Lidia Luz - Biomedicina noturno/ 2021

POTENCIAIS DE MEMBRANA POTENCIAL DE REPOUSO

Distribuição de solutos:
 O corpo encontra-se em estados estacionários dinâmicos;
 O corpo humano é eletricamente neutro;
 O compartimento intracelular não é eletricamente neutro;
Transporte ativo de íons para fora da célula:
 Cria um gradiente elétrico;
Gradiente Eletroquímico
 Cria também um gradiente de concentração;
Potencial de Membrana:
 É o gradiente elétrico entre os líquidos extra e intracelular;
 Repouso: ocorre em todas as células vivas;
 Potencial: gradiente elétrico é uma forma de energia armazenada, ou energia potencial
 Potencial de Repouso:
É a diferença de potencial elétrico através da membrana plasmática da célula;
Potencial elétrico no LEC = ZERO;
Potencial elétrico na célula = NEGATIVO em relação ao LEC;
Origem do potencial de repouso:
 A membrana plasmática atua como um CAPACITOR: duas superfícies condutoras separadas
por uma fina lâmina isolante, usado para armazenar cargas elétricas ou energia elétrica.
 Principal carga negativa no interior da membrana: PAND = proteínas aniônicas não-
difusíveis;
 A presença de canais na membrana celular permite o fluxo de íons, criando uma corrente
elétrica;
 As membranas são seletivamente permeáveis;
 Este fluxo ocorre pela distribuição desigual dos íons nos dois lados da membrana;
 K+, Na+ e Cl- são os principais íons envolvidos na gênese dos potenciais de membrana;
 K+ é o responsável pelo potencial de repouso.
 Todas as células possuem um potencial de repouso, que varia de célula-célula;
 Células Excitáveis: utilizam uma perturbação do potencial de repouso (POTENCIAL DE AÇÃO) para a
comunicação célula-célula:
Neurônios (potencial repouso = -70 mV);
Músculo (potencial repouso = -90 mV);
Células secretoras endócrinas.
Equilíbrio químico verdadeiro:
 Depende apenas da concentração do soluto, que difunde-se livremente até atingir concentrações iguais em
ambos os lados;
 Não existe diferença de potencial elétrico.
Equilíbrio Eletroquímico de Gibbs-Donnan:
 Existe diferença de potencial elétrico entre os compartimentos;
 Depende da concentração do soluto e da distribuição das cargas (o íon difunde-se, atingindo o equilíbrio
com distribuição desigual das cargas móveis);
Potenciais de equilíbrio:
 Se a diferença de concentração de um íon através da membrana é conhecida, o potencial de equilíbrio para
este íon pode ser calculado pela EQUAÇÃO DE NERNST.
Potencial de Repouso nas Células não-excitáveis:
 O K+ sai da célula pelos canais de vazamento até próximo do seu potencial de equilíbrio;
Gradiente eletroquímico: direciona o K+ para fora da célula;
O K+ sai mas é atraído na face externa da membrana pelas cargas negativas das PAND  criando a
diferença de potencial da membrana em repouso;
 Estas células atingem o equilíbrio eletroquímico de Gibbs-Donnan;
 Sem necessidade de ATP (o precesso é espontâneo);
Potencial de Repouso nas Células Excitáveis:
 As células excitáveis são permeáveis a mais de um íon:
K+, Na+ e Cl-.
Estes íons apresentam diferentes permeabilidades (número de canais disponíveis);
 Estas células não atingem equilíbrio de nenhum tipo, já que são permeáveis ao Na+, que entra na célula a
favor de seu gradiente eletroquímico;
 Bomba Na+/K+ATPase é reponsável por manter os gradientes dos íons Na+e K+;
Por utilizar ATP, logo, o processo não é espontâneo;
 Como calcular o valor do potencial de repouso? EQUAÇÃO DE GOLDMAN-HODGKIN-KATZ.
Mundanças no Potencial de Repouso:
 O que causa as modificações no potencial de membrana? Alterações nas permeabilidades aos íons (Quando
Na+, Cl- e Ca2+ têm permeabilidade muito baixa no potencial de repouso, o K+ pode ter sua permeabilidade
aumentada ou diminuída)
 Grandes alterações no potencial de membrana são causadas por alterações minúsculas nas concentrações
iônicas (POUCAS CARGAS ECONOMIA DE ENERGIA);
 Os processos de bioeletrogênese ocorrem PRÓXIMOS À MEMBRANA;
(DISTÂNCIAS CURTAS  ALTAS VELOCIDADES  POUCO TEMPO (ms)).

Estímulo:

1) Potencial de repouso;
2) Despolarização (entre 1 e 2 é o período refratário absoluto);
3) Repolarização
4) Hiperpolarização: período refratário relativo (todo o 4);
X) Abertura das bombas de Na+/K+;
*-60: Lei do tudo ou nada: se o estímulo passar de -60mV, então acontece.
*Quando atinge o limiar, ocorre a abertura dos canais de voltagem dependentes de
Na+;
*Ao atingir +45mV os canais se fecham e se abrem os canais de retificação de K+,
que provoca a saída (mais do que necessário) de K+, deixando a célula mais
negativa;
*Para reestabelecer o potencial de repouso em -90mV a bomba de Na+/K+ é
ativada;
*A hiperpolarização ocorre devido à demora de os canais se fecharem;
*O equilíbrio é estabelecido pela bomba: sai 3Na+ e entra 2K+;

Resposta ao estímulo: Após o estímulo a célula se torna positiva, para poder receber um novo estímulo, ela deve
voltar ao seu potencial de repouso;
Hipercalemia: [K+] decresce, aumentando o nº do potencial de repouso (negativando ainda mais) pois o K+ tem
a tendência de sair mais da célula, ficando mais negativa.
Hiperpolarização: diminuição da ddp, onde o V esta mais negativo;
Potencial de Repouso: ddp da membrana plasmática que acontece em todas as células;
Diâmetro do axônio e a presença de bainha de mielina afetam a velocidade de condução do potencial de ação;
Não há a possibilidade de um novo estímulo disparar outro potencial de ação, mesmo sendo mais intenso se a
célula estiver no período refratário absoluto;
 BIOFÍSICA DA VISÃO
Olho e Visão:
 Olho: receptor sensorial que funciona como uma máquina fotográfica;
Lente e abertura (pupila);
Superfície sensível à luz (retina);
É o órgão especializado para a detecção, localização e análise da luz.
 Visão: processo pelo qual a luz refletida pelos objetos é transformada em imagem no encéfalo;
Entrada da luz e focalização pelo cristalino;
Transduçãoda energia luminosa em sinal elétrico pelos fotorreceptores;
Processamento dos sinais elétricos em imagens visuais pelas vias neurais da retina até o cérebro.

Superfícies refratoras do olho:

 Interface ar-córnea;
 Interface córnea-humor aquoso –2/3 da refração total;
 Interface humor aquoso-cristalino;
 Interface cristalino-humor vítreo –1/3 da refração total;

 Cristalino: Possuí a capacidade de mudar sua forma para focalizar a luz, principalmente para objetos
próximos, em que a luz não é mais paralela, e que há a necessidade de poder de refração maior para
focalização.

Focalização:
 Quando a luz passa através do cristalino do olho, o ponto focal e a imagem devem incidir precisamente sobre
a retina para o objeto ser visto no foco;
 Acomodação: quando o objeto está muito próximo a lente deve alterar sua forma para modificar o ângulo de
refração
É o processo pelo qual o olho ajusta a forma do cristalino para manter os objetos no foco;
Ponto próximo da acomodação é a menor distância na qual conseguimos focalizar um objeto;
Músculos ciliares:

Diâmetro pupilar:
 Íris: membrana móvel, que determina a coloração do olho
Ela atua como um diafragma, limitando a área iluminada do cristalino;
Controla a quantidade de luz que chega à retina;
 Pupila: É a abertura da íris;
Midríase  Aumento do diâmetro pupilar (Dilata);
Miose  Redução do diâmetro pupilar (Contraí).

Estrutura da Retina:
 Porção neural do olho, organizada em camadas com 5 tipos de neurônios:
Fotorreceptores; Células amácrinas;
Células bipolares; Células horizontais;
Células ganglionares;
 Epitélio pigmentado: contém grânulos de melanina (é a camada escura que absorve a luz não captada pelos
fotorreceptores, impedindo a reflexão da luz).

Informação sensorial:
Retina:
 Cones e bastonetes: são os fotorreceptores;
Cones  detecção da luz e da cor, sob grande intensidade luminosa;
Bastonetes  não discriminam cores (luz monocromática), ativados em baixa intensidade de luz;
 Informação sensorial:
Fotorreceptores  neurônios bipolares  células ganglionares (cujos axônios formam o nervo óptico)
 Ponto cego:
localizado no disco do nervo óptico (região onde os axônios das células ganglionares se agrupam);
conhecido pela ausência de fotorreceptores;
 Fóvea:
Presença somente de cones;
Fotorreceptores recebem a luz diretamente (neurônios ficam de lado, e não há vasos sanguíneos);
Ponto onde a luz é focalizada;
Fóvea e mácula lútea: são os locais de visão mais acurada, constituem o centro do campo visual;
 Fotorreceptores:
Estrutura:
 Segmento externo: discos membranosos com os pigmentos visuais;
 Segmento interno: núcleo e organelas;
 Terminal sináptico: liberação de glutamato nas células bipolares.
Bastonetes em maior número que os cones 20:1 (exceto na fóvea);
Transdução da energia luminosa em alterações do potencial de membrana.
BASTONETES:
 Pigmento visual: RODOPSINA (substância cromófora = opsina + retinal);
 Absorção de luz (fótons): 11-cis-retinal  todo trans-retinal.
CONES:
 Possuem três diferentes pigmentos intimamente relacionados com a rodopsina pigmentos das
cores (vermelho, azul e verde)  diferenças na sensibilidade espectral.

Fototransdução:
Visão em Cores:
 Cada cor é criada pela mistura adequada de uma proporção de luz vermelha, verde e azul (cores primárias das
cores da luz visível);
 A mistura de luzes vermelhas, verdes e azul determina uma ativação igual dos três tipos de cones, resultando
na percepção do branco;
 Cones: três diferentes opsinas:
Sensível a ondas curtas = AZUL
Sensível a ondas médias = VERDE
Sensível a ondas longas = VERMELHO
Ativação dos três tipos simultaneamente resulta no BRANCO.

Potenciais:
 Células Ganglionares: neurônios de projeção da retina, transmitem informação às estruturas cerebrais,
geram o potencial de ação;
 Células Bipolares: ligam receptores às células ganglionares (Potencial eletrotônico);
 Células Amácrinas e Horizontais: modulam a informação entre os outros 3 tipos celulares (Potencial
eletrotônico);

Via visual – retinotopia:

 As células ganglionares projetam-se para o núcleo geniculado lateral de maneira ordenada formando um
mapa retinotópico;

Problemas:
 Derivados de erros de reflexão (Ametropia):
Miopia: formação da imagem se dá antes da retina/ Correção: lente côncava (divergente);
Hipermetropia: formação da imagem se dá depois da retina/ Correção: lente convexa (convergente);
Astigmatismo: curvatura da córnea defeituosa/ Correção: lente cilíndrica;
Presbiopia: Cristalino anormal, perda da convergência;
 Derivados da percepção de cores:
Cegueira noturna: falta de vitamina A ocasionando falta de rodopsina, defeitos na visão com pouca
luz;
Daltonismo: herança ligada ao sexo, os genes para os fotopigmentos vermelho e verde estão no X;
Albinismo: Ausência de melanina no epitélio pigmentoso da retina;
 Glaucoma: aumento da pressão intra-ocular associado a danos no nervo óptico por compressão;
 Estrabismo: desequilíbrio dos músculos extra-oculares.

BIOFISICA DA AUDIÇÃO E DO EQUILIBRIO

Orelha:
 É o órgão sensorial especializado em duas funções distintas: audição e equilíbrio;
 Audição é a percepção sensorial da energia carregada pelas ondas sonoras:
orelha externa; [ar]
orelha média (membrana timpânica e ossículos); [ar] [Meios de condução das ondas sonoras]
orelha interna (cóclea). [líquido]
 Equilíbrio: informação sobre a posição da cabeça e do corpo e como se movimentam:
Orelha interna (canais semicirculares, sáculo e utrículo).
Som:
 Sensação produzida na orelha humana por um trem de ondas que percorre um meio elástico e que satisfaz
certas frequências e intensidade;
 Distinção entre sons:
Intensidade: ligada à amplitude das vibrações;
 Relacionada à Amplitude da onda;
 Diferencia sons fortes de sons fracos;
 Intensidade sonora audível para o ser humano: 0 a 120 dB.
Altura: ligada à frequência sonora;
 Relacionada à frequência da onda;
 Diferencia sons graves (baixos) de sons agudos (altos);
 frequência sonora é codificada em um local específico da cóclea;
 Faixa audível: de 20 Hz a 20 KHz.
Timbre: depende dos harmônicos associados ao som fundamental (permite distinguir sons de
diferentes fontes mesmo que tenham a mesma frequência e amplitude).

Orelha média:
 Ossículos:
Martelo, bigorna e estribo;
 Funcionam como um sistema de alavanca que multiplica a força de vibração pouca energia sonora é
perdida ocorre a amplificação do som;
 Vibração dos ossículos estribo puxa e empurra a membrana da janela oval  criação de ondas nos canais
cheios de líquido da cóclea.
Orelha interna:
 Cóclea: Três canais paralelos cheios de líquido:
Rampa do vestíbulo Ducto coclear Rampa do tímpano
Conectam-se na ponta da cóclea pelo helicotrema.
 Helicotrema

Rampa do tímpano e do vestíbulo preenchidas com perilinfa (composição iônica semelhante à do

plasma);
Ducto coclear preenchido com endolinfa (composição iônica semelhante à do líquido intracelular);

 Ducto coclear - órgão espiral (de corti)

Estrutura composta de células receptoras ciliadas e células de sustentação;
Parcialmente coberto pela membrana tectória;
Tecidos flexíveis que se movem em resposta a ondas de líquido que passam pela rampa do vestíbulo;
 Células receptoras ciliadas:
Células não neurais;
Cílio mais longo (cinocílio) inserido na membrana tectória, quando a membrana movimenta, o
cinocílio se movimenta;
Inclinação dos estereocílios: despolarização ou hiperpolarização;
Efeito de transdução.
Células ciliadas: ciliadas internas (principal eferência coclear) e ciliadas externas (amplificador
coclear);
Via auditiva:
Cóclea  nervo vestibulococlear  bulbo  ponte  mesencéfalo  córtex auditivo

Localização de um som:
 Entrada simultânea dos sinais de ambas as orelhas;
 Registro da diferença no tempo de chegada do som às orelhas;

Perda auditiva:
 Surdez de condução: Obstrução do meato acústico externo (cerume, infecção) ou traumas que impedem a
vibração dos ossículos;
 Surdez nervosa:
Perda auditiva central: vias neurais entre orelha e córtex;
Perda auditiva sensório-neural: lesões na orelha interna (morte das células ciliadas por exposição a
ruídos altos);
 Teste de Rinne, Teste de Weber para identificar a surdez;

OLFAÇÃO E GUSTAÇÃO
 Quimiorrecepção: Detecção de substâncias químicas do meio ambiente;

Gustação:

 Estímulos gustatórios:
Moléculas não-voláteis e hidrofílicas;
Quanto maior o estímulo, maior a percepção da intensidade do sabor;
Saliva:
 Solvente;
 Auxilia as substâncias a alcançarem o interior da papila (receptores);
 Remove estímulos químicos;
 Órgãos da gustação:
Língua;
 Papilas:
–Fungiformes (anterior e lateral);
–Valadas (base);
–Filiformes (anterior e lateral).
 Botões Gustatórios (um a centenas em cada papila):
–Cada botão apresenta 50 a 150 células receptoras gustatórias;
–Células receptoras = 1% superfície epitélio lingual;
 2000 a 5000 botões gustatórios.
Palato;
Faringe;
Epiglote;
Cavidade nasal (aromas);

 Células receptoras gustatórias:

Critérios histológicos: não são neurônios;
Vida média de 2 semanas;
Microvilosidades contém quimiorreceptores;
  Sabores:
Sabores básicos: salgado, azedo (ácido), doce, amargo, umami;
Comida: sabor distinto resulta da soma de seu gosto e cheiro, percebidos simultaneamente;
 Células receptoras gustatórias:
Cada células gustatória é sensível a apenas um gosto único;
 Transdução gustatória:
Células gustatórias do tipo II: gosto amargo, doce e umami  diferentes receptores acoplados à
proteína G
 Gustducina: Ativação de várias vias de transdução do sinal  liberação de Ca2+ dos estoques
intracelulares ou abertura de canais de cátions na membrana, permitindo entrada de Ca2+;
Células receptoras do tipo III: gosto salgado e azedo  Canais Iônicos
 Salgado: entrada do Na+ por canal e despolarização da célula;
 Azedo: despolarização da célula por mecanismos incertos (atuação em canais iônicos);

 Vias de gustação:

Olfação:

 Funções:
Identificação de alimentos (paladar)  respostas motoras viscerais (salivação, motilidade gástrica);
Alerta para perigos;
Sistema de comunicação (feromônios);
Comportamento reprodutivo.
 Epitélio olfatório:
Odorantes: substâncias dissolvidas no muco que interagem com receptores dos neurônios olfatórios;
Células receptoras olfatórias:
 São neurônios bipolares;
 Dendritos sobre a superfície do epitélio olfatório, e axônios até o bulbo olfatório;
 Dendritos  cílios que contêm os receptores de odorantes;
  Transdução olfatória:

 Adaptação  Fadiga olfatória:

Presença continuada de um estímulo;
↓ capacidade identificação odores durante exposição prolongada;
Redução PA em resposta à presença de um odorante;
 ↑ Ca2+ ligado a calmodulina, ↓ sensibilidade do canal ao AMPc;
 Extrusão de Ca2+ por ativação proteínas trocadoras de Na+/Ca2+, reduzindo a amplitude do
potencial do receptor;
 Fosforilação do receptor;
 Bulbo olfatório:
Possuí os glomérulos olfatórios (Cada glomérulo: 25.000 terminais de axônios olfatórios primários 
100 dendritos de neurônios de segunda ordem);
 Problemas:
Anosmia: incapacidade de identificar odores;
Anosmia Específica: sensibilidade diminuída a um agente específico;
 Ocorrência de 20% na população.
Hiposmia: sensação diminuída (resfriados).

MÉTODOS BIOFÍSICOS DE ANÁLISE – ELETROFORESE

 Eletroforese é o método biofísico de estudo das soluções pela separação dos componentes de um sistema
pela aplicação de um campo elétrico;
 Existem duas etapas:
Preparativa: obtenção de produto indireto, que não é analisado na eletroforese (Southern blot);
Analítica: resultado observado diretamente na eletroforese:
 Qualitativa: análise da pureza de proteínas de uma amostra;
 Quantitativa: quantidade da substância é analisada no gel.
Usos:
Sequenciamento de DNA, expressão gênica, diagnósticos, desenho de drogas, caracterização de
proteínas, [...]
 O que causa a separação é a diferença de mobilidade, μ, entre os vários componentes da amostra:
Carga da molécula
Coeficiente de fricção
 A mobilidade eletroforética também é representada pela razão entre a velocidade de migração e o campo
elétrico aplicado:
  A mobilidade de uma substância em um campo elétrico depende de:
Sinal da carga (orienta o sentido da migração); Distância entre os eletrodos;
Intensidade da carga (deslocamento é proporcional à intensidade); Tempo de corrida;
Grau de dissociação (carga depende do pH do meio); Tamanho e forma da partícula;
Concentração eletrolítica do meio (atração eletrostática de cargas); Viscosidade do meio;
Força do campo elétrico; Anfóteros.
 Todas partículas da mesma espécie possuem mesma carga e se repelem mutuamente, evitando
conglomerações, formação de complexos e reações;

Tipos de eletroforese:
 Em gel: o tempo de migração é igual para todos os analitos;
 Capilar: a distância percorrida é igual para todos os analitos;

Eletroforese capilar

Eletroforese em Gel:
 Gel é utilizado como matriz de separação, que cria uma malha promovendo maior atrito entre ela e as
moléculas durante a eletroforese, permitindo a separação das moléculas pelo seu tamanho;
 Princípios:
Carga elétrica da molécula;
Aplicação de campo elétrico;
Migração da molécula através de uma malha com poros de tamanho variável (gel);
Densidade do gel;
Tamanho da molécula.
 Ajuste da intensidade do campo:
Voltagem (V): diferença de potencial;
Amperagem (A): corrente elétrica;
Potência (W)= V.A.
Voltagem = resistência x corrente
 Tampão:
Permite fluxo de elétrons (aceptor e doador de prótons);
Composição e força iônica influenciam na migração das moléculas;
TAE (Tris – ácido acético – EDTA) e TBE (Tris – ácido bórico – EDTA).

Eletroforese de Proteínas
 Gel de poliacrilamida – acrilamida e bis-acrilamida
Une cadeias de acrilamida e faz a polimerização induzida por persulfato de amônio e TEMED;
 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
Detergente aniônico: serve para desnaturação das proteínas, conferindo a elas carga negativa
(migrarão para o ânodo).
Eletroforese de ácidos nucléicos:
 Poliacrilamida;
 Agarose (polissacarídeo extraído de algas marinhas);
Não necessita agentes polimerizantes.
 Visualização:
Adição de agentes intercalantes das moléculas de ác nucléico ao gel;
Brometo de etídio (EtBr): Quando intercalado ao DNA, fluoresce se exposto a luz UV;
Eletroforese Bidimensional:
 Separação simultânea de centenas a milhares de proteínas;
 1ª dimensão: separa as proteínas de acordo com o ponto isoelétrico (pI) = focalização isoelétrica;
Radicais polares dos aminoácidos comportam-se como ácidos ou bases fracas, podendo sofrer
ionização de acordo com o pH;
Quando a resultante das cargas da proteína é zero a proteína não migra em um campo elétrico, e o
valor de pH em que isto ocorre é denominado ponto isoelétrico;
Se a matriz na qual é aplicada a mistura de proteínas apresenta um gradiente de pH, cada proteína
migrará até encontrar o pH equivalente ao seu pI, no qual a proteína para de migrar;
 2ª dimensão: separa as proteínas de acordo com a massa  SDS-PAGE.

MÉTODOS BIOFÍSICOS DE ANÁLISE – ESPECTROFOTOMETRIA

 A espectrofotometria utiliza a absorção da luz por substâncias em solução para obter informações
qualitativas e quantitativas:
Podendo determinar a concentração da substância;
Ou identificar uma substância, avaliar o grau de pureza de soluções, determinar os λ absorvidos
pelas substâncias;
 Há a utilização de métodos colorimétricos: uso de compostos corados (absorção de luz visível);
 Uso também de espectro ultravioleta.
Comprimentos de onda da luz visível: Conteúdo energético da luz é inversamente proporcional ao comprimento de
onda.
Absorção de luz pela matéria:
 Absorção de luz pela matéria  incorporação da energia contida no fóton;
Moléculas passam do estado fundamental para o estado excitado;
Retorno ao estado fundamental libera energia na forma de calor ou luz;
 Conteúdo energético do fóton = quantidade de energia necessária para que o átomo ou
molécula passe do estado fundamental para o excitado interfere na escolha do comprimento de
onda adequado;
 Quando uma luz visível ou ultravioleta incide sobre uma substância, uma parte é refletida, outra é absorvida
e outra é transmitida;

Princípios de absorção:

 Concentração da substância;
 Distância (caminho óptico).
Lei de Lambert-Beer:
 Transmitância: razão entre a intensidade de luz transmitida e a luz incidente;
T = I1/ I0
 Relação não linear  utiliza-se a absorbância:
A = -logT = -logI1/I0= logI0/I1
Absorbância depende de c, de ε e de l:
A=cεl

 Condições da lei de Lambert-Beer:

Luz monocromática;
Soluções diluídas;
Somente uma substância absorvente de luz;
Limite de linearidade (proporcionalidade entre A e c deixa de existir em soluções mais concentradas);
 Fatores que influenciam a absorbância:
Natureza do solvente;
pH;
Temperatura;
Concentração dos eletrólitos;
Substâncias interferentes (DNA/RNA  proteínas).
Espectro de absorção:
 Determinação da concentração de soluções;
 Análise da composição de uma solução;
 Análise da cinética de uma reação;
 Definição do λ a que uma solução apresenta maior absorbância.
Natureza da cor:
 Cor absorvida: λ absorvido pelo meio no qual a luz é incidida;
 Cor percebida: λ refletido. Cor complementar à absorvida.
Instrumentação –Espectrofotômetro:
 Determinação da transmitância e da absorbância de uma solução em um ou mais comprimentos de onda.

Curva-padrão, curva de calibração ou curva de referência:

 Relação entre valores de absorbância e de concentração da solução
 Fator de Calibração:

 Curva de Calibração: leitura da absorção de padrões de várias concentrações, cálculo feito no gráfico dos
valores obtidos.
 Curva de absorção x concentração:

Aplicações:
 Dosagem de proteínas (280 nm, 595 nm);
 Dosagem de ácidos nucléicos (260 nm);
 Cinética de reações químicas (oxi-redução, enzimática);
 Análise quanti e qualitativa de substâncias compostas;
 Monitoramento ambiental.

Bases da cromatografia

 Usadas para detecção ou determinação do analito;

Efeitos de matriz insignificantes
 Quantidade de analito subestimada/superestimada
Pré-tratamento: mudança de fase ou estabilização;
Técnicas de separação:
 Em grande escala (bulk separations):
Filtração;
Mecanismos Efeitos térmicos : destilação, evaporação e secagem;
Físicos Efeitos de solubilidade: extração com solvente, cristalização e precipitação;
Troca iônica, diálise e liofilização.
 Com instrumentos:
Cromatografia em fase gasosa (GC);
Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC);
Mecanismos
Químicos Cromatografia em camada delgada (TLC);
Cromatografia com fluído supercrítico (SFC);
Eletroforese (capilar - CE).
Objetivos da separação analítica:
 Eliminação ou redução de interferentes;
 Identificação dos constituintes:
Correlações adequadas;
Técnica de medida sensível à estrutura.
Troca iônica:
 Processo no qual íons “presos” em um sólido poroso e insolúvel são trocados por íons presentes em solução;
 Resinas trocadoras de íons;
 Aplicações dos métodos de TI:
Eliminar íons interferentes.
 Co-precipitação
Concentrar íons em soluções diluídas.
  Elementos traço: metais em águas naturais
Separações cromatográficas de espécies inorgânicas e orgânicas.
Cromatografia:
 Técnica na qual os componentes de uma mistura são separados com base nas diferenças de velocidade nas
quais são transportados através de uma fase fixa estacionária por uma fase móvel líquida ou gasosa;
 Grande poder de resolução;
 Permite a separação, identificação e determinação de componentes químicos em misturas complexas;
 Dividido em três unidades:
Fase estacionária (FE);
 Imobilizada em uma coluna ou sobre uma superfície plana.
Fase móvel (FM);
 Movimenta-se através da fase estacionária transportando a mistura de analitos;
Componentes da mistura:
 Transportados pelo fluxo fase móvel;
 Através da fase estacionária;
 Separações ocorrem com base nas diferenças de velocidade de migração entre os componentes
da fase móvel (polaridade).
 Tipos de cromatografia:
Cromatografia em coluna:
 FE em tubo estreito;
 FM forçada através do tubo;
 sob pressão ou por gravidade.
Cromatografia planar:
 FE suportada sobre uma placa plana ou nos poros de um papel
 Deslocamento da FM :
 Por ação da capilaridade ou sob influência da gravidade.
Classificação dos métodos cromatográficos em coluna:

Termos utilizados em cromatografia:

 Eluição:
Processo no qual os solutos são levados através da fase estacionária pelo movimento de uma fase
móvel.
 Eluente:
Solvente empregado para transportar os componentes de uma mistura através da fase estacionária.
 Eluato:
Fase móvel que deixa a coluna.
Eluição em cromatografia em coluna:

 Resultante: diferenças nas velocidades  formação de bandas ou zonas

ao longo do comprimento da coluna;
 Isolamento dos solutos separados é completado pela introdução de
quantidade suficiente de FM através da coluna até que sejam eluídas e
possam ser coletadas ou detectada;

Cromatogramas:

 Serve como detector;

 Registro em função do tempo ou do volume;
 Há a presença de picos;
 Análise qualitativa : posições dos picos = identificação;
 Análise quantitativa: áreas sob os picos = quantidade da espécie.

Melhoria do desempenho da coluna

 B mais retido (menos polar – atrasa em relação a A;

 Distância aumenta à medida que se movem;
 Ocorre alargamento das bandas (cai a eficiência);
 Condições podem ser modificadas para que isso ocorra mais lentamente  aumento no comprimento da
coluna;
 Variáveis físicas e químicas influenciam as velocidades de separação de bandas e o alargamento.

Super-crítica

Líquida de alta eficiência

Classificação pela natureza das fases envolvidas: