O

R
H

C Cα

Cα N

R H
O
H H
H
ESTRUTURA

 PRIMÁRIA
 SECUNDÁRIA
 TERCIÁRIA
 QUATERNÁRIA
O que é a estrutura 3D de uma proteína

 Como se dá o agrupamento completo dos AA em uma proteína completa

 É a estrutura Nativa = FUNCIONAL
O que é a estrutura 3D de uma proteína

 Relacionamento espacial entre todos os aminoácidos de um polipeptídio

 Depende do balanço geral das interações não-covalentes
 Estabilizada por interações diversas entre as cadeias laterais e pontes
dissufeto
 Ligações de H têm pequena contribuição devido à competição com a
água
 Especificam a estrutura secundária
O que é a estrutura 3D de uma proteína

 Relacionamento espacial entre todos os aminoácidos de um polipeptídio

 Depende do balanço geral das interações não-covalentes
 Estabilizada por interações diversas entre as cadeias laterais e pontes
dissufeto
 Ligações de H têm pequena contribuição devido à competição com a
água
 Especificam a estrutura secundária

https://youtu.be/meNEUTn9Atg
Um exemplo de Estrutura 3D

 MIOGLOBINA
 1ª proteína a ser vista com detalhe a nível atômico
 Carreador de O2 no musculo
 Cadeia polipeptídica com 153 AA
 70% enovelada em 8 α-Hélices

 30% voltas e alças

 Tem hemo = grupo PROSTÉTICO Como se deu o dobramento

 Não peptídico da cadeia?
 É uma porfirina + Fe
Onde estão os AA
apolares?

Onde estão os AA polares?

Um exemplo de Estrutura 3D

 MIOGLOBINA
 Resíduos AA hidrofóbicos

AA hidrofóbicos escondidos
no interior (AZUL),
protegidos do contato com
água.
2 AA polares (His) no
interior interagem com Fe.
Um exemplo de Estrutura 3D

 PORINA
 Proteína inserida na membrana de bactérias
 β-barril
 Exterior hidrofóbico

 Interior hidrofílico

AA hidrofóbicos
(amarelo)

AA hidrofílicos
(Azul/branco)
MOTIVOS Proteicos

 Combinações entre diferentes arranjos de estrutura

secundária
 Formam padrões comuns de enovelamento
 Gerando domínios característicos de famílias de proteínas
Domínios Proteicos

 É o enovelamento da cadeia polipeptídica em 2 ou + regiões

compactas unidas por segmento flexível da cadeia
 Formados pela combinação de motivos estruturais
 Possuem tamanho variável
 30-400 AA
Domínio
Piruvato regulador
Quinase

Domínio
Ligação ao
Substrato

Domínio
Ligação ao
Nucleotídeo
Domínios Proteicos

 Estruturas autônomas funcionalmente

 Proteínas pequenas tem 1 domínio
 própria proteína

 Proteínas com mais de 200 resíduos

 Multidomínios

 Conectados por loops, dobradiças, segmentos flexíveis ou por

interações fracas;
 Famílias Proteicas
 Conservação de domínios.

4 Domínios
Familia das Igs semelhantes
100 AA/domínio
Estrutura Quaternária

 Associação de 2 ou + cadeias polipeptídicas

 Interações entre grupos laterais das cadeias diferentes

 Formando estruturas com múltiplas subunidades

 Dímeros, Trímeros, Tetrâmeros

Proteína Cro Hemoglobina

Fago λ
Como se dá o Enovelamento

 Christian Anfisen
 O Plano:
 Destruir a estrutura da Ribonuclease A

 124 AA

 4 pontes Dissulfeto

 Determinar as condições para Renaturar

Como se dá o Enovelamento
Agentes
 Ribonuclease A
desnaturantes

 Temperatura
 pH

Desnaturação
Perda da
Atividade 0% Atividade
Como se dá o Enovelamento

 Ribonuclease A

 Renaturação
 É um evento Aleatório?
 Tentativa e erro?

 8 Cys
 4 pontes S-S
 105 possíveis arranjos!
Renaturação
 As interações fracas
favorecem o
posicionamento correto
das ligações S-S

Volta da Atividade
Como se dá o Enovelamento/Desenovelamento

 É um processo cooperativo

Mistura 50/50% de
enoveladas/desnaturada

Se parte da estrutura fica

instável, sua interação com
outras parte da molécula se
perdem!
TUDO SE DESMONTA!
Como se dá o Enovelamento/Desenovelamento

 E se fosse ao ACASO?
 Quanto tempo seria necessário para a proteína dobrar????

 PARADOXO DE LEVINTHAL

1 proteína de 100 resíduos

- Cada resíduo experimentando 3 posições = 3100
- Tempo de teste para cada posição 10-13 seg
Tempo total = 3100 x 10-13 seg = 5 X 1034seg = 1,6 X 1027 anos

INCOMPATIVEL COM
A VIDA
Como se dá o Enovelamento/Desenovelamento

 É um processo cooperativo
 O enovelamento ocorre de maneira hierárquica

 porções locais enovelam primeiro e sucessivamente

 Intermediários do enovelamento são observados

Proteínas se enovelam por uma série de ajustes conformacionais que

reduzem sua energia livre e entropia até atingir o estado nativo

A essência do enovelamento é a retenção de intermediários

parcialmente corretos
Como se dá o Enovelamento/Desenovelamento

 Processo Assistido
 CHAPERONAS

 Auxiliam o enovelamento

 Previnem a agregação de proteínas em condições de estresse

 Interagem com proteínas parcialmente dobrados ou dobradas de

forma errada.

 DnaK/DnaJ de E. coli
 Homólogas a Hsp70/Hasp40
eucariótica
 Evitam a formação de
agregados não dobrados em
regiões hidrofóbicas
Como se dá o Enovelamento/Desenovelamento

 Processo Assistido
 CHAPERONINAS

 Interagem com proteínas que não se dobram espontaneamente

Liberação da
proteína no
1) A proteína
estado
não dobrada se
completamente
liga a fenda da
ou parcialmente
GroEL
dobrado
2)ATP se liga às
7 subunidades A proteína se
da GroES dobra dentro da
fenda fechada
3)Hidrolise do
ATP, liberam-se
14 ADP de
GroES

ATP e GroES se
ligam a GroEL
Enovelamento Errado

 Gera-se uma fibra amiloide insolúvel

 Doenças AMILOIDOSES  mal de Parkinson e Alzheimer
 Fibras com alto conteúdo de folha β
 Folhas β com alto conteúdo AA aromáticos na região central
 O núcleo se dobra antes que o restante da proteína
 Os núcleos de 2 ou + proteinas se associam  fibrila amiloide
Enovelamento Errado

 Maioria das proteínas

dobram corretamente 
demora dos sintomas
 Mutação  AA aromático em
posição critica  formação
da fibrila  sintomas
precoce
Trabalhando com Proteínas – Fonte de Proteínas

 Tecidos
 Células
 Organelas
 Centrifugação diferencial

 Extrato Proteico – mistura de proteínas

 Frações
 Tamanho das moléculas

 Carga das moléculas

 Solubilidade

 É diminuída em altas concentrações de Sal (salting out)

 Precipitação das moléculas
 Sulfato de Amônio
 Proteínas precipitam e são separadas por centrifugação
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Diálise
 Separa as proteínas dos pequenos solutos

 Usam-se membranas contendo poros de tamanhos conhecidos

Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Cromatografia
 Tamanho

 Carga

 Afinidade de ligação

 Elementos Básicos:
 Coluna de vidro/plástico
 Matriz – material
sólido/poroso (fase
estacionária)
 Uma solução/fase móvel
 Eluente
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Cromatografia
 Tamanho

 Gel-Filtração
 Matriz – polímeros com
ligações cruzadas, formando
poros
 Proteínas grandes saem na
frente
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Cromatografia de troca iônica

 Carga

 Explora as diferenças e magnitude de carga liquida em um dado pH

 Matriz

 Contem grupos carregados

 Aniônicos – troca de
cátions
 Proteínas + migram
lentamente
 Catiônicos – troca de
aníons
 Resolução aumenta com o
aumento do comprimento da
coluna
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Cromatografia de Afinidade
 Explora afinidade de ligação

 Matriz

 Grânulos possuem grupos

covalentemente ligados
 Ligante
 Proteínas com afinidade ao
ligante ficam retidas
 Ex: enzima-substrato
 Ligação ao ATP
 Ligação ao Anti-corpo
 Eluição com alta concentração de
sal ou ligante
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 HPLC
 Utilizam bombas de alta pressão que aceleram o movimento das
moléculas de proteínas através da coluna
 Reduz o tempo de transito na coluna

 Limita o espalhamento/difusão das proteínas na coluna

 Aumenta resolução
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Eletroforese
 Proteínas movem-se em um campo elétrico

 Usa-se SDS (dodecil sulfato de sódio)

 Tem carga Negativa

 Liga-se a proteínas em quantidades proporcionais a MM

 As proteínas são desnaturadas

 Conformação aberta
Trabalhando com Proteínas – Métodos de Fracionamento

 Focalização Isoéletrica
 Separação de acordo com pI
 Gradiente de pH é estabelecido no Gel usando anfólitos
 Aplicação de um campo elétrico
Trabalhando com Proteínas – Sequenciamento

 Descobrindo a Estrutura Primária

 Método de Sanger

Sanger

FDNB (1-flúor-2,4-dinitrobenzeno)
Cloreto de dansila e cloreto
dabsila
Usado para marcar AA N-terminal
Hidrolise com HCl 6M
AA N-terminal identificado

Hidrolisa toda proteína

Mas identifica só AA N-terminal!
Trabalhando com Proteínas – Sequenciamento

 Descobrindo a Estrutura Primária

 Degradação de Edman
 Sequencia o peptídeo Inteiro

AA N-terminal reage com

fenilisotiocianato em condições
alcalinas

Forma PTC

Liberação do AA N-terminal com

TFA
Trabalhando com Proteínas – Espectrometria de Massas

 Analitos
 Soft Ionizations
 MALDI
 ESI