Medicinal

 chemistry  insight:  op4ons  for  free  computa4onal  tools  

PROTEIN  VISUALIZATION  WITH  YASARA  

Caroline  Low  

Protein  structures  are  one  of  the  most  useful  resources  available  to  drug  designers  and  
medicinal  chemists.    Interroga4ng  these  structures  can  demonstrate  the  types  of  interac4on  
that  a  ligand  makes  with  the  protein  and  indicate  ways  in  which  the  structure  can  be  op4mised  
to  improve  its  drug-­‐like  proper4es.    There  are  many  tools  available  for  viewing  these  structures  
however  most  are  not  free  for  all  users.    One  excep4on  is  Yasara  View,  the  front  end  to  a  
soPware  package  developed  as  part  of  the  NewProt  project  (www.newprot.eu)  funded  by  the  
European  Commission  within  its  FP7  Programme.  Further  modules  allow  users  to  run  docking  
experiments  or  carry  out  molecular  dynamics  simula4ons,  but  these  require  a  license  fee,  
although  this  can  be  deferred  if  you  share  your  developments  with  the  community  (macros,  
movies,  Python  plugins  or  just  feedback).    
 
YASARA  stands  for  Yet  Another  Scien4fic  Ar4ficial  Reality  Applica4on  and  YASARA  View  can  be  
downloaded  from  www.yasara.org.    Versions  are  available  for  Windows,  Linux,  Mac  OS  X  and  
Android.  
 
YASARA  View  provides  high  quality  fast  graphics  and  can  generate  publica4on  quality  pictures  
with  the  help  of  addi4onal  soPware  such  as  PovRay.    Detailed  tutorials  are  provided  as  movies  
that  you  can  load  directly  from  the  Help  menu:  Help  >  Play  Help  movie.  We  recommend  that  
you  take  a  look  at  some  of  these,  both  to  learn  how  to  use  basic  features  and  to  give  you  an  idea  
of  some  of  the  other  features  which  lie  outside  the  scope  of  this  tutorial.  

Addi4onal  instruc4ons  for  exploring  protein  

structures  are  also  available  here  
hdp://wiki.bits.vib.be/index.php/
Protein_Structure_Analysis_training    
 
The  aim  of  this  tutorial  is  to  use  YASARA  to  illustrate  how  informa4on  about  the  way  a  
compound  binds  to  a  protein  is  used  by  medicinal  chemists  to  op4mise  ac4vity  of  a  lead  series.      
 
Note:  There  are  a  number  of  factors  that  need  to  be  considered  when  using  any  protein  
structure  that  are  not  discussed  here.    Interested  readers  should  take  a  look  at  this  review:  
Applica4on  and  Limita4ons  of  X-­‐ray  Crystallographic  Data  in  Structure-­‐Based  Ligand  and  Drug  Design,  A.  Davis  et  al.,  
Angewandte  Chemie  Interna4onal  Edi4on  
Volume  42,  Issue  24,  pages  2718–2736,  June  23,  2003  
   
 Lead  Op4misa4on  of  T.  brucei  N-­‐myristoyltransferase  inhibitors  

•  The  Drug  Discovery  Unit  at  Dundee  have  been  working  on  a  group  of  pyrazole  
sulfonamides  as  a  poten4al  treatment  for  Stage  2  human  African  Trypanosomiasis(HAT)  
when  the  parasites  enter  the  CNS.  
•  The  disease  is  transmided  by  the  tsetse  fly  and  is  fatal  if  leP  untreated.  Current  treatments  
are  unsa4sfactory  due  to  toxicity,  treatment  failures  and  require  parenteral  administra4on  
that  is  inappropriate  in  a  rural  African  seing.    
•  The  star4ng  point  for  this  lead  op4misa4on  campaign  was  a  pyrazole  sulfonamide,  
DDD85646  with  good  in  vitro  ac4vity  that  cured  Stage  1  of  the  disease  in  the  periphery,  but  
which  failed  to  cross  the  blood  brain  barrier  (Brain  :  blood  <0.05)  to  the  site  of  ac4on  
required  to  treat  stage  2.    Moreover,  it  was  poorly  selec4ve  between  human  and  TB  
isoforms  of  NMT.    Full  details  of  this  study  are  available  in  this  open  access  ar4cle  (Brand  et  
al,  2014,  J.  Med.  Chem.,  57,  9855-­‐9869)  
•  A  crystal  structure  of  DDD85646  bound  to  Leishmania  NMT  is  available  from  the  Protein  
Data  Bank  (2WSA.pdb)  and  the  sequence  of  this  protein  is  very  similar  to  the  TB  isoform.  

1.  Launch  Yasara  and  download  this  structure  by  selec4ng  File  >  Load  >  PDB  file  from  Internet  
2.  Enter  2wsa  as  the  PDB  ID  and  select  from  both,  take  the  beAer  structure.  Click  OK.    NB  
PDB_REDO  is  a  databank  of  updated  and  op4mised  X-­‐ray  structures  held  here  hdp://
www.cmbi.ru.nl/pdb_redo    
3.  The  molecule  loads  as  a  space  filling  model  
  2
N
N

HN
O S O
Cl Cl

N N
NH

DDD85646  
TbNMT  IC50  2nM  
HsNMT  IC50  3nM  
T.  Brucei  EC50  2nM    
Brain:blood  <  0.05  (mouse)  
   
   
 Changing  the  appearance  of  the  structure  

The  easiest  way  to  change  the  way  the  protein  and  ligand  are  represented  is  to  use  the  
func4on  keys:  
Changing  the  scene  style  
F1    Set  scene  style  to  balls  
F2    Set  scene  style  to  balls&s4cks  
F3    Set  scene  style  to  s4cks  
F4    Set  scene  style  to  Calpha  trace  
F5    Set  scene  style  to  tube  
F6    Set  scene  style  to  ribbon  
F7    Set  scene  style  to  cartoon  
F8    Change  side-­‐chain  style  
 
Selec4ng  F3  followed  by  F6    gives  the  protein  as  a  ribbon  and  the  ligand(s)  as  s4ck  
structures.      
 
The  two  bound  molecules  are  DDD85646,  called  646  in  the  pdb  file,  bound  in  the  
pep4de  substrate  pocket  and  tetradecanoyl-­‐CoA,  MYA.  NMT  catalyses  transfer  of  
myristate  from  MYA  to  the  N-­‐terminal  glycine  of  a  large  number  of  proteins.  
Interes4ngly,    the  binding  site  that  646  occupies  only  appears  as  the  result  of  a  
conforma4on  change  that  occurs  as  MYA  binds  (Rudnick  et  al  1991,  J.  Biol.  Chem.,  266,  
9732-­‐9739)  
1.  Moving  the  mouse  to  the  bodom  of  the  screen  brings  up  the  sequence  lis4ng.    To  
zoom  in  on  646  scroll  along  the  menu  to  the  end  of  the  protein  sequence  and  you  will  
find  the  entries  for  646  and  MYA.  
•  NB  If  you  can’t  find  it  then  type  VML  the  1-­‐leder  codes  for  residues  419-­‐421  
and  it  will  directly  to  the  right.    This  also  works  if  you  simply  want  to  locate  a  
specific  sequence  
•  Alterna4vely,  move  the  slider  bar  to  move  along  the  sequence  un4l  you  get  
to  residue  421.  
2.  Right  click  on  646  to  bring  up  a  menu.    If  you  select  Zoom  in  on  >  Residue  then  646  
will  appear  in  the  centre  of  the  screen  so  you  can  tell  the  two  ligands  apart.      

Use  the  leP  mouse  to  rotate  the  

structure  and  the  right  mouse  to  
zoom  in  and  out.  
 

1
2
 Labelling  items  

You  can  add  a  label  to  646  by  right  clicking  on  any  of  its  atoms  to  bring  up  a  menu  
1.  Select  Label  >  Residue  
2.  Select  NAME  >  OK  and  the  label  646  will  appear.  
3.  You  can  click  on  the  label  and  move  it  around  the  screen  if  it  is  not  in  a  good  posi4on  
4.  If  you  want  to  change  the  appearance  of  the  label  e.g.  font,  size,  color  select  Effects  >  Label  >  
Parameters  and  change  items  in  the  dialog  box  to  suit  you  
5.  Use  Effects  >  Unlabel  >  All    to  turn  them  off  
 
  2

Set  to  yellow  

 Are  there  any  hydrogen  bonds  between  the  ligand  and  the  protein?  

PDB  files  don’t  include  the  hydrogens  adached  to  either  the  ligand  or  protein  so  these  need  to  
be  added  manually.  
1.  From  the  main  menu  select  Edit  >  Add  >  hydrogens  to:  All  
2.  Select  View  >  Show  atoms  >  Residue    
3.  Select  Protein  on  the  rightmost  panel  and  enter  with  distance<5  from  Res  ‘646’  as  shown  to  
show  the  residue  sidechains  within  5Å  of  646  
4.  select  View>  Show  interac_ons  >  Hydrogen  bonds  of  >  Residue  to  iden4fy  any  hydrogen  
bonds  in  the  region  around  the  ligand  646.  
5.  Select  the  lower  op4on  to  extend  the  selec4on  to  include  hydrogen  bonding  partners  on  the  
protein  
1 3 5

Yasara  shows  hydrogen  bonds  as  doded  yellow  lines  in  the  protein  and  there  is  a  key  hydrogen  
bond  between  the  ligand  646    and  Ser  330  in  this  case.    

Ser330  

646  

This  picture  is  a  lidle  confusing.    If  you  only  want  to  show  this  hydrogen  bond  …..  
 
 Making  the  picture  clearer  

To  focus  on  the  H-­‐bond  between  Ser330  and  the  pyrazole  nitrogen  of  646:  
1.  Clear  the  screen  so  you  can  only  see  the  ribbons  of  the  protein  structure:  View  >  Hide  atoms  
>  All  
2.  Just  display  646  and  Ser330:  View  >  Show  atoms  >  Residue  to  bring  up  the  Select  residue  
panel  and  select  646  followed  by  ctrl-­‐click  on  Ser330  
3.  Right  click  on  any  atom  of  646  and  select  Show  hydrogen  bonds  >  Residue  as  before  
4.  This  gives  a  much  clearer  picture  of  the  important  hydrogen  bond  

4
 What  shape  is  the  binding  site?  

Lets  put  a  surface  on  the  protein  so  we  can  see  what  the  binding  site  looks  like  
1.  Select  View  >  Show  surface  >  Residue  and  pick  Protein    from  the  right  hand  of  the  Select  
residue  panel  
2.  Select  Solvent  accessible  surface  and  leave  Specular  highlights  _cked  
3.  Click  on  Set  surface  color  for  en_re  surface  budon  
4.  Choose  white  and  enter  75  in  the  alpha  box  so  that  the  surface  is  par4ally  transparent  and  
you  can  see  through  the  protein  to  visualise  the  ligand  binding  site  
5.  Zoom  in  with  the  right  mouse  and  you  can  see  the  shape  of  the  ligand  binding  site.  Note  how  
4ghtly  the  N-­‐methyl  group  on  the  pyrazole  packs  into  this  pocket  and  the  authors  found  it  
difficult  to  replace  this  group  with  any  other.    However,  they  no4ced  that  there  was  scope  to  
add  subs4tuents  at  either  the  3-­‐  or  5-­‐posi4ons  and  the  solvent  exposed  sulfonamide  
nitrogen.  

2 4

Space  to  grow  into?  

 Does  this  structure  explain  other  elements  of  the  SAR?  

The  authors  systema4cally  op4mised  the  blood-­‐brain  barrier  penetra4on  and  selec4vity  of  646  
and  summarised  this  SAR  schema4cally  as  follows:  

Looking  at  the  environment  around  the  piperidine,  at  the  other  end  of  646,  there  is  a  vacant  
binding  cleP  that  could  accommodate  an  addi4onal  subs4tuent.    The  best  way  to  see  this  is  to  
turn  off  the  ribbons  of  the  secondary  structure:  View  >  Hide  secondary  structure  of  >  residue  
and  select  Protein  >  OK  from  the  selec4on  panel.    Zooming  in  (right  mouse)  cuts  through  the  
surface  and  shows  this  new  extra  binding  pocket.  

Extra  
binding  
pocket    

Piperidine  ring  

This  inves4ga4on  showed  that  small  subs4tuents  did  not  affect  the  in  vitro  ac4vity  (IC50/EC50)of  
the  compounds,  but  did  not  increase  selec4vity  in  favour  of  the  TB  isoform  and  so  this  aspect  
was  not  pursued  further.  
 Aligning  structures  

X-­‐ray  structures  of  two  key  compounds  complexed  to  Aspergillus  fumigatus  NMT  (AfNMT)  were  
obtained  during  the  course  of  this  inves4ga4on  (4uwi  and  4uwj.pdb).    These  demonstrate  
evolu4on  of  the  ligand  to  incorporate  both  a  flexible  linker  followed  by  a  capped  sulfonamide.    
We  can  overlay  these  structures  with  2wsa  to  show  that  the  new  compounds  bind  to  the  same  
protein  site.  
1.  Load  the  2  new  structures  from  the  Protein  Data  Bank  in  the  same  way  that  you  did  for  2wsa  
2.  Align  the  structures  by  selec4ng  Analyze  >  Align  >  mul_ple,  based  on  structure:  Objects  
with  MUSTANG  
3.  Select  2wsa  from  the  Sequence  box  and  4uwi  &  4uwj  (ctrl-­‐click)  from  the  Name  Box  and  
Protein  from  Belongs  to  or  has.  
4.  This  calcula4on  overlays  the  protein  backbones  of  all  three  structures  and  allows  you  to  see  
that  the  three  ligands  bind  in  the  same  site.    Try  adding  different  colours  to  each  structure  so  
that  you  can  see  this  more  clearly.  
5.  NB  the  structure  of  646  in  Asp  fumigatus  was  obtained  at  a  later  date  and  can  also  be  
downloaded  from  the  pdb  for  direct  comparison  (4cax.pdb)  

2 3

Ligand  binding  site  

 Comparing  the  ligands  

Take  a  closer  look  at  the  ligands.  

1.  Turn  off  the  protein  backbone  View  >  Hide  secondary  structure  of  >  All  
2.  Effects  >  Zoom  in  on  >  Residue  Pick  646  >  OK  and  you  can  focus  on  the  three  ligands.    These  
clearly  adopt  similar  binding  modes  and  although  the  proteins  are  different  the  sites  are  
sufficiently  similar  to  confirm  that  subs4tu4ng  the  rigid  biaryl  system  of  646  for  a  flexible  
linker  does  not  alter  the  binding  mode.  
3.  Here  the  three  ligands  have  been  coloured  separately.  To  do  this  View  >  color  >  residue  and  
pick  646,  7I5  or  Xmq  in  turn.  Click  OK  
4.  Pick  a  color  and  click  on  Apply  unique  color  

646  (DDD85646;  compound  1)  

bound  to  LmNMT  (PDB  2wsa)  
Xmq  (compound  14)  bound  to  
AfNMT  (PDB  4uwi)  
7i5  (compound  43)  bound  to  
AfNMT  (PDB  4wj)  

4
 Summary  

Full  details  of  the  process  involved  in  discovery  of  the  op4mal  compound  40  are  given  in  the  
ar4cle  and  you  can  use  this  to  pick  out  addi4onal  features  of  these  molecules  that  were  
important  in  their  development.    The  final  outcome  was  a  compound  with  increased  blood:brain  
barrier  penetra4on  and  improved  selec4vity,  although  the  reasons  for  this  lader  effect  are  not  
fully  understood.      
Introduce flexible linker Cl O H
Cl O H
S
N Key  tool  
N
HN
S
N
N
O
N
compounds  
N
N
O
N
N
Cl were  evaluated  
Cl
in  a  CNS  model  
N
DDD85646 Compound 14 of  HAT  where  
Compound 1 Ligand ID Xmq
they  showed  
Ligand ID 646
N N
par4al,  but  not  
full  efficacy.    
Cl O Lack  of  full  cure  
N F
X
N
S was  adributed  
O F to  a  combina4on  
Cl
of  insufficient  
X = H; Compound 43, Ligand ID 7i5
X = Me; Compound 40
Cap sulfonamide nitrogen to
reduce overall polarity and
therapeu4c  
preclude deprotonation of window,  so  the  
SO2NH

concentra4on  of  drug  delivered  to  the  brain  was  not  high  enough,  and  lower  efficacy  against  T.  
b.  brucei  GVR35  strain  compared  with  the  S427  strain.    Nevertheless,  the  results  do  provide  
valida4on  of  TbNMT  as  a  target  for  new  therapeu4cs  for  Stage  2  HAT.  

Kaplan-­‐Meier  survival  graph  for  pulsed  dosing  

of  Compound  40  in  T.  b.  brucei  GVR35  stage  2  
HAT  efficacy  model  (see  ar4cle  for  full  details  
of  the  experimental  protocol  used)    

Yasara  provides  a  mechanism  for  interroga4ng  protein-­‐ligand  informa4on  and  once  you  have  
worked  out  how  to  perform  these  simple  manipula4ons  you  can  explore  some  of  the  other  
features  of  Yasara  View.    The  same  front  end  is  used  by  a  comprehensive  modelling  package  and  
documenta4on  is  provided  for  each  element,  along  with  video  tutorials  of  a  number  of  other  
rou4ne  tasks  that  you  may  be  interested  in.    Other  notable  features  are  that  all  the  
underpinning  science  is  published  in  peer-­‐reviewed  journals  and  support  for  3D  viewing  is  
inbuilt.