DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y PARÁMETROS DE LA

ECUACIÓN DE MICHAELIS - MENTEN (VMAX Y KM)

DETERMINATION OF PARAMETERS ENZYME ACTIVITY AND THE

MICHAELIS – MENTEN (VMAX Y KM)

Amilkar ALVAREZ A1, Gustavo CAMPO L1, Breyner MARTINEZ M1, Ronaldo
MUÑOZ A1.

RESUMEN

Para determinar las propiedades enzimáticas, en su uso a nivel industrial en el diseño de

birreactores es necesario discriminar modelos que nos permitan calcular la velocidad
intrínseca de reacción, uno de los modelos más usados son los de Michaelis- Menten y Briggs
y Haldane. El propósito de esta experiencia de laboratorio consistió en determinar la
actividad enzimática de una glucoamilasa fúngica (A. Níger) y los parámetros de Michaelis
– Menten (Vmax y Km) en diferentes concentraciones y temperatura fija. Inicialmente se
tomaron concentraciones de 0,5; 2; 5; y 12,5 en relaciones porcentuales de enzima y se llevó
a un birreactor a condiciones de pH 4,7 y temperatura de 60°C. luego se obtienen las
concentraciones de producto (glucosa) y se determinaron los parámetros modelo
experimental de Michaelis y Menten. Vmax = 0,00411862 y el Km = 0,02094934. Y se pudo
concluir que La velocidad de una reacción enzimática varía, directamente proporcional a
la concentración de la enzima, por lo tanto a mayor [E] se incremente la velocidad, esto es válido
en presencia de la cantidad de sustrato suministrada
Palabras clave: birreactor, enzima, velocidad, concentración, Km, Vmax.

ABSTRACT
To determine the enzymatic properties in use industrially in the design of bioreactors is
necessary to discriminate models which we can calculate intrinsic reaction rate , one of the
most used models are the Michaelis- Menten and Briggs and Haldane . The purpose of this
laboratory experiment was to determine the enzymatic activity of a fungal glucoamylase ( A.
Niger ) and parameters Michaelis - Menten ( Vmax and Km) at various concentrations and
fixed temperature. Initially concentrations of 0.5 is taken; 2; 5; and 12.5 in percentage ratios
of enzyme and took a bioreactor conditions of pH 4.7 and 60 ° C . then concentrations of
product (glucose ) and the parameters are obtained experimental model of Michaelis and
Menten were determined . Vmax and Km = 0.00411862 = 0.02094934 . And it was concluded
that the enzymatic reaction rate varies directly proportional to the enzyme concentration ,
therefore a larger [ E ] the speed increases, that is valid in the presence of the quantity of
substrate supplied.

Keywords: Bioreactor , enzyme , speed, concentration , Km , Vmax

1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia
 INTRODUCCION
Las enzimas son proteínas cuya acción
biológica consiste en la catálisis de las
reacciones del metabolismo, las cuales
transcurrirían muy lentamente sin su
intervención. El complejo de catálisis
implica la influencia del catalizador en la
reacción acelerándola, sin consumirse en
dicho proceso.
La reacción más sencilla catalizada
catalizada por una enzima es aquella en
que su único sustrato es transformado en
un solo producto. La secuencia de la
reacción es así:
E + S ↔ ES ↔ E + P
Cada una de las etapas de la reacción es
reversible y esta secuencia es lo más
sencilla posible, ya que en realidad en la
mayoría de las reacciones enzimáticas
pueden intervenir dos o mas
intermediarios.
Factores que influyen en la actividad
enzimática.
Cada enzima es específica, en el sentido de
que puede actuar solamente sobre cierto
sustrato o grupo de sustratos. Esto no
quiere decir que no haya una enzima para
cada sustrato, sino que cada enzima actúa
sobre sustancias que tienen en común una
cierta identidad molecular. La
especificidad enzimática se demuestra por
el hecho de que a partir del mismo sustrato,
se forman diferentes productos finales
cuando actúan diferentes enzimas.1
1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia
Ecuación de Michaelis y Menten
En 1913, Michaelis y Menten propusieron
un mecanismo para explicar el
comportamiento cinético de las reacciones
enzimáticas. Si bien, hoy en día , se sabe
que este mecanismo no es del todo
riguroso, pero se continua usando como
una herramienta de discusión básica ya
que conceptualmente es el punto de partida
para construir otros mecanismos más
complejos. Se supone que la enzima E y el
sustrato S se combina para formar un
complejo intermedio ES que
posteriormente se disocia en el producto
final y liberando de nuevo la enzima. La
existencia propuesta del complejo enzima-
sustrato se propuso mucho antes que la
presencia de dichos complejos pudiera
determinarse por técnicas
espectrofotométricas. 3
En esta ecuación, los valores de Km y
Vmax son característicos para una
reacción enzimática dada, en determinadas
condiciones. Si se conocen estos valores,
será posible calcular la velocidad de la
reacción en todo el intervalo en que se
aplica la ecuación de Michaelis y Menten.
2
Por otra parte tenemos la gráfica de
Lineweaver-Burke, también llamada doble
reciproca el cual se utiliza para calcular la
Km y la Vmax asi como para determinar el
mecanismo de acción de los diversos tipos
de inhibidores:
 Por último se medió la absorbancia a cada
muestra utilizando un espectrofotómetro
(modelo Spectroquant – Pharo).
Donde la representación de 1/v frente a 1/s
ha de ser una línea recta, y un ajuste de dicha
recta a los datos por regresión lineal nos
permitirá estimar la Vmax a partir de la
ordenada en el origen y el Km a partir de la
pendiente.

METODOLOGÍA

Esta práctica de laboratorio se llevó acabo

en las instalaciones de la planta piloto de
la Universidad de Sucre, sede Granja los
Pericos. Los materiales y reactivos
utilizados fueron suministrados por la
Universidad de Sucre. Inicialmente se
preparó una solución de maltosa con una
concentración del 6% en un biorreactor
marca Julabo TW12, posteriormente se
estabilizo el pH a 4,61 utilizando una
solución tampón de 20ml de HCl al 0,4
normal (peachimetro marca lab Metrohm),
a una T= 60°C (termómetro marca Brixco-
Thermometer), donde de igual forma se
estabilizo la velocidad de agitación a 400
rpm, se realizaron diluciones en agua
destilada (1:150) de la enzima
glucoamilasa fúngica a utilizar, se tomó 1
mm de la solución del biorreactor y se le
adicionaban 0,5 mm de la dilución más 0,5
mm de DNS a cada tubo cada 30 min,
partiendo del tiempo (0-30-60-90-120-
150-180-200)min, posteriormente se
procedió a inactivar la enzima en agua
hirviendo (97°C en plancha de
calentamiento modelo MSH - 420) durante
5 minutos, luego un choque térmico en
baño de hielo a (4°C) durante 5 minutos.

1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia
 RESULTADOS

[glucosa] vs t
Curva patrón
250

200
Grafica patron

[glucosa] (gr/lt)
150
1.2 y = 1.6962x - 0.0564
100
1 R² = 0.9877
0.8 50
absorbancia

0.6 0
0.4 0 50 100 150 200 250
0.2 tiempo

0
12,50% 5%
-0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8
[] de glucosa

Grafica 2: Hidrolisis enzimática a temperatura

Series1 Linear (Series1)
de 60 °C y concentración 12,5 % y 5 %.

Grafica 1: concentración de glucosa vs

absorbancia

[glucosa] vs t
0.2
t 12,50% 5% 2% 0,50%
[glucosa] (gr/lt)

0.15
0 138,1548 37,924925 0,003263 0,00081575
0.1
40 155,4965 46,681625 0,132038 0,030735
0.05
80 189,6648 86,73065 0,150925 0,025584
0
120 226,95804 65,5257 0,042754 0,032452 0 50 100 150 200 250
Ttiempo (min)
160 187,87912 62,00585 0,085679 0,032452

200 200,4819 52,4765 0,085679 0,032452 2% 0,50%

Tabla 1. Concentraciones de glucosa vs el

Grafica 3: Hidrolisis enzimática a temperatura
tiempo
de 60 °C y concentración 2 % y 0,50 %.

1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia
 CALCULO DE LAS VELOCIDADES.
V vs [glucosa]
160
[𝒈𝒍𝒖𝒄𝒐𝒔𝒂]𝒇𝒊𝒏 − [𝒈𝒍𝒖𝒔𝒐𝒔𝒂]𝒊𝒏
140 y = 441.65x + 1.5162
𝒕𝒊𝒆𝒎𝒑𝒐 𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍 120 R² = 0.9981
100
[enzima] velocidades

vel
80
60
40
20
12,50% 0,3116355
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4
6% 0,07275788
[glucosa]
2% 0,00041208
Series1 Linear (Series1)
0,50% 0,00015818
Grafica 4: modelo de Michaelis-Menten
Tabla 2: de las velocidades
Determinación del Km y Vmax.

Vmax = 1/1,5162
[glucosa] 1/v 1/[glucosa]
Vmax = 0,65

Km = 441,65(0,65)
138,1548 3,20887704 0,00723826 Km= 291,28

37,924925 13,7442167 0,02636788

1/v vs 1/[glucosa]
0,003263 2426,71326 306,466442
7000
y = 5.0865x + 242.8
0,00081575 6321,86179 1225,86577 6000 R² = 0.9803
5000
Tabla 3: inverso de las velocidades y 4000
concentración de glucosa.
1/v

3000
2000
1000
0
-500 -1000 0 500 1000 1500
1/[glucosa]

1/v 1/[glucosa] Linear (1/v 1/[glucosa])

Grafica 4: modelo de Lineweaver-Burk

De la misma forma se procedió a calcular los

parámetros

Vmax = 1/242,8

1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia
Vmax = 0,00411862
Km = 5,0865*(0,00411862)
Km =0,02094934
ANÁLISIS DE RESULTADOS.
La práctica tiene como finalidad realizar
estudios del comportamiento enzimático,
considerando una serie de factores típicos
que condicionan claramente la actividad
de los enzimas, como lo es la temperatura
y el p y la concentración de enzimas.
Teniendo en cuenta las gráficas que
representa las concentraciones de glucosa
obtenida podemos dar cuenta que a medida
que aumenta la concentración de enzima
utilizada la velocidad de reacción es
mayor y la cantidad de sustrato disminuye
proporcionalmente, es necesario aclarar
que para la obtención de estos resultados
se necesitó de una curva patrón, que
representaba la absorbancia con una
concentración de glucosa estimada, luego
a partir de esta ecuación y con la
absorbancia mostrada por el
espectrofotómetro se ingresó en dicha
gráfica y se multiplico por el factor de
dilución.
Podemos dar cuenta que se cumplió con el
objetivo de determinar los parámetros de
la ecuación de Michaelis-Menten.
DISCUSION
Teniendo en cuenta los resultados
obtenidos en el artículo HIDROLISIS
ENZIMATICA DE MELASAS, y
observando su conclusión podemos decir
1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia
que este articulo coincide con lo que ellos
concluye al afirmar que a medida que
aumenta la concentración de enzima
utilizada la velocidad de reacción es
mayor y la cantidad de sustrato disminuye
proporcionalmente. Esto haciendo
referencia de los valores obtenidos de
Vmax y Km
CONCLUSIÓN
Una vez realizada esta práctica de
laboratorio y analizando los resultados
obtenidos, se llega a la conclusión de que
es muy incidente la concentración de
enzima en la velocidad de reacción, en la
medida que si se aumenta la cantidad de
enzima y manteniendo constante la
concentración de sustrato se evidencia un
aumento en la velocidad de reacción.
BIBLIOGRAFIA
1. Principios y aplicaciones de la fisiología
vegetal, Eric Guevara B - Víctor Giménez G,
Edit. Universidad de costa rica, pág. 111.
2. cinética enzimática, Halvor N Christensen –
Graham A. Palmer, edit. Reverte s. a, pág. 34.
3. cinética de reacciones químicas, José Felipe
Izquierdo – Fidel cunill, Edit. Universidad de
Barcelona. Pág. 271.
1
Ingenieros agroindustriales en formación, UNIVERSIDAD DE SUCRE, Sucre - Colombia