclase; G-proteína G; PIP2 – 4,5-bifosfato de fostatidilinositol; PLC – fosfolipase C; DAG – diacilglicerol;
PLA2 – fosfolipase A2; PC – fosfatidilcolina; AA – ácido araquidónico; CO – ciclo- oxigenase; O2 – oxigénio; IP3 –
trifosfato de inositol; Ca-CM – Complexo cálcio-calmodulina; MLCK – cinase cadeia leve da miosina.
A adesão, secreção e agregação plaquetárias são fenómenos complexos que podem ser
interrompidos ou inibidos por variadas moléculas que atuam nos processos bioquímicos
inibindo a sua ação e que tem sido alvo de investigação na terapêutica antiplaquetária recente e
histórica.
5
Hemostase Secundária
A coagulação sanguínea é um processo complexo e autolimitado, iniciado e regulado
por uma série de reações e interações proteicas geradoras de feedback positivo e negativo. Nos
humanos, todas estas reações envolvem uma grande quantidade de proteínas extracelulares,
cerca de metade delas da família das proteases de serina(10). A esse conjunto de reações
sucessivas convencionou-se chamar de “cascata da coagulação”. A “cascata da coagulação” foi
inicialmente descrita como duas vias distintas (extrínseca e intrínseca), cada uma com uma série
de reações enzimáticas em cadeia que culminavam na formação do coágulo de fibrina estável (11)
(figura 2).
Figura 2. Representação esquemática da cascata da coagulação. [Marder VJ, 2006].
Contudo, recentemente, a coagulação tem sido descrita como um processo complexo

cujo modelo é baseado no papel das células intervenientes, nomeadamente as células
apresentadoras de fator tecidual (FT) e as plaquetas (5)(12). Este sistema divide-se em três fases
distintas, mas interligadas: iniciação, amplificação e propagação (figura 3).
6
Figura 3. Fases da coagulação de acordo com a nova cascata. [Pérez-Gómez F et al, 2007].
Fase de iniciação
A cascata inicia-se pela via extrínseca após exposição (pela lesão vascular) ou expressão
(induzida pelos mediadores inflamatórios) do FT que conduz à ativação do FVII(5). O complexo
FT/FVIIa ativa pequenas quantidades dos fatores IX e X. Este último, na sua forma ativada,
associa-se ao fator Va formando o complexo protrombinase na superfície das células portadoras
de FT, resultando na formação de pequena quantidade de trombina(12), que é crucial para
garantir que a iniciação da coagulação seja eficaz e para a ampliação da mesma (10). O inibidor
da via do fator tecidual (TFPI) tem um papel importante na supressão da iniciação da
coagulação: liga-se ao FXa, inibindo-o e formando um complexo inibidor do complexo
FVIIa/FT.
Fase de amplificação
Uma vez formada, a trombina pode deslocar-se das células apresentadoras de FT até às
plaquetas locais, onde se liga ao recetor GPIb, amplificando a coagulação. Esta ligação facilita a
interação da trombina com outros componentes da superfície plaquetária com a consequente
clivagem da proteína PAR-1 (levando à ativação da plaqueta), ativação do FVIII e sua
libertação do complexo FVIII/FvW, e a ativação dos fatores V e IX(9).
7
Fase de propagação
A coagulação é mantida pelas reações da via intrínseca iniciadas pelo FXIa(5). Este fator
ativa o FIX, na presença de cálcio. O FIXa, ativado na fase de iniciação, liga-se ao FVIIIa
(complexo tenase intrínseca) nas superfícies plaquetárias e forma-se mais FIXa pela ação do
FXIa ligado às plaquetas. Como o FXa não se desloca eficazmente da célula portadora de FT
para a plaqueta, tem de ser produzido diretamente na superfície da plaqueta pelo complexo
tenase(9). O fator Xa forma o complexo protrombinase com o FVa e gera grande quantidade de
trombina suficiente para coagular o fibrinogénio(12). Além da conversão do fibrinogénio solúvel
numa matriz de fibrina insolúvel, a trombina também é responsável pela estabilização do
coágulo através de:
 ativação do FXIII (que favorece a formação de ligações cruzadas covalentes entre as
moléculas de fibrina);
 resistência à fibrinólise (pela ativação do inibidor de fibrinólise mediado pela trombina
(TAFI), que remove resíduos de lisina terminais da fibrina que são sítios de ligação das
enzimas fibrinolíticas);
 clivagem do recetor PAR-4 (que assegura uma desgranulação total das plaquetas e a
retração das plaquetas ativadas);
 incorporação do próprio FIIa na estrutura do coágulo, que previne a sua inativação pela
antitrombina(13);
 Ativação dos fatores XI, IX, X e VIII;
 Estimulação da secreção e agregação plaquetárias;
 Promoção de vários efeitos celulares, como quimiotaxia, proliferação, renovação da
matriz extracelular e libertação de citocinas(5).
Assim, a visão atual da cascata da coagulação pode ser representada esquematicamente na
figura seguinte:
8
Figura 4. Visão atual da cascata da coagulação. [Moreira AL, 2001].
Mecanismos de Regulação
A coagulação é regulada por vários mecanismos:
 diluição de pró-coagulantes no sangue em fluxo;
 remoção de fatores ativados por meio do sistema retículo endotelial, em especial
no fígado;
 controlo por vias antitrombóticas naturais(14).
Pelo menos sete sistemas de controlo separados e distintos regulam cada fase da
hemostase e conferem proteção contra a trombose, inflamação vascular e lesão tecidual (Quadro
2)(13).
Quadro 2. Mecanismos antitrombóticos naturais das células endoteliais [Yau et al, 2015].
Regulação da cascata de coagulação
Antitrombina
Proteína C/Proteína S
Regulação da reatividade dos vasos e plaquetas
Prostaciclina
Óxido Nítrico
Inibição do recrutamento de plaquetas
Ecto-ADPase (CD39)
Remoção do coágulo de fibrina
Fibrinólise
9
A antitrombina (AT), a proteína C (PC), proteína S (PS) e TFPI são os principais

reguladores da cascata de coagulação(5); a prostaciclina (PGI2) e o óxido nítrico (NO) modulam
a reatividade vascular e plaquetária; a ecto-ADPase inibe o recrutamento de plaquetas; e a
fibrinólise remove o coágulo de fibrina.
Antitrombina
A AT é uma glicoproteína com peso molecular aproximado de 58.000 daltons,
sintetizada no fígado e nas células endoteliais(5)(15). É o principal inibidor das proteases de serina
presente no plasma. Inibe a trombina e o FXa, que são duas enzimas essenciais para a cascata da
coagulação. Forma também complexos estequiométricos com as proteases de serina IXa, XIa e
XIIa, bem como a plasmina e a calicreína, inibindo a sua ação(9)(15). Na ausência da heparina, a
AT inibe a trombina e o fator Xa de forma relativamente lenta. Quando presente, a heparina
liga-se a um sítio específico na molécula de AT, a qual então sofre uma alteração
conformacional que permite que a molécula alcance o sítio ativo da trombina e iniba de forma
instantânea e irreversível. Este aumento da inibição de trombina e fator Xa é a base do uso
terapêutico da heparina como anticoagulante(16). De forma semelhante, a AT liga-se também ao
sulfato de heparano, expresso normalmente pelas células endoteliais(5). Como a superfície
endotelial normalmente é coberta com uma camada de AT já ativada pelo sulfato de heparano
endógeno, assim é impedida a formação de fibrina em áreas não danificadas(10).
Proteína C
A proteína C (PC) pertence ao grupo das proteínas dependentes da vitamina K(17). Tem
um peso molecular aproximado de 62.000 daltons, e é constituída por duas cadeias
polipeptídicas: a cadeia de elevado peso molecular (aproximadamente 41.000 daltons), onde se
encontra o sítio ativo da molécula, e a cadeia de baixo peso molecular, onde se encontram os
resíduos de ácido γ-carboxiglutâmico necessários para a fixação nas micelas de fosfolípidos,
dependente de cálcio(1). É sintetizada no fígado(3), e encontra-se no plasma sob a forma de
proenzima(17). Para a sua ativação, requer a presença de trombina (após a ligação desta à
trombomodulina – presente nas superfícies endoteliais intatas)(5), cálcio e fosfolípidos(17). Uma
vez ativada, a PC intervêm no processo de regulação da coagulação, neutralizando, por
proteólise(5), as propriedades pró coagulantes dos fatores Va e VIIIa (cofatores responsáveis
pela formação dos complexos protrombinase e tenase intrínseca, respetivamente)(13) (figura 5).
Esta ação requer a presença de um cofator, também dependente da vitamina K, que é a proteína
10
S (PS). A PC inativa também os recetores plaquetários para o FXa(5). Pode também estimular a
libertação do ativador do plasminogénio tecidular (tPA) pelas células endoteliais(11).
Figura 5. Complexos procoagulantes Protrombinase e Tenase Intrínseca. [Greer JP et al, 2014].
Proteína S
A PS desempenha um papel importante e multifuncional na regulação da formação do
trombo hemostático(18). É uma glicoproteína plasmática dependente da vitamina K(13). Tem um
peso molecular de aproximadamente 70.000 daltons(13), e é sintetizada principalmente no fígado
e células endoteliais, e armazenada nas células endoteliais e nos grânulos 𝛂 das plaquetas(3).
Não é uma protease de serina, mas funciona como cofator da proteína C ativada (PCA) na
inativação proteolítica dos fatores Va e VIIIa(13). Funciona como fator antitrombótico tanto por
mecanismos dependentes da PC como por mecanismos independentes, inibindo a formação da
trombina(3).
A PS circula na corrente sanguínea nas formas livre (40%, em indivíduos normais) e
ligada à proteína ligada ao C4b (C4b-BP) (60%, em indivíduos normais)(3). A PS livre atua
como cofator da PCA potencializando a sua ligação às superfícies fosfolipídicas, nos locais
onde está a decorrer o processo de coagulação (plaquetas, células endoteliais, leucócitos)(5).
Essa ligação acelera a inativação dos fatores Va e VIIa pela trombina na presença de cálcio(2). A
PS livre é ativa como anticoagulante, enquanto a forma ligada à C4-BP é inativa(10).
A PS tem outras funções não associadas à PCA: inibe diretamente a ativação do FX e da
protrombina, serve de cofator para a função do TFPI e favorece a fibrinólise (faz diminuir
o TAFI)(19).
As deficiências de AT, PC e PS são causas importantes de um estado
hipercoagulante(11). Uma anomalia hereditária particularmente comum associada a estados de
hipercoagulação é o fator V de Leiden (FVLeiden), que é resistente à inibição pela PCA. Algumas
11
combinações de anomalias (como por exemplo RPCA mais o uso de contracetivos orais), ou
uma combinação de anomalias hereditárias foram encontradas em vários doentes com histórico
de trombose. Embora os pacientes com estados hipercoaguláveis hereditários apresentem maior
risco de desenvolver um episódio trombótico do que os pacientes que os não apresentem, nem
todas os indivíduos com estados hipercoaguláveis bem definidos desenvolvem uma crise
trombótica (Quadro 3).
Quadro 3. Possíveis causas para ocorrência de fenómenos trombóticos.
[adaptado de Greer JP et al, 2014]
Estados hipercoaguláveis Causas
Hereditários Fator VLeiden
Deficiência PC
Deficiência PS
Deficiência AT
Adquiridos Neoplasias
Síndrome nefrótico
Anticoagulante lúpico
Fisiológicos Gravidez
Obesidade
Pós-cirúrgico
Fator inibidor da via do fator tecidual
A TFPI é uma proteína plasmática, inibidora de proteases, que participa na regulação na

coagulação dependente do fator tecidual, inibindo, por feedback, a ação do complexo tenase
extrínseca (FVIIa/FT)(13). Essa ação inibidora resulta na diminuição da ativação dos fatores IX e
X(5). É sintetizado principalmente pelo endotélio microvascular(3), mas ao contrário da AT a sua
concentração plasmática é baixíssima(20). No entanto, os níveis de TFPI plasmáticos aumentam
substancialmente após administração intravenosa de heparina. Esta libertação de TFPI
endotelial pode contribuir para a eficácia da terapêutica antitrombótica da heparina e da
heparina de baixo peso molecular (LMWH)(16). Na ausência de fatores VIII e IX, o TFPI
impede a ativação da cascata da coagulação, o que explica a ocorrência de hemorragias em
indivíduos com deficiências desses fatores(5).
12
Prostaciclina
Perante uma perturbação na célula, é libertado ácido araquidónico dos fosfolípidos da

membrana celular, por ação da enzima fosfolipase A2(10). A partir do ácido araquidónico, e
através da ação enzimática da prostaglandina sobre este, são formados dois compostos distintos
conforme o local da reação: tromboxano A2 (TA2) nas plaquetas, e a prostaciclina (PGI2) nas
células endoteliais(13). O TA2 e a PGI2 apresentam funções opostas na regulação da coagulação:
enquanto o primeiro é um potente estimulador da agregação plaquetária e causa vasoconstrição,
o segundo, pelo contrário, inibe a agregação plaquetária e é um vasodilatador(21)(22).
Óxido nítrico
O óxido nítrico (NO) é formado a partir do aminoácido L-arginina, nas células
endoteliais. O NO estimula a guanilato ciclase, levando ao aumento de monofosfato de
guanosina cíclico (GMPc) nas células alvo, também causa vasodilatação e inibe a adesão e
agregação plaquetárias(23).
Ecto-ADPase (CD39)
O CD39 é uma proteína de membrana integral, encontrada nas células endoteliais. Trata-
se de uma enzima ativa que rapidamente hidrolisa adenosina difosfato (ADP) em adenosina
monofosfato (AMP). No processo da coagulação, limita o recrutamento de mais plaquetas para
dentro do tampão plaquetário, removendo o ADP secretado pelas plaquetas ativadas, e libertado
pelas células endoteliais e de eritrócitos danificados(24).
Fibrinólise
O sistema fibrinolítico é responsável por dissolver os coágulos de fibrina. Este processo

é obviamente importante, na medida em que se torna necessário prevenir que a formação de
coágulos se estenda para além do necessário à normal homeostasia(11). Este sistema de regulação
da coagulação é constituído por várias enzimas (ativadoras e inibidoras), produzidas
essencialmente pelo fígado, endotélio vascular e plaquetas(5). O passo final na cascata de
reações é a ativação do plasminogénio a plasmina, que é a principal enzima responsável pela
degradação da fibrina (figura 6)(10)(25).
13
Figura 6. Representação esquemática do processo de fibrinólise. [Kolev K, 2014].

FDPs – produtos de degradação da fibrina.
Os principais ativadores da fibrinólise são o ativador de plasminogénio tecidual (tPA) e

o ativador de plasminogénio urinário ou urocinase (UK). São sintetizados pelas células
endoteliais e convertem o plasminogénio (adsorvido ao coágulo de fibrina) em fibrina(5). A
plasmina ligada ao coágulo de fibrina fica protegida contra inativação. A plasmina livre,
libertada na circulação é rapidamente inativada pelo inibidor α2 - antiplasmina, prevenindo
assim a proteólise inespecífica generalizada pela plasmina(23). A fibrina é degradada em
fragmentos (FDPs) X, Y (de maior tamanho) e D, E (de tamanho mais pequeno)(25).
O tPA ativa a fibrinólise mais eficazmente quando se liga ao fibrinogénio ligado à
fibrina do que quando se encontra livre(5) . A UK é um segundo ativador de plasminogénio.
Enquanto o tPA é amplamente responsável pelo início da fibrinólise intravascular, a UK é o
principal ativador da fibrinólise no compartimento extravascular(3). Esta última existe sob duas
formas com propriedades funcionais distintas: UK de cadeia simples e UK de cadeia dupla. A
primeira apenas ativa o plasminogénio ligado à plasmina, enquanto a segunda tem afinidade
tanto para ativação do plasminogénio livre como para ativação do plasminogénio ligado à
fibrina(13). Existe ainda um outro potente ativador do plasminogénio, mas este não é de origem
endógena, mas sim bacteriana, que é a estreptoquinase(5).
O processo da fibrinólise também é limitado pela presença de inibidores dos ativadores
de plasminogénio (PAI) no plasma(26). As células do endotélio vascular e as plaquetas ativadas
libertam o PAI-1, que inibe diretamente o tPA. A deficiência congénita de PAI-1 é um distúrbio
hemorrágico raro, geralmente associado a episódios hemorrágicos relacionados com a
ocorrência de traumatismos ou cirurgia(27). Pelo contrário, podem ser encontrados níveis
elevados de PAI-1 em várias situações patológicas, como obesidade e síndrome metabólico,
podendo estar envolvido numa maior prevalência de hipercoagulabilidade neste tipo de doentes.
14
O inibidor da plasmina ou α2 – antiplasmina inibe eficazmente a plasmina livre que escapa do

coágulo de fibrina (figura 6)(25). Também se encontra ligado à fibrina pelo FXIIIa, onde regula a
atividade do plasminogénio ligado à fibrina e ativado em plasmina(5).
Os mecanismos de regulação da coagulação são de enorme importância na manutenção
da hemostase. Quando existem falhas, os doentes podem apresentar tendência hemorrágica. Por
exemplo, se um doente apresentar uma doença hepática crónica descompensada, pode
apresentar graves hemorragias, devido à falta de α2 – antiplasmina, que é sintetizada no
fígado(5).
15
Ensaios Laboratoriais
O correto diagnóstico de uma patologia com implicações no normal funcionamento das

funções hemostáticas requer a análise cuidada da história clínica do doente, um rigoroso exame
físico e também a realização de alguns exames laboratoriais.
Os exames laboratoriais prescritos pelo clínico para o laboratório de trombose e
hemostase podem-se dividir em testes de rastreio e testes específicos. Os primeiros servem para
avaliar efeitos combinados de fatores que influenciam uma determinada fase do processo de
coagulação. Os segundos avaliam o nível ou a função de um fator específico ou a função
plaquetária, para apoiar o estabelecimento de um diagnóstico correto e definitivo(5).
No CHSJ, os exames laboratoriais são executados no laboratório de trombose e
hemostase do SIH desta unidade hospitalar. Este laboratório é especialmente vocacionado para
o despiste, diagnóstico e monitorização das patologias da trombose e hemostase. Os pedidos de
análise que aí chegam são provenientes do internamento, da consulta externa, do serviço de
urgência e também de entidades externas.
Amostras para estudos de coagulação

As variáveis pré-analíticas têm particular importância na fiabilidade e qualidade dos
resultados dos testes laboratoriais na área da trombose e hemostase.
A colheita de amostras deve ser realizada ao paciente com jejum de pelo menos 4 horas.
O garrote não deve não estar colocado num período superior a um minuto, para que não haja
hemoconcentração, nem estase venosa.
Os ensaios executados no laboratório de trombose e hemostase do SIH do CHSJ são na
sua maioria realizados em plasma. Assim, as amostras devem ser obtidas através da colheita de
sangue venoso para tubos com o anticoagulante citrato dissódico em concentração 0,129 M
(3,2%)(28). A solução de citrato de sódio deve ser tamponada para prevenir aumento de pH,
influenciando e comprometendo a qualidade dos resultados (7). A proporção de anticoagulante
no tubo de sangue deve ser de 1:9 (por ex: 4,5 mL de sangue para 0,5 mL de citrato de sódio).
Este anticoagulante tem a função de fixar o cálcio presente em solução.
No caso de se ter conhecimento prévio ou após se ter centrifugado a amostra, que o
sangue do doente apresenta uma alteração de hematócrito, deve-se efetuar uma correção da
proporção de anticoagulante no tubo, para o hematócrito em questão. A razão
sangue/anticoagulante de 9:1 é efetiva desde que o hematócrito do paciente não ultrapasse 55%.
16
A quantidade de anticoagulante necessária para o acerto num tubo de 5 mL é calculada com

recurso ao gráfico da figura ou à seguinte fórmula de cálculo (válida para qualquer quantidade
de volume total):
C = (1,85 x 10-3) (100 x H) V
onde C é o volume de citrato de sódio em mililitros, V é o volume de sangue total, e H é
o valor do hematócrito em percentagem(3).
Figura 7. Gráfico para a correção do volume de anticoagulante em 5,0 mL de sangue quando o

hematócrito do paciente é maior ou igual a 55%. [Keohane EM, 2016].
Após a correção, deve ser pedida colheita de nova amostra.
Receção de amostras
As amostras de sangue com destino ao Lab-4 são rececionadas na secretaria do SIH.
Antes de enviar a amostra e respetiva requisição para o Lab-4, os serviços de secretaria
asseguram os seguintes passos do processo:
 receção da requisição eletrónica;
 receção da amostra;
 leitura informática dos dados do doente e do pedido analítico;
 geração das etiquetas com códigos de barras, quando necessário.
17
Verificação das amostras no Lab-4

Todas as amostras que são entregues no Lab-4 são alvo de inspeção visual, bem como da
verificação das respetivas etiqueta e requisição, tendo em atenção os seguintes aspetos:
 se existe requisição e respetiva amostra de sangue;
 se os dados que identificam a amostra de sangue estão de acordo com os dados
contidos na respetiva requisição;
 se a data indicada na etiqueta é do dia atual;
 se a amostra não revela sinais de uma má colheita;
 presença de coágulos, espuma e/ou hemólise;
 não adequação do volume de sangue ao volume de anticoagulante (neste caso o
volume de sangue deve atingir pelo menos 80% do previsto).
No caso de se verificar alguma não conformidade relativa aos aspetos acima referidos, o
Técnico de Análises Clínicas (TACSP) devolve a requisição e a amostra à secretaria, para que
seja pedida nova colheita de amostra. No caso de se verificarem todas as condições requeridas,
o TACSP inicia o processamento da amostra.
Processamento das amostras

As amostras para testes em plasma pobre em plaquetas (PPP) devem ter contagem
plaquetária inferior a 10.000 plaquetas/mm3 e devem ser centrifugadas nas condições de 3.000
rotações por minuto (rpm) durante 10 minutos à temperatura de 4-6 °C. Alguns procedimentos
requerem uma dupla centrifugação, ou seja, o PPP da primeira centrifugação é transferido para
outro tubo e centrifugada pela segunda vez, sendo que a porção inferior não deve ser utilizada
porque contém plaquetas remanescentes da primeira centrifugação.
Amostras não centrifugadas ou centrifugadas para os testes de coagulação (PT, aPTT,
fibrinogénio, inibidores e fatores, etc) podem permanecer à temperatura ambiente (TA) até 4
horas. Para a pesquisa de anticoagulante lúpico, deve-se proceder à dupla centrifugação.
Nem todos os parâmetros são analisados no próprio dia da receção, por motivos de
consumo sustentável de reagentes. Aguarda-se então que se junte um número significativo de
amostras para se realizar a análise em conjunto. No entanto, é necessário guardar a amostra em
condições de congelação. Assim, depois de centrifugadas, retira-se o plasma dessas amostras, e
coloca-se em alíquotas devidamente identificadas e armazena-se à temperatura de -70 °C. O
plasma deve ser descongelado, em banho-maria (37 °C), durante 10 minutos e homogeneizado
18
por inversão. Se a descongelação for efetuada a baixa temperatura, pode haver formação de
crioprecipitados com redução dos fatores VIII, FvW e fibrinogénio(29).
Análises automáticas
As amostras centrifugadas são distribuídas por um dos três tipos de equipamento de
análise automática existentes no Lab-4:
 BCS® XP System (figura 8a);
 Sysmex® CS-5100 Hemostasis System (figura 8b);
 STA R Max® - 2 unidades (figura 8c).
a b c
Figura 8. Equipamentos para análise automática no Lab-4.

a) BCS® XP System; b) Sysmex® CS-5100; c) STA R Max®
Os três equipamentos executam provas “in vitro” que permitem avaliar alterações da
hemostase e monitorizar a terapêutica anticoagulante (Quadro 4).
Quadro 4. Equipamentos de análise automática e semi-automática do Lab-4.

Tipo de análise Equipamento
BCS® XP System
Automática Sysmex® CS-5100
STA R Max®
Rotem
Semi-automática Multiplate
PFA-100® System
19
Testes de rastreio
Tempo de protrombina (TP) / Teste de Quick (TQ)
O TP avalia as vias extrínseca e comum da cascata da coagulação. O teste consiste na

adição de tromboplastina (fator tecidual) a plasma citratado e posterior medição do tempo de
coagulação após adição de cálcio. Permite um rastreio das alterações da coagulação que
envolvem a via extrínseca (FII, FV, FVII e FX). Não requer ativação por contato pelo que é
independente da via intrínseca. Pode ser utilizado para:
 monitorização da terapêutica anticoagulante oral com antagonistas da vitamina
K;
 diagnóstico da deficiência de fatores da coagulação da via extrínseca;
 avaliação da função hepática (5)(7).
O reagente utilizado é o Thromborel® S, que é constituído por tromboplastina de
placenta humana (equivalente à tromboplastina tecidual) e uma solução de cloreto de cálcio
0,025 mol/L, como agente ativador da coagulação. Assim, com o reagente Thromborel ® S e o
correspondente plasma deficitário pode-se determinar a atividade de cada um dos fatores II, V,
VII e X(30). A presença de um anticoagulante lúpico pode interferir no valor do PT(31).
International Normalized Ratio (INR)
O INR é a razão entre o PT do doente e um PT de referência, em segundos. Foi criado

pela Organização Mundial de Saúde (OMS) para padronizar os resultados, que eram
discrepantes devido ao uso de diferentes reagentes, com sensibilidades diferentes. O PT medido
pode ser convertido em INR pela seguinte fórmula(5):
INR = (PTpaciente/PTreferência)ISI, em que ISI é o international sensitivity índex.
Os valores do ISI e do PT de referência são determinados para cada novo lote de

Thromborel® S. Para cada lote diferente de reagente é determinada a média geométrica de pelo
menos 40 indivíduos normais, com utilização de um calibrador com INR conhecido (PT
multicalibrador), sendo determinado para cada equipamento O PT de referência e o ISI(30).
Os valores normais do INR situam-se no intervalo 0,9-1,4(5), no entanto podem variar
consoante a condição clínica do paciente (Quadro 5)(13):
20
Quadro 5. Valores de INR a manter relativamente à condição clínica [adaptado de Greer JP, 2014].
Condição clínica INR
Profilaxia da trombose venosa profunda 2,0-2,5
Tratamento da trombose venosa profunda
Enfarte do miocárdio
Estenose mitral 2,0-3,0
Fibrilação atrial
Isquemia cerebral transitória
Tromboembolismo pulmonar
Enxertos valvulares 3,0-4,5
Válvulas cardíacas artificiais
Valores de INR prolongado podem ser indicativos de várias situações patológicas

(Quadro 6).
Quadro 6. Patologias associadas a INR prolongado [Moreira AL, 2001].

INR prolongado
Deficiência de FI, FII, FV, FVII e FX
Deficiência de vitamina K
Terapêutica com anticoagulantes ou com heparina em
doses elevadas
Doença hepática grave
Síndroma nefrótico
Coagulação intravascular disseminada (DIC)
Transfusões sanguíneas maciças
O INR pode estar diminuído em estados protrombóticos (como nos períodos pós-parto
ou pós-cirúrgico(5).
O nível adequado de INR para uma anticoagulação eficaz e segura, para a maioria das
indicações, está no intervalo de 2,0 a 3,0(31).
Tempo de Trombina
O tempo de trombina (TT) é usado para testar anomalias da conversão do fibrinogénio
em fibrina. Consiste na adição de trombina ao plasma e reflete o tempo de formação do coágulo
de fibrina. É independente das reações que geram trombina(5). O TT pode estar prolongado em
21
consequência de hipofibrinogenemia, fibrinogénio anormal ou presença de inibidores (p. ex.

produtos de degradação da fibrina) que interferem na polimerização da fibrina. As situações
clínicas normalmente associadas a um TT prolongado são: doença hepática grave; CID; terapia
com heparina(7).
Tempo de Reptilase
Quando o TT está aumentado, avalia-se também o tempo de reptilase (TR). Neste teste é
utilizada como reagente, uma enzima de um veneno de serpente (batroxolina) que é insensível à
heparina(5). A reptilase é uma enzima análoga à trombina que converte o fibrinogénio em
fibrina. O TR está prolongado sob condições similares às que prolongam o TT com apenas uma
diferença significativa: a reptilase não é inibida pelo complexo AT-heparina.
A figura 9 sugere o percurso a seguir na investigação de pacientes com TT prolongado.
TT
prolongado
Tempo de
reptilase
Prolongado Normal
Fibrinogénio Heparina no
sangue
Reduzido Normal
Hipofibrinogenemia PDF ou
Disfibrinogenemia D-Dímeros
Anormal Normal
CID Defeito polimerização da fibrina

(ex: paraproteína)
Figura 9. – Investigação do Tempo de Trombina prolongado. (CID: Coagulação Intravascular

Disseminada; PDF: Produtos de degradação da fibrina; TT: Tempo de Trombina).
22
Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (aPTT)

O aPTT, tal como o PT, é um teste de rastreio (screening) da coagulação. O aPTT avalia
a via intrínseca da cascata da coagulação (testa a pré calicreína, o cininogénio de alto peso
molecular (HMWK) e os fatores VIII, IX e XII) e subsequente via comum (FX, FV, FII e FI).
Este teste consiste em incubar o plasma com uma quantidade ótima de fosfolípidos e um
ativador de superfície, ativando a coagulação pela via intrínseca. A adição de cálcio ativa a
coagulação, sendo registado o tempo até à formação do coágulo de fibrina(32). O reagente
utilizado é o Pathromtin® SL, constituído por fosfolípidos de origem vegetal, partículas de
dióxido de sílica (ativador), cloreto de sódio, tampão hepes e azida sódica. Está prolongado em
pacientes com deficiências nos fatores XII, XI, X, IX, VIII, V, II, pré calicreína e HMWK,
doença hepática, CID, transfusões sanguíneas maciças, durante o tratamento anticoagulante com
heparina não fracionada, com antagonistas da vitamina K e com inibidores diretos da trombina
(por exemplo, hirudina, argatroban, etc.) e em portadores de anticoagulante lúpico. O aPTT
pode estar diminuído em qualquer estado de hipercoabilidade(7)(5).
A figura 10 sugere o percurso a seguir na investigação de pacientes com aPTT
prolongado. aPTT
prolongado
TT
Normal Prolongado
D+N Tempo de
Reptilase
Correção Não corrige

…
Ver figura 9
Deficiência de fator Positivo Anticoagulante Negativo
Lúpico
Pesquisa de fator
Anticoagulante Inibidor específico
Lúpico contra um fator
(Pesquisa de fator)
Figura 10. Investigação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada prolongado.
23
Mistura de estudos (D+N)

Este teste é importante na investigação de pacientes com aPTT prolongados. Neste caso,
o teste é repetido substituindo 50% do plasma do doente por um plasma normal, assumindo que
este plasma possui quantidades normais de todos os fatores da coagulação. Assim, o plasma de
mistura tem todos os fatores de coagulação numa concentração de, no mínimo, 50%. Se o valor
do teste for corrigido conclui-se que existe deficiência de um dos fatores da coagulação. Se o
valor se mantiver prolongado, conclui-se que está presente um inibidor da coagulação.
Com o uso de três testes de rastreio (aPTT, PT e TT) é possível discriminar
razoavelmente as doenças hemostáticas, sabendo-se qual o sistema afetado (Quadro 7).
Quadro 7. Avaliação de alterações hemostáticas com três testes de rastreio [Moreira AL, 2001].
*Exceto nos casos de deficiência grave; N – Normal; ↑ prolongado.
Sistema afetado PT aPTT TT
Via intrínseca N ↑ N
Via extrínseca ↑ N N
Via Comum ou defeitos múltiplos ↑ ↑ N (geralmente)
Fibrinogénio N* N* ↑
Tempo de protrombina e proconvertina (P&P)

O P&P é um PT modificado(5). É um teste muito importante para o estudo das
deficiências em fatores dependentes da vitamina K (FII, FVII e FX), dada a sua elevada
sensibilidade. Normalmente a deficiência destes fatores ocorre nas doenças hepáticas,
deficiência em vitamina K ou terapêutica com anticoagulantes orais. O princípio do teste
consiste em medir, na presença de uma tromboplastina tecidual, tempo que demora uma
amostra a coagular na presença de todos os fatores de coagulação (contidos no reagente STA
Hepato-prest®), exceto os fatores que se pretende dosear. O reagente STA Hepato-prest® é uma
mistura de tromboplastina tecidual e plasma de boi adsorvido (deficiente em FII-VII-X e
contendo Fv e FI)(11). A influência da heparina em doentes tratados com heparina e
anticoagulantes orais é diminuída através da diluição do plasma do doente (5). Sempre que o PT
apresentar valores superiores a 15 segundos, deve ser determinado o P&P. Como já foi referido,
os fatores em avaliação na determinação do PT são os das vias extrínseca e comum, de entre
eles o V e o X. Dado que estes podem ser mascarados por medicação, os plasmas dos doentes
podem, nessas condições apresentar TP prolongados(10).
24
Valores de referência
Os valores de referência dos ensaios acreditados do Lab-4, para os testes de rastreio

mencionados acima, encontram-se mencionados no Quadro 8.
Quadro 8. Valores de referência de alguns testes executados no Lab-4.

sd – desvio padrão
Ensaio Valores de referência
aPTT 24,2 – 36,4 seg. (média de 40 normais ± sd)
PT Avaliação sempre com um novo lote.
INR 2,0-3,0; 3,0-4,5 (variam segundo a patologia do doente)
P&P 70-130 %; 0,7-1,30 U/mL
Testes específicos
Fibrinogénio
Os níveis de fibrinogénio no plasma afetam significativamente a velocidade de formação

do coágulo de fibrina.
Regista-se um aumento dos níveis de fibrinogénio em casos de diabetes, estados
inflamatórios (o fibrinogénio é um reagente de fase aguda) e obesidade; observa-se uma
diminuição do nível de fibrinogénio na CID, doença hepática e terapêutica trombolítica(5).
Os níveis plasmáticos de fibrinogénio podem ser quantificados antigenicamente ou, de
forma mais comum, por meio de ensaios de coagulação. Existem vários métodos
coagulométricos para avaliar a concentração do fibrinogénio, no entanto o mais utilizado é o
método de Clauss, que é baseado no TT e utiliza uma alta concentração de solução de trombina.
Assim, na presença de um excesso de trombina, o tempo de coagulação de uma amostra de
plasma diluído é inversamente proporcional à concentração de fibrinogénio. O tempo de
coagulação obtido é comparado posteriormente com uma preparação de fibrinogénio
padronizada(7)(5).
Fatores da coagulação
O doseamento dos fatores da coagulação baseia-se na realização de provas, recorrendo

ao PT e ao aPTT, comparando os resultados obtidos. Utiliza-se o plasma problema e uma
mistura deste com um substrato, que contém todos os fatores de coagulação exceto o que se
25
pretende dosear(9). Finalmente, compara-se o grau de correção do tempo de coagulação com o

plasma de referência normais.
A investigação da deficiência de fatores, excetuando-se o fibrinogénio e o FXIII, é

efetuada através da determinação do PT adaptado (para os fatores II, V, VII ou X) ou a
determinação do aPTT (para os fatores VIII, IX, XI e XII). Este estudo é feito com recurso a
uma curva de calibração, da seguinte forma: são feitas várias diluições de plasma citratado
padrão em plasma deficiente do fator em estudo, mas com níveis normais dos outros fatores. A
curva de calibração é traçada com os tempos de coagulação versus a concentração do fator em
estudo. Substituindo o plasma padrão pelo plasma do doente, os tempos de coagulação
resultantes podem ser usados para se determinar a quantidade de fator presente. A realização
destes testes pode ser efetuada manualmente ou com recurso a analisadores automáticos, como
por exemplo o equipamento BCS® XP System. Deve-se ter em atenção que a fidelidade deste
método diminui para concentrações de fator muito baixas (<1% do normal), sendo necessário
prosseguir com estudos mais especializados(9).
O plasma de um doente com deficiência de um fator específico não será capaz de
compensar a ausência do fator no plasma com deficiência do fator correspondente, resultando
assim num tempo de coagulação prolongado.
A realização destes estudos é particularmente importante no diagnóstico da hemofilia A
e B (FVII e FIX) e na doença de von Willebrand (DvW). Uma pequena variação, em
percentagem, a níveis baixos, pode indicar adoção de novos regimes de tratamento(5). A
determinação do FIX também é importante no diagnóstico de coagulopatia de consumo, cirrose
hepática e monitorização da terapêutica de anticoagulantes orais.
Antitrombina
A deficiência hereditária de AT está associada a uma elevada frequência de problemas

tromboembólicos. Atualmente estão classificadas 4 categorias de deficiências congénitas de AT
(Quadro 9)(15).
Quadro 9. Deficiência congénitas da antitrombina [Stago SAS, 2015].
Tipo de deficiência Quantidade de Atividade Observações
proteína biológica
I diminuída diminuída O caso mais frequente
II RS normal diminuída Anomalia ao nível do
(“reactive site”) ponto reativo
II HBS normal normal na ausência Anomalia ao nível da
(“heparina binding site”) de heparina ligação AT-heparina
II PE diminuída diminuída Proteína não funcional e
(“pleiotropic efect”) em quantidade reduzida
26
A par destas deficiências, foram ainda descritas deficiências adquiridas nas seguintes
situações(15):
 CID;
 síndromes nefróticos;
 afeções hepáticas;
 tratamentos com L-asparaginase.
A determinação automática da concentração de AT em amostras de plasma sanguíneo

humano é executada por rotina no Lab-4, utilizando-se o equipamento STA R Max®, com o uso
de um substrato cromogénico (EtM-SPro-Arg-pNA, AcOH). A quantificação é decomposta em
duas fases:
 1ª fase: incubação do plasma em presença de heparina e de uma fixa e em

excesso de trombina;
 2ª fase: medição da trombina residual pela sua atividade amidolítica no

substrato cromogénico (liberta-se pNA, que pode ser doseado
fotometricamente a 405 nm). A quantidade de trombina neutralizada é
proporcional à quantidade de AT presente na amostra.
Esta quantificação pode ser efetuada em indivíduos em tratamento com heparina, porque
não é influenciada pela heparina terapêutica(15).
Proteína C
O interesse clínico na determinação dos níveis de PC no plasma dos doentes está na

existência de deficiências desta proteína, congénitas e adquiridas, e da necessidade de as estudar
para diagnóstico e monitorização do tratamento. As deficiências congénitas são principalmente
caraterizadas por tromboses venosas recorrentes e podem ser divididas em dois tipos: I e II
(Quadro 10).
Quadro 10. Deficiência congénitas de PC [Stago SAS, 2015].

Tipo de deficiência Níveis de PC Níveis de PC Observações
funcional antigénica
I diminuída diminuída -
II diminuída normal Mais raro.
(ou subnormal)
27
Deficiências adquiridas de PC podem ser encontradas em casos de disfunção hepática

(hepatite, cirrose, etc), terapia com anticoagulantes orais e CID(15) .
A quantificação da PC funcional no plasma dos doentes pode ser analisada no

equipamento STA R Max®, por método cromogénico. A PC é ativada pelo reagente 1 (extrato
de veneno de Agkistrodon c. contortrix). A quantidade de enzima é medida pela sua atividade
amidolítica no substrato sintético cromogénico THC-Pro-Arg-pNA, AcOH (liberta-se pNA, que
pode ser doseado fotometricamente a 405 nm). A intensidade da cor produzida é diretamente
proporcional aos níveis de PC presente na amostra(33).
Proteína S
Na rotina laboratorial (no Lab-4), os testes de determinação da PS no plasma podem ser

efetuados no equipamento STA R Max®, da Stago.
O diagnóstico é baseado na quantificação dos níveis de antigénio da PS (proteína S total
ou proteína S livre) e atividade anticoagulante. As deficiências congénitas da PS são
classificadas em três categorias(33) (Quadro 11):
Quadro 11. Deficiência congénitas de PS [Stago SAS, 2015].

Tipo de deficiência Níveis de PS Níveis de PS antigénica
funcional Livre Total
I diminuída diminuída diminuída
II diminuída normal normal
III diminuída diminuída normal
Deficiências adquiridas de PS podem estar associadas às seguintes situações:

 estados inflamatórios decorrentes da elevação da C4b-BP;
 afeções hepáticas;
 síndrome nefrótico;
 tratamento com anti vitamina K;
 contracetivos orais;
 tratamento com L-asparaginase.
Os resultados das determinações de PS (livre e total) são difíceis de interpretar devido a
vários fatores:
 regulação genética complexa,
 PS interage com outras proteínas,
 variação biológica,
28
 variáveis pré-analítica,
 performance dos testes analíticos(3).
O teste da PS é baseado na habilidade da PS para funcionar como cofator da
PCA, objetivada pelo alongamento do tempo de coagulação de um sistema enriquecido em FVa,
(substrato da PS)(33). O ensaio não é cromogénico, mas sim funcional. O plasma do paciente é
misturado com plasma normal deficiente em PS para assegurar valores normais para todos os
fatores menos para a PS. É então adicionado PC e RVV a uma solução tampão (contém
neutralizante de heparina). De seguida é adicionado o cloreto de cálcio. Quanto maior o tempo
de coagulação, maior é a atividade da PS(18).
A determinação do antigénio livre da PS é um método imunológico em que se usa um
anticorpo monoclonal que reconhece apenas a forma não ligada da PS e na maioria dos casos
pode ser usada como marcador substituto da atividade da PS. A determinação do PS total
determina ambas as frações da PS no plasma (livre e total). Este determinação PS total ajuda a
confirmar o diagnóstico e diferenciar o tipo de deficiência, mas não pode ser considerado como
teste primário, porque algumas deficiências hereditárias de PS e condições de diminuição
adquirida de PS diminuída podem apresentar níveis de PS total normal(19).
RPCA
O complexo PCA-PS hidrolisa os fatores Va e VIIIa. Existe uma mutação no gene do

fator V que substituiu uma Arg por uma Glu, na posição 506(8). Com a ocorrência dessa
mutação, altera-se o local de clivagem para a PCA, por isso se diz que há uma resistência à
proteína C ativada (RPCA). Esta mutação recebeu o nome de FVLeiden. Leiden é o nome da
cidade holandesa onde foi primeiro descrita(10). Os doentes que apresentam esta condição têm
risco aumentado de trombose, porque a capacidade de inativação da PC está comprometida(13).
O teste da RPCA é baseado na determinação de um aPTT modificado, que consiste na
comparação dos tempos de coagulação dos plasmas a testar com e sem adição de PCA. Os
doentes portadores da mutação que causa a RPCA apresentam um alongamento da aPTT menor
do que os indivíduos normais. Nestes últimos, a adição de PCA ao plasma prolonga o aPTT
mais de duas vezes (5)(ver Quadro 12).
A preparação da amostra para a determinação da RPCA é diferente das restantes. Após a
verificação da conformidade inicial, e antes de centrifugar, retira-se a tampa do tubo da amostra
e coloca-se parafilm para tapar. Este passo do procedimento é importante na medida em que se
deve assegurar que não há vestígios de células nas paredes do tubo, após a centrifugação.
29
Esta análise requer um aumento do tempo de centrifugação da amostra (2 x 10 min ou

20 min, 3000 rpm). O objetivo é que o plasma fique livre de plaquetas. Após a centrifugação,
transfere-se o plasma para um tubo e armazena-se em congelador. Este tipo de teste só efetuado
após se juntar várias amostras, por uma questão de sustentabilidade de consumo de reagentes.
O teste da RPCA determina a razão entre o aPTT na presença de PCA e o aPTT na
ausência de PCA. Os resultados são apresentados como positivos ou negativos para a presença
de RPCA, segundo a seguinte fórmula (Quadro 12)(5):
Quadro 12. Apresentação de resultados para o teste da RPCA.
aPPTpaciente + PCA Resultado do teste à RPCA

aPTTpaciente - PCA
≤2 positivo
>2 negativo
D-dímero
A fibrina é degradada pela plasmina em diversos produtos. O D-dímero é um desses

fragmentos resultantes da degradação da fibrina.
Uma vez iniciado o processo da coagulação, a trombina cliva o fibrinogénio e formam-
se vários monómeros de fibrina que se polimerizam e formam um coágulo. O D-dímero resulta
da ação da plasmina sobre a fibrina insolúvel, o que implica a formação do coágulo seguida de
lise. O fator XIIIa intervêm no processo de geração do D-dímero, uma vez que estabiliza a
ligação entre duas moléculas de fibrina (entre os seus domínios D). É um produto específico da
digestão da fibrina insolúvel e é um bom marcador da trombose e fibrinólise(34)(5). Foram
desenvolvidos anticorpos específicos destes produtos que não reagem com o fibrinogénio(35).
O teste do D-dímero é utilizado para o diagnóstico de CID e tromboses. No caso das
CID, o sistema fibrinolítico é ativado e observa-se um aumento da taxa de D-dímero. Taxas
normais de D-dímero constituem um elemento fundamental de exclusão de diagnostico de
trombose venosa profunda (TVE) em evolução ou de embolismo pulmonar (EP)(35).
No Lab-4, o teste do D-dímero é efetuado adicionando-se o reagente STA Liatest® D-Di
Plus ao plasma do doente. Este reagente é constituído por uma suspensão de partículas de latex
recobertas com anticorpos anti-D-dímero. O método é imunoturbidimétrico. Os anticorpos
monoclonais específicos para o D-dímero estão covalentemente ligados a micropartículas de
latex. Na presença de produtos de degradação da fibrina, as partículas de latex que estão
revestidas com os anticorpos anti-D-dímero aglutinam-se. Esse fenómeno induz um aumento da
30
turvação da mistura reacional, e como tal, uma elevação da absorvância do meio. A amplitude
desse aumento é diretamente proporcional à quantidade de D-dímero contido no plasma do
doente(35).
O teste do D-dímero positivo indica a presença de níveis anormais de produtos da
degradação de fibrina no organismo. Níveis elevados de D-dímero podem ser encontrados em
condições que levam à ativação da coagulação e formação da fibrina, como por exemplo,
doentes com tromboembolismo agudo, mas também em outras condições associadas à formação
de fibrina: alguns tipos de cancro, gravidez, doença hepática, cardiopatias, cirurgia e estados
inflamatórios. Um resultado normal do D-dímero significa que provavelmente o paciente não
tem um quadro ou doença aguda que cause formação e degradação anormais de
coágulos(36)(34)(5).
O D-dímero é recomendado como teste adjuvante. Não deve ser o único exame realizado
para diagnosticar uma doença ou quadro. Os pacientes com resultados tanto negativos quanto
positivos do D-dímero podem necessitar de acompanhamento e de outros exames
complementares(5).
Os resultados devem ser sempre interpretados em conjunto com a história clínica do
paciente, o exame clínico e os resultados obtidos. A terapia anticoagulante pode causar um
resultado falso-negativo. A concentração do D-dímero pode estar aumentada nos idosos.
Resultados falso-positivos podem ocorrer em indivíduos com níveis elevados de fator
reumatoide. Quadros de lipémia também podem dar resultados falso-positivos, assim como a
hemólise causada por colheita e manuseamento impróprios da amostra(34)(37)(38).
Os reagentes utilizados para a execução deste ensaio não necessitam de qualquer
preparação prévia, sendo apenas necessário colocá-los à temperatura ambiente antes de serem
utilizados(35).
Anticoagulante lúpico
O anticoagulante lúpico (LA) carateriza-se pela presença de autoanticorpos (IgG e/ou

IgM) contra fosfolípidos aniónicos, complexos fosfolipídeos com a β-2-glicoproteina 1 ou
fatores de coagulação como a protrombina. É considerado um fator de risco significativo para
os pacientes com tromboses de etiologia desconhecida. Pode ser frequentemente encontrado em
mulheres com aborto recorrente. Habitualmente é detetado com testes de coagulação sensíveis
aos fosfolípidos (aPTT, “dilute Russell’s viper venon” (DRVVT)), onde possui um efeito
inibidor da coagulação.
31
No Lab-4, para a deteção do LA, são utilizados dois reagentes DRVVT simplificados
(reagente de rastreio LA1 e reagente de confirmação LA2). O teste pode ser operacionalizado
no analisador automático BCS® XP System da Siemens.
O veneno de víbora de Russel (VVR) presente no reagente de rastreio LA1 provoca a
coagulação do plasma através da ativação direta do fator X. Se presentes, os LA prolongam o
tempo de coagulação do reagente de rastreio LA1. O reagente de confirmação LA2 é
semelhante ao reagente de rastreio LA1, mas contém uma concentração de fosfolípidos
superior. Estes fosfolípidos adicionais reagem contra o LA corrigindo o tempo de coagulação.
Para excluir a deficiência de fatores II, V e X que prolongaria o resultado do teste com o
reagente de rastreio LA1 e o reagente de confirmação LA2, também podem ser úteis testes de
mistura de estudos (D+N) (ver figura 10). Misturando o plasma normal com o plasma do
doente, os fatores em deficiência são novamente restabelecidos. Se o tempo de coagulação não
corrigir, isso indica a presença de um inibidor (como o LA) no plasma do doente(39).
Para a realização deste teste, se as amostras tiverem de ser congeladas, o plasma deve
ser centrifugado duas vezes, para remoção das plaquetas. A primeira centrifugação (2000 rpm,
15 min.) separa o plasma dos restantes componentes e isola os fosfolípidos numa camada entre
o plasma e os eritrócitos. A segunda centrifugação (2500 rpm, 10 min.) é efetuada apenas ao
plasma resultante da primeira, entretanto transferido para outro tubo, com o objetivo de isolar os
restantes fosfolípidos.
A melhor forma de exprimir o resultado final é a relação (ratio) entre o tempo de
coagulação do reagente de rastreio LA1 e o reagente de confirmação LA2(39):
ratio LA = tempo de coagulação do reagente de rastreio LA1

tempo de coagulação do reagente de confirmação LA2
Para cada um dos reagentes é determinado o valor de um “pool” com 10 a 15 plasmas

normais, sendo este o valor com que o equipamento faz a razão com a amostra.
O LA é considerado positivo quando o valor da razão é superior ou igual a 1,2 (valor de
“cut off”). Se o valor da razão for inferior a 1,2, o resultado da prova de deteção de LA é
negativo.
32
Suspeita
De LA
Reagente de
rastreio LA1
Prolongado Normal
Reagente de Sem deteção

confirmação de LA
LA2
Prolongado Normal
Teste de mistura de LA
estudos (D+N) existente
Figura 11. Investigação da presença de LA no plasma.
Fator de von Willebrand
O FvW é uma glicoproteína plasmática que participa no processo de adesão plaquetária

e no transporte do FVIII(3). As moléculas de FvW são armazenadas nos grânulos α das plaquetas
e nos corpos de Weibel-Palade das células endoteliais(1). O Fvw tem locais de ligação para as
plaquetas e para o colagénio, ajudando assim na ligação das plaquetas ao colagénio
subendotelial exposto(13). Cada monómero de FvW tem quatro domínios funcionais que se
ligam:
 ao FVIII;
 à glicoproteína IIb/IIIa;
 ao colagénio.
Uma diminuição ou disfunção do FvW pode ser indicativo de DvW, uma doença
relativamente comum (1-2% da população em geral)(3), sendo a mais prevalente entre as
patologias hemorrágicas congénitas(5)(2). Como o FvW é fundamental para a estabilidade do
FVIII, os doentes com DvW apresentam FvW diminuído, mas também apresentam FVIII
diminuído. Tipicamente, os níveis de FVIII diminuem para níveis hemorrágicos (< 30%) só em
situações de DvW severa(40). Os níveis de FvW também variam de acordo com os grupos
sanguíneos do sistema ABO. Os indivíduos com sangue do tipo O têm níveis mais baixos de
FvW que os indivíduos com sangue de outros tipos sanguíneos do sistema ABO(37).
33
Além disso, o FvW e o FVIII são proteínas de fase aguda (assim como o plasminogénio,
fibrinogénio e protrombina) e os seus níveis podem estar aumentados em casos de: gravidez;
trauma; estados infecciosos; stress(3).
Estão descritos três tipos de DvW:
 tipo 1 - deficiência parcial quantitativa de FvW, presente em
aproximadamente em 75% dos pacientes com DvW;
 tipo 2 – deficiências qualitativas do FvW;
 tipo 3 - ausência quase total de FvW (mais raro)(41).
Existem testes específicos, em geral testes imunológicos que avaliam o FvW que
permitem diferenciar um défice quantitativo (DvW tipo1/tipo3) de um défice qualitativo (DvW
tipo 2):
 FvW:Ag mede os níveis de antigénio;
 FvW:RCo avalia a capacidade do FvW ligar plaqueta em presença de ristocetina.
 Recentemente, foram desenvolvidos outros testes com um fragmento
recombinante da GPIba que inclui o local de ligação ao FvW, não sendo
necessário ristocetina tornando este teste mais específico;
 FvW:CB avalia a capacidade de ligação ao colagénio (I, III e VI).
O ratio FvW:RCo/FvWAg nas variantes com função plaquetária anómala (2A, 2B e 2M) é
bastante diminuído, sendo proposto o limite <0.7; valores superiores são sugestivos de DvW
tipo 1 ou 2N. É recomendado o uso combinado de FvW:RCo e FvW:CB.
Doseamento de FvW (FvW:Ag)
Os níveis plasmáticos de FvW:Ag são influenciados por vários parâmetros fisiológicos,

incluindo a idade, grupo étnico, hormonais e grupo sanguíneo ABO. Desta forma, os valores de
FvW:Ag considerados normais ocupam uma extensa faixa (40 a 240 UI/dl). Os métodos mais
utilizados na detecção de FvW:Ag são imunológicos (radioimunoensaios ou imunoensaios
enzimáticos), por serem mais sensíveis e precisos. Níveis reduzidos de FvW:Ag estão presentes
nas deficiências quantitativas do FvW (DvW tipo 1 e tipo 3), sendo que nas variantes do tipo 2,
os níveis podem ser diminuídos ou normais.
Determinação da atividade coagulante do FVIII (FVIII:C)
A determinação de FVIII:C é feita por meio de método coagulométrico, baseado no

aPTT, ou cromogénico, baseado na geração de FX ativado. A diminuição do FvW (DvW tipo 1
34
e tipo 3) ou da sua afinidade com o FVIII (DvW tipo 2N) ocasiona uma diminuição no FVIII:C.
Nos outros tipos da DvW, a redução dos níveis do FVIII é variável.
Atividade cofatora da ristocetina (VWF:RCo)
Esse método é utilizado para testar a aglutinação plaquetária dependente do FvW. A

ristocetina é um antibiótico glicoproteico que promove a interação entre FvW e a GPIba
plaquetária. Ao acrescentar ristocetina, em concentrações superiores a 1,0 mg/ml, a uma
suspensão de plaquetas normais, fixadas ou não em formol, e plasma do paciente, desencadeia-
se um processo de aglutinação plaquetária. Este processo é dependente da quantidade de
FvW:Ag, principalmente de multímeros de alto peso molecular, e da sua afinidade pela GPIb
plaquetária. A formação de aglutinados plaquetários facilita a transmissão de luz através da
suspensão de plaquetas e a luz captada pelo agregómetro é registada em forma de gráfico. Um
método imunológico, por ELISA, foi desenvolvido recentemente. A ligação entre FvW e
plaqueta, na presença de baixa concentração de ristocetina, é testada, utilizando-se GPIb
plaquetária fixada em placa.
O cofator da ristocetina (FvW funcional livre) mede a capacidade que o FvW plasmático
tem de aglutinar plaquetas na presença de ristocetina. O FvW antigénico permite a quantificação
do FvW presente no plasma do paciente. Ambas as determinações são importantes para
diferenciar os subtipos de DvW(41).
Anti-Xa
As heparinas (HNF e HBPM), o fármaco fondaparinux e os novos anticoagulantes orais

(NOAC) como o rivaroxaban e o apixaban, são utilizados para a prevenção e tratamento de
doenças tromboembólicas.
O FXa ao atuar sobre o seu substrato normal, a protrombina dá origem à trombina,
enzima responsável pela formação do coagulo de fibrina. Na presença de anticoagulantes,
ocorre competição entre este mecanismo e o mecanismo de inibição pelo complexo de
antitrombina formado com a heparina ou o fondaparinux, ou diretamente pelo rivaroxaban ou
pelo apixaban. Sendo assim, torna-se útil determinar a atividade anti-Xa dos NOAC para
complementar o exame clínico na avaliação do estado clínico em situações, e da heparina, para
controlar e adaptar o tratamento.
O método baseia-se na ocorrência de duas reações (simultâneas):
35
 hidrólise do substrato pelo FXa;

 inibição do FXa pelo complexo heparina/fondaparinux – antitrombina ou
diretamente pelo NOAC.
Após o período de incubação, a reação de competição atinge o equilíbrio e a quantidade de pNA
libertada (do substrato cromogénico) é inversamente proporcional à concentração de
anticoagulante presente no plasma do doente.
Neste, como noutros testes efetuados, o resultado deve ser interpretado em função do
estado clinico e biológico do paciente. A atividade anti-Xa obtida destina-se a ser analisada em
função do tratamento administrado ao doente (tipo de anticoagulante, posologia, modo de
administração, hora da colheita, …)(42).
Valores de referência
Os valores de referência dos ensaios acreditados do Lab-4, para os testes específicos

mencionados acima, encontram-se mencionados no Quadro 8.
Quadro 13. Valores de referência de alguns testes específicos executados no Lab-4.
Ensaio Valores de referência

Fibrinogénio 200 – 400 mg/dL
FII
FV
70 - 120% ou 0,7 – 1,2 U/mL
FVII
FX
FVIII 70% - 150% ou 0,7-1,5 U/mL
FIX
70 - 120% ou 0,7 – 1,2 U/mL
FXI
FXII 70% - 150% ou 0,7-1,5 U/mL
AT 80 – 120%
PC 70 – 130%
PS H: 68 – 176%; M: 54 – 155%
RPCA ˃ 0,84
D-dímero < 0,5 µg/mL
FvW 50 – 160%
36
Análises semiautomáticas
Avaliação da função plaquetária.
As disfunções plaquetárias podem ser adquiridas, hereditária ou induzidas por agentes

inibidores da atividade plaquetária. As suas causas podem ser:
 Uremia;
 DvW;
Exposição a agentes como o ácido acetilsalicílico (ASA).
Para detetar as disfunções plaquetárias, o Lab-4 dispõe de um equipamento (PFA – 200
Innovance System), constituído por dois cartuchos de utilização única:
 cartucho de colagénio/EPI Dade PFA (Col/EPI) – primeiro cartucho utilizado para
detetar disfunção plaquetária;
 cartucho de colagénio/ADP Dade PFA (Col/ADP) – utilizado para indicar se um
resultado anormal obtido com o cartucho Col/EPI pode ter sido provocado por efeito do
ASA ou fármacos com ASA.
Ambos os cartuchos, Col/EPI e Col/ADP possuem reagentes (p.ex: colagénio, ADP e
epinefrina) com papel importante no processo de hemostase primária in vivo:
 colagénio – os vasos sanguíneos danificados expõem fios de colagénio, os quais servem
de mediadores da ligação do FvW. Mesmo em condições de elevado fluxo, as plaquetas
conseguem aderir ao FvW, representando a primeira fase da hemostase primária;
 ADP – Nas lesões vasculares são libertadas grandes quantidades de ADP para o sangue;
 epinefrina – as reações sistémicas aumentam o nível de epinefrina.
Todas estas substâncias podem ativar as plaquetas através da interação com recetores
específicos, servindo assim como agonistas no processo de hemostase primária.
Os cartuchos PFA são constituídos por várias peças:
 capilar;
 reservatório da amostra;
 membrana bioquímica ativa com um orifício central circular.
O sangue é aspirado através do reservatório da amostra através do capilar e do orifício,
expondo as plaquetas a condições de elevado fluxo. A membrana está revestida de colagénio e a
fixação das plaquetas ao colagénio provoca o desencadeamento do primeiro estímulo fisiológico
para a ativação plaquetária. Além disso, a membrana está revestida de outros agonistas
(epinefrina, ADP). Assim, durante o teste, ocorre a fixação das plaquetas à membrana. Quando
entram em contato com os agonistas (epinefrina e ADP) são ativadas (libertam-se as substâncias
37
contidas nos seus grânulos), e começam a adesão plaquetária, seguindo-se a agregação. No

sistema PFA, o processo de agregação plaquetária forma um trombo de plaquetas no orifício, o
que faz com que o fluxo sanguíneo diminua gradualmente até que pára. Os agregados formados
são detetados pelas alterações de luz transmitida. O que é medido é o tempo desde o início do
teste até o tampão de plaquetas fechar o orifício (tempo de oclusão).
O indicador para a função plaquetária da amostra de sangue a analisar é o tempo de
oclusão.
Na realização deste teste deve-se ter em atenção algumas interferências:
 baixa contagem de plaquetas e/ou baixa atividade plaquetária;
 baixo nível de FvW;
 hematócrito reduzido devido ao processo de fluxo(43).
Tromboelastografia/Tromboelastometria
A tromboelastografia (TEG) é um método laboratorial que permite:

 avaliar as alterações associadas ao uso de heparina;
 quantificar a ação de fármacos antiagregantes plaquetários;
 monitorizar o efeito de agentes trombolíticos;
 estudar os ajustes de anticoagulação em pacientes com insuficiência cardíaca
avançada portadores de ventrículos artificiais.
Foi originalmente descrito por Hellmut Harter em 1948 e permite uma avaliação global
do processo de iniciação, formação, estabilização e lise do coágulo, registando a interação das
plaquetas e outras células sanguíneas, com as proteínas da coagulação. São registadas as
alterações viscoelásticas que ocorrem durante a coagulação, fornecendo uma representação
gráfica do processo de polimerização da fibrina e também da força do coágulo(45).
No Lab-4 este tipo de teste é executado no equipamento Rotem®. Este equipamento
fornece a representação gráfica da formação e subsequente lise do coágulo. Os parâmetros
medidos na formação e na lise do coágulo podem ser representados num gráfico como o
seguinte(45):
38
Figura 12. Traçado tromboeslastométrico e seus parâmetros.

Fonte: Albert Einstein Medicina Diagnóstica.
A interpretação do traçado tromboeslastográfico, independentemente do equioamento

utilizado (Teg® ou Rotem®) pode ser efetuada da seguinte forma (Quadro 14):
Quadro 14. Interpretação do traçado tromboelastográfico.

Fonte: Albert Einstein Medicina Diagnóstica.
Tempo “r” ou CT Vai desde o inicio do traçado até quando se observa o inicio da formação
de um coágulo reconhecível que, do ponto de vista técnico, é quando a
linha apresenta 2mm de espessura.
Tempo “k” ou CFT Vai do final do tempo “r” até ao momento em que o traçado tem 20 mm de
espessura. Reflete a elaboração e formação do coágulo em função da
trombina formada e traduz a atividade enzimática da trombina.
Valor “r+k” Mede o tempo entre o início do traçado e a espessura de 20 mm. Este valor
está relacionado com a inclinação da curva e, portanto, com a velocidade
de formação do coágulo.
Ângulo α Reflete a dinâmica da formação do coágulo.
Amplitude máxima É a tensão máxima do coágulo, sofrendo influência das plaquetas,
fibrinogénio e FXIII.
Elasticidade 100 x ma/100 – ma ou 100 x MCF/100-MCF
máxima do coágulo
MCF Representa a firmeza máxima do coágulo naquela quantificação.
Tempo MCF (TMA É o período de tempo desde o início da formação do coágulo até à
ou MCF-t) obtenção do MCF.
Amplitude máxima Descreve a amplitude em 5, 10, 15, 20, 25 e 30 minutos após o início da
em x minutos após formação do coágulo.
CT
Lise máxima Representa a fibrinólise máxima evidenciada durante a quantificação. É
definida como a diferença entre a MCF e a menor amplitude após atingir
MCF durante a quantificação.
Índice de fibrinólise Descreve a diferença entre MCF e a amplitude no tempo x após o início da
após x minutos após formação do coágulo.
CT (LI30, LI45,
LI60)
Tempo de lise do Descreve o tempo desde CT até que se observe um coágulo com 10% da
coágulo (CLT) MCF.
Tempo de início de Define o tempo que vai da CT até ao início da lise, que corresponde a uma
lise (LOT) redução de amplitude de 15% da MCF.
Taxa de lise do É a maior lise observada durante a quantificação.
coágulo (CLR)
39
São várias as aplicações da tromboelastografia/tromboelastometria(45):

 avaliação pré-operatória;
 cirurgias e transplantes hepáticos;
 cardiologia e cirurgia cardíaca;
 monitorização de agentes farmacológicos;
 neurologia;
 obstetrícia e neonatalogia;
 hematologia: triagem para estados de hipercoagulabilidade e
hipocoagulabilidade;
 urgências
40
Testes imunoenzimáticos
Deteção de anticorpos anti heparina/PF4
Em pacientes com complicações hemorrágicas e ausência de secreção plaquetária, torna-

se necessária a avaliação da secreção e agregação plaquetárias para o diagnóstico.
Normalmente e em casos de doentes em pós-operatório, torna-se necessário pesquisar a
presença de anticorpos anti heparina/PF4, ajudando assim na decisão de se suspender ou não o
tratamento com heparina. Existem kit comerciais que dão uma resposta rápida a esta questão,
como o caso do STic Expert® HIT da Stago. Trata-se de um “card” que tem a função de
imunoensaio para detetar anticorpos IgG contra complexos heparina/PF4. Ao se adicionar a
amostra e o tampão, ocorre migração através da membrana de nitrocelulose e os anticorpos IgG
do paciente capturados pelos complexos heparina/PF4 são detetados por nanopartículas
coloridas, indicadas pela cor da linha de teste (figura 13).
Figura 13. Kit de imunoensaio “STic Expert® HIT”.

Fonte: Diagnóstica Stago, SAS.
Este teste é rápido e os resultados podem estar disponíveis em 10 minutos. Caso seja
positivo, será uma indicação para o clínico decidir suspender o tratamento com heparina. No
entanto, o estudo deve ser continuado.
Na continuação do estudo, e como confirmatório, um dos testes normalmente utilizado é
a determinação plasmática do fator plaquetário PF4, por ELISA, em kit comercial. No Lab-4 o
kit comercial usado é o da Diagnostica Stago, SAS. Este Kit faz uma deteção qualitativa, no
plasma do doente, dos anticorpos da classe IgG anti-plaquetários gerados nas trombocitopenias
induzidas por heparina (HIT) do tipo II.
Existem dois tipos de HIT:
 tipo I – devido a defeitos proagregatórios da heparina nas plaquetas;
 tipo II – devido a uma reação imunoalérgica (mais raras, mas mais severas).
41
As HIT tipo II ocorrem mais frequentemente em pacientes em tratamento com heparinas

não faccionadas (UFH). As quebras abruptas de plaquetas ocorrem normalmente nos primeiros
5 a 14 dias do início do tratamento, são frequentemente associadas a tromboses venosas ou
arteriais. Se não houver complicações os níveis de plaquetas voltam para valores normais dentro
de 4 a 7 dias após o tratamento com heparina ter finalizado.
A principal causa para essa baixa dos níveis de plaquetas é a existência de anticorpos
contra os complexos heparina-PF4. Estes anticorpos são principalmente da classe IgG, mas
também podem ser das classes IgA e IgM. A presença destes anticorpos não significa
necessariamente que se esteja perante uma trombocitopenia, mas pode ser um sinal de alerta. É
importante salientar que os anticorpos anti complexo heparina-PF4 podem não ser detetados em
15% dos casos de HIT tipo II. Assim, os resultados obtidos com kit Asserachrom HPIA – IgG
devem ser sempre interpretados em função do estado clínico do paciente.
O princípio do teste (ensaio imunoenzimático) é o seguinte (Figura 12):
1. Os anticorpos a serem detetados são capturados pelos complexos heparina-PF4
do reagente 1, que estão a revestir as paredes internas dos poços da microplaca;
2. São adicionados anticorpos anti-IgG humanos acoplados com peroxidase
(reagente 2) que se vão ligar aos determinantes antigénicos disponíveis dos
anticorpos imobilizados;
3. A atividade enzimática da peroxidase é revelada através da sua ação sobre o
substrato cromogénico TMB (reagente 3);
4. A reação é parada com a adição de um ácido forte (reagente 4);
5. A intensidade da cor produzida está relacionada com os níveis de anticorpos
inicialmente presentes na amostra de plasma do doente(44).
Figura 14. Princípio do método do Kit de imunoensaio ELISA “Asserachrom HPIA – IgG”.
Fonte: Diagnóstica Stago, SAS.
42
Deteção de anticorpos anti plaquetários

Em pacientes com determinadas patologias hematológicas (p.ex: leucemias, LES), com
infeções víricas, ou que sofreram aloimunização (p.ex: transfusões ou gravidez), pode ocorrer
uma destruição imunológica das plaquetas. Existem testes de deteção de anticorpos “in vitro”
capazes de revelar a presença desses anticorpos no plasma do paciente. O Lab-4 do SIH do
CHSJ utiliza um desses testes, o “Capture-P® Solid Phase System” da Immucor, com a
finalidade de pesquisar a presença de anticorpos anti-plaquetários não expectáveis nos plasmas
dos pacientes.
Neste sistema de deteção de anticorpos em fase sólida “Capture-P®”, as plaquetas do
paciente ligam-se à superfície dos poços de polistireno das microplacas. Em seguida elas vão
capturar os anticorpos presentes no plasma do paciente. No período de incubação dá-se essa
ligação entre os anticorpos (se estiverem presentes) e as plaquetas. Depois lava-se os
micropoços para deles retirar as imunoglobulinas que não se ligaram especificamente.
Adiciona-se de seguida uma suspensão de células indicadoras cobertas com anticorpos anti-IgG.
A centrifugação faz com que as células indicadoras entrem em contato com os anticorpos
ligados às plaquetas imobilizadas. No caso dos testes positivos, a migração das células
indicadoras para o fundo do poço é impedida à medida que se vão formando as pontes de
ligação entre as células indicadoras e os anticorpos complexados com as plaquetas. Como
consequência dessa ação, as células indicadoras cobrem as plaquetas numa monocamada
confluente. Em contraste, na ausência de interações anticorpos-plaquetas, as células indicadoras
não são impedidas de migrar, e formam um botão bem definido no fundo do poço.
43
Controlo da Qualidade
Controlo da Qualidade Interno
O controlo da qualidade interno (CQI) consiste na análise diária de amostras controlo

(fornecidas pelas casas comerciais), cujos valores analíticos são conhecidos, avaliando a
precisão dos ensaios. Este controlo permite garantir a reprodutibilidade dos resultados, verificar
a calibração dos sistemas analíticos e a ocorrência de não conformidades que desencadearão
ações corretivas.
No Lab-4 são utilizados dois níveis de controlo interno, o controlo normal e o
patológico. Estes controlos são utilizados nos testes de aPTT, TP, fibrinogénio e INR. “Quali-
Clot I e II” são controlos específicos para os testes de P&P, AT, PC e PS. Para os ensaios dos
D-dímeros, utilizam-se os controlos “Liatest” normal e patológico
Controlo da Qualidade Externo
O Controlo de Qualidade Externo (CQE) é um controlo interlaboratorial em que o

resultado de cada parâmetro realizado no laboratório participante é comparado com a média de
consenso do seu grupo. Para a determinação desta média os fornecedores do programa de CQE
usam os resultados enviados pelos laboratórios e agrupam-nos de acordo com as metodologias
utilizadas nos ensaios, para cada parâmetro. Fazem então a comparação dos resultados de um
laboratório com o dos outros laboratórios participantes, determinando assim a exatidão dos
resultados. Deste modo, o CQE tem como objetivo padronizar os resultados de alíquotas da
mesma amostra, executadas em laboratórios diversos, permitindo determinar e ajustar a
exatidão dos métodos utilizados. Com a participação nos programas de CQE o lab-4 assegura
que os resultados obtidos dos diversos parâmetros realizados se aproximam o máximo do valor
real (exatidão) dentro de uma variabilidade analítica permitida. Este controlo permite garantir a
reprodutibilidade dos resultados, verificar a calibração dos sistemas analíticos e a ocorrência de
não conformidades que desencadearão ações corretivas.
O lab-4 do SIH do CHSJ participa nos programas de CQE:
 UK NEQAS (United Kingdom External Quality Assessement Schemes)
 ECAT (External Quality Control of Diagnostic Assays and Tests).
Figura 15. Programas de CQE em que o Lab-4 participa.
44
Validação e envio de resultados
Na continuação da rotina laboratorial do lab-4, desde que tenham sido cumpridos todos
os requisitos procedimentais, da qualidade, e manutenção dos equipamentos e controlo dos
reagentes, pode-se proceder à análise críticas dos resultados e sua validação.
O processo de validação no lab-4 está distribuído em dois níveis de responsabilidade,
técnica (T) e médica (M) (Quadro 14).
Quadro 15. Validação dos resultados analíticos.

Nível de responsabilidade Validação
Médica (M) Resultados que não estejam dentro dos limites normais
definidos e que não estejam de acordo com o histórico
das analises do doente.
Técnica (T) Resultados dentro dos limites normais definidos, ou
que estejam de acordo com o histórico do doente.
Sempre que s resultados sejam coerentes com o diagnóstico, são considerados

validáveis. Após a validação, os resultados são transmitidos para o sistema informático
“SISLAB”.
A verificação de resultados não concordantes com o diagnóstico obriga à realização de
ensaios complementares, tendo em vista o esclarecimento dos resultados obtidos. Se a
realização de ensaios complementares levar ao esclarecimento da situação, os resultados serão
considerados validáveis e transmitidos para o sistema informático “SISLAB”. Se não se
conseguir esclarecer a situação, é da competência do médico estabelecer contacto com o médico
requisitante.
45
Conclusão
O estágio em Hemostase no SIH do CHSJ foi uma experiência muito gratificante uma
vez que me permitiu estar em contacto com profissionais competentes e sempre disponíveis, que
muito contribuíram para a minha integração no ambiente de trabalho do laboratório, apoiando-
me na execução das tarefas que me foram confiadas, e esclarecendo sempre pedagógica e
atenciosamente todas as dúvidas colocadas. A estes profissionais quero, portanto, agradecer por
todos os motivos já referidos e ainda pelo facto de sempre me terem incutido uma boa conduta
profissional assim como sentido de responsabilidade e consciencialização que muito se exige
num laboratório de análises clínicas ao nível hospitalar.
Os objetivos inicialmente propostos foram atingidos. Os conhecimentos adquiridos nas
aulas puderam ser aplicados e aprofundados, outros conhecimentos novos foram adquiridos e
inúmeros casos práticos puderam ser presenciados e seguidos.
De um modo geral, considero o estágio que realizei muito positivo, uma vez que tive a
oportunidade de continuar a aprender, adquirir competências e aplicar os conhecimentos
adquiridos ao longo da vida académica.
46
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49

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Escola Superior de Saúde

Sérgio José Pinto Teixeira

ÍNDICE GERAL ....................................................................................................................................................... II

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................................. IV

ENQUADRAMENTO TEÓRICO - HEMOSTASE ........................................................................................................ 3

Fator de von Willebrand...................................................................................................................................................33

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................................................... 47

Figura 1. Base bioquímica da ativação e secreção plaquetárias-------------------------------------------------5

Figura 2. Representação esquemática da cascata da coagulação------------------------------------------------6

Figura 3. Fases da coagulação de acordo com a nova cascata---------------------------------------------------7

Figura 4. Visão atual da cascata da coagulação--------------------------------------------------------------------9

Figura 5. Complexos procoagulantes Protrombinase e Tenase Intrínseca------------------------------------11

Figura 6. Representação esquemática do processo de fibrinólise----------------------------------------------14

Figura 7. Gráfico para a correção do volume de anticoagulante-----------------------------------------------17

Figura 8. Equipamentos para análise automática no Lab-4-----------------------------------------------------19

Figura 9. Investigação do Tempo de Trombina prolongado----------------------------------------------------22

Figura 10. Investigação do Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada prolongado------------------------23

Figura 11. Investigação da presença de LA no plasma----------------------------------------------------------33

Figura 12. Traçado tromboeslastométrico e seus parâmetros--------------------------------------------------39

Figura 13. Kit de imunoensaio “STic Expert® HIT------------------------------------------------------------41

Figura 15. Programas de CQE em que o Lab-4 participa. -----------------------------------------------------44

Quadro 1. Agonistas fisiológicos para a ativação plaquetária---------------------------------------------------4

Quadro 2. Mecanismos antitrombóticos naturais das células endoteliais--------------------------------------9

Quadro 3. Possíveis causas para ocorrência de fenómenos trombóticos--------------------------------------12

Quadro 4. Equipamentos de análise automática e semi-automática do Lab-4-------------------------------19

Quadro 5. Valores de INR a manter relativamente à condição clínica----------------------------------------21

Quadro 6. Patologias associadas a INR prolongado-------------------------------------------------------------21

Quadro 7. Avaliação de alterações hemostáticas com três testes de rastreio---------------------------------24

Quadro 8. Valores de referência de alguns testes executados no Lab-4--------------------------------------25

Quadro 9. Deficiência congénitas da antitrombina--------------------------------------------------------------26

Quadro 10. Deficiência congénitas de PC------------------------------------------------------------------------27

Quadro 11. Deficiência congénitas de PS-------------------------------------------------------------------------28

Quadro 12. Apresentação de resultados para o teste da RPCA------------------------------------------------30

Quadro 14. Interpretação do traçado tromboelastográfico------------------------------------------------------39

Quadro 15. Validação dos resultados analíticos-----------------------------------------------------------------45

NOAC – novos anticoagulantes orais

Serve o presente relatório para descrever, sinteticamente, o trabalho realizado ao longo

 proceder à realização de métodos de avaliação e diagnóstico de doenças hemorrágicas:

Enquadramento Teórico - Hemostase

Adesão e ativação plaquetárias

 GPIb/V/IX - fator von Willebrand (FvW);

Secreção e agregação plaquetárias

Após os primeiros eventos de adesão plaquetária, as plaquetas sofrem uma alteração

O conteúdo dos grânulos alfa desempenha um papel importante na formação e

Figura 2. Representação esquemática da cascata da coagulação. [Marder VJ, 2006].

Contudo, recentemente, a coagulação tem sido descrita como um processo complexo

Figura 4. Visão atual da cascata da coagulação. [Moreira AL, 2001].

A antitrombina (AT), a proteína C (PC), proteína S (PS) e TFPI são os principais

Figura 5. Complexos procoagulantes Protrombinase e Tenase Intrínseca. [Greer JP et al, 2014].

Fator inibidor da via do fator tecidual

A TFPI é uma proteína plasmática, inibidora de proteases, que participa na regulação na

Perante uma perturbação na célula, é libertado ácido araquidónico dos fosfolípidos da

O sistema fibrinolítico é responsável por dissolver os coágulos de fibrina. Este processo

Figura 6. Representação esquemática do processo de fibrinólise. [Kolev K, 2014].

Os principais ativadores da fibrinólise são o ativador de plasminogénio tecidual (tPA) e

O inibidor da plasmina ou α2 – antiplasmina inibe eficazmente a plasmina livre que escapa do

O correto diagnóstico de uma patologia com implicações no normal funcionamento das

Amostras para estudos de coagulação

A quantidade de anticoagulante necessária para o acerto num tubo de 5 mL é calculada com

Figura 7. Gráfico para a correção do volume de anticoagulante em 5,0 mL de sangue quando o

Após a correção, deve ser pedida colheita de nova amostra.

Verificação das amostras no Lab-4

Processamento das amostras

Figura 8. Equipamentos para análise automática no Lab-4.