Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
BIOQ221
Guía 1
2018
1
ANEXO MICROPIPETAS
FIGURA 1:
Para pipetear un volumen dado, se debe usar la pipeta más cercana al volumen deseado. Ej: Para
medir 10 microlitros (l), se debe seleccionar la pipeta P-20 y a continuación girar la perilla de ajuste
(b) hasta que aparezcan los números:
Este valor representa 10,00 l, 1
los números subrayados 0 P20
representan los decimales 0
0
Para medir 100 l, usar P-200 y
girar la perilla hasta:
(
e1
n0 P200
En la P-200 figura solo un
decimal, es este caso el valor r0
representa 100,0 µl o0
j
o
Para el caso de la P-1000 sólo figuran las tres primeras cifras. Ej: 1000 l ó 1ml figuran como 100 y la
última cifra se estima en la escala graduada.
)
* ¡¡¡¡ La perilla de ajuste de volumen (b) no debe girarse más allá de los valores máximos
indicados para la pipeta!!!!
Para lectura de pocas muestras en el rango visible se puede utilizar cualquiera de los equipos
disponibles.
Observación:
Durante este trabajo práctico se le instruirá a utilizar correctamente cada uno de estos equipos. Tome
nota en sus apuntes para que pueda independizarse en el uso de los equipos en los prácticos venideros.
PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS
a) OBJETIVO
b) INTRODUCCION
En las cadenas polipeptídicas de las proteínas los grupos α-amino y carboxilo del carbono 1 de los
aminoácidos, salvo los terminales, se encuentran constituyendo los enlaces peptídicos. Por consiguiente,
los grupos que pueden ceder o aceptar protones están mayoritariamente en las cadenas laterales. Estos
grupos son: carboxilos libres de los aminoácidos dicarboxílicos, imidazol de histidina, grupo ε-amino de
lisina, guanidino de arginina, fenol de tirosina y sulfhidrilo de cisteína. Por tener las características de
ácido débil o de base débil, estos grupos confieren a las proteínas la capacidad de actuar como
amortiguadores del pH.
c) MÉTODO
Titulación con ácido en presencia de un indicador que vira entre los límites donde se sospecha que existe
propiedad amortiguadora. Se usará plasma o suero sanguíneo de bovino como muestra.
d) REACTIVOS
e) PROCEDIMIENTO
Preparación de suero desproteinizado: coloque 1 ml de suero sanguíneo en un tubo Falcon (deje la tapa
suelta) y caliente la solución en un baño a ebullición durante 1 a 2 minutos. La muestra debe adquirir el
aspecto de un sólido. Diluya con NaCl 0,15 M 4 veces (en el cálculo del volumen del diluyente
necesario para obtener el factor de dilución 4 se desprecia la evaporación producida durante el
calentamiento). Disgregue el coágulo con una bagueta. Centrifugue a 4.000 rpm durante 5 min y separe
el sobrenadante.
Titulaciones: Coloque 0,5 ml de suero sanguíneo en una cápsula de porcelana o en un vaso pequeño,
diluya 4 veces con NaCl 0,15 M, agregue 3 a 4 gotas de rojo de metilo y titule con HCl 0,01 N. Use una
pipeta de 5 ml en vez de una bureta. Titule de la misma forma 2 ml del suero desproteinizado y después
2 ml de agua. Calcule cuantos miliequivalentes (meq) de ácido gastó en cada titulación.
II. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEINA
a) OBJETIVO
b) INTRODUCCION
Los grupos ácidos y básicos de las cadenas polipeptídicas se ionizan en función del pH del medio. Del
número de estos grupos y de su grado de ionización depende la carga neta de la proteína. El punto
isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al cual la carga neta de la proteína es igual a cero. Al pH
correspondiente a su pI una proteína presenta un mínimo de solubilidad. La caseína de la leche no es una
proteína homogénea, ya que existen diferentes formas de caseína. Por lo tanto, el pI que se determinará
será un pI promedio. El pI promedio de las caseínas de la leche de bovino se encuentra entre 3,5 y 6,2.
c) MÉTODO
Estudio de la solubilidad de la caseína a diferentes pHs, los cuales se fijan usando el sistema tamponante
acido acético/acetato.
d) REACTIVOS
e) PROCEDIMIENTO
Mezcle en tubos de ensayos los volúmenes (en ml) de los reactivos que indica la tabla.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caseína en NaOAc 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agua destilada 4,2 3,9 4,4 4,3 4,0 3,5 2,5 0,5 3,7
Ac. acético 0,01 M 0,3 0,6
Ac. acético 0,10 M 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0
Ac. acético 1,00 M 0,8
Calcule el pH de cada solución usando la ecuación de Henderson-Hasselbalch. Dato: el pKa del ácido
acético es igual a 4,76. Complete la siguiente tabla con sus resultados:
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH
10 minutos
20 minutos
a) OBJETIVO
b) INTRODUCCION
Las sales en alta concentración disminuyen la solubilidad de las proteínas. La precipitación de proteínas
por sales en alta concentración se denomina salazón. Un mecanismo que permite explicar el fenómeno
es que las moléculas de agua tienden a rodear los iones de sales y por esto disminuye el agua disponible
para rodear las moléculas de proteína y cumplir su rol de solvente. Se produce una deshidratación de las
proteínas, las moléculas se asocian en una fase sólida. La concentración de cierta sal a la cual precipita
determinada proteína es característica de la proteína, en ciertas condiciones de temperatura y pH. Esta
propiedad permite separar mezclas de proteínas. Cabe destacar que la salazón es una etapa típica en los
protocolos de purificación de proteínas.
Se ha estudiado el efecto de sales sobre la solubilidad de las proteínas plasmáticas. La concentración de
proteínas totales del plasma humano fluctúa normalmente entre 6,1 y 9,6 g por 100 ml, de los cuales 4,6
a 6,7 g corresponden a la seroalbúmina, 1,2 a 2,3 g a las seroglobulinas y 0,3 a 0,6 g al fibrinógeno. Si al
suero se le agrega sulfato de sodio hasta obtener una solución saturada, precipitan las seroglobulinas
pero no la seroalbúmina. El sulfato de amonio en cambio, a media saturación precipita a las
seroglobulinas y a saturación a la seroalbúmina.
c) METODO
Precipitación de las seroglobulinas del suero o plasma sanguíneo de bovino con sulfato de amonio.
d) REACTIVOS
Solución saturada de sulfato de amonio, suero o plasma sanguíneo de bovino, solución de ácido
tricloroacético (TCA) al 10%.
e) PROCEDIMIENTO
En un tubo Falcon coloque 1 ml de suero. Agregue, lentamente, agitando y observando los cambios, 1
ml de solución de sulfato de amonio. La mezcla estará a media saturación. Centrifugue 10 min a 4.000
rpm. Deje escurrir el sobrenadante a otro tubo. Estudie la reversibilidad de la precipitación agregando al
precipitado agua por gotas, agite para disolver el precipitado (puede usar una espátula). Estudie la
presencia de proteínas, tanto en el sobrenadante como en el precipitado disuelto, agregando TCA al 10%
por gotas, o calentando en un baño de agua a ebullición.
IV. ACCION DEL ALCOHOL A DIFERENTES TEMPERATURAS SOBRE LAS PROTEINAS
DEL SUERO SANGUINEO
a) OBJETIVOS
b) INTRODUCCION
El agua tiene una constante dieléctrica relativamente alta (80 a 20 oC), lo cual disminuye la fuerza de
interacciones electrostáticas entre los grupos cargados de las moléculas proteicas disueltas en agua,
favoreciendo la solubilidad de las proteínas. Los solventes orgánicos tales como el etanol, el metanol y
la acetona tienen constantes dieléctricas bajas (25, 32 y 20 respectivamente a 20 oC), de modo que al
agregarlos a una solución acuosa de proteínas baja la constante dieléctrica del medio y además
disminuye la concentración efectiva (actividad) del agua. Esto genera una mayor interacción entre los
grupos cargados de los iones proteicos y causa la precipitación. Un segundo aspecto que permite
explicar la precipitación de proteínas por solventes es que los solventes orgánicos usados, miscibles con
el agua, compiten por las moléculas de agua y por lo tanto pueden deshidratar a las proteínas.
Por otra parte, los solventes orgánicos interfieren con las interacciones hidrofóbicas en el interior de las
moléculas proteicas, favoreciendo su desnaturación. Este fenómeno disminuye a baja temperatura, ya
que de por si la temperatura alta es un agente desnaturante. La desnaturación puede conducir a la
coagulación de la proteína, es decir, a su agregación y precipitación irreversible. La coagulación es un
criterio para reconocer la desnaturación de las proteínas.
c) METODO
d) REACTIVOS
Etanol de 95o, solución de cloruro de sodio 0,15 M, suero o plasma sanguíneo de bovino.
Mezcla frigorífica (se entrega preparada): Por cada 10 partes de hielo agregue 3 partes de sal de cocina
(cloruro de sodio). Esta mezcla puede alcanzar temperaturas de hasta -15 oC.
e) PROCEDIMIENTO
Enfríe etanol en la mezcla frigorífica. Coloque suero en dos tubos de ensayos, 0,5 ml por tubo. Agregue
a uno de los tubos 1,5 ml de etanol que está a temperatura ambiente, agite suavemente para obtener una
mezcla homogénea y deje a temperatura ambiente. Agregue 1,5 ml de etanol frío al segundo tubo,
mezcle y deje el tubo en la mezcla refrigerante. Deje actuar al etanol durante 30 min.
Diluya cada solución 4 veces con NaCl 0,15 M y deje los tubos a temperatura ambiente.
Describa el efecto del etanol sobre la solubilidad de las proteínas así como la reversibilidad de la
precipitación a cada temperatura.
COMPARACIÓN DE MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
INTRODUCCION:
Se han descrito muchos métodos diferentes para la determinación cuantitativa de proteínas. Estos
métodos difieren entre sí en sensibilidad, existencia de interferencias, exactitud y sencillez. La selección
del método adecuado se realiza considerando las características de las muestras que se desean analizar,
que pueden ser extractos de tejidos animales o vegetales, líquidos biológicos de interés en bioquímica
clínica (suero, orina), muestras obtenidas en el curso de la purificación de una proteína, fracciones de
una columna cromatográfica, muestras de una proteína pura, etc.
En general los métodos utilizados para la determinación cuantitativa de proteínas consisten en la
determinación absorciométrica directa o en ensayos de tipo colorimétrico, turbidimétrico o
fluorométrico.
ABSORCIOMETRÍA DE PROTEÍNAS
ENSAYOS COLORIMÉTRICOS
Los ensayos más usados son los de Biuret, de Bradford, de Lowry y el ensayo usando ácido
bicinconínico. En el presente práctico se utilizarán los ensayos de Biuret y de Bradford, los cuales
difieren entre sí en sensibilidad.
El reactivo de Biuret (sulfato cúprico en medio alcalino), reacciona con compuestos que
contienen dos o más enlaces peptídicos consecutivos dando una coloración violeta. El color desarrollado
se debe a un complejo de coordinación entre el Cu++ y cuatro átomos de nitrógeno de enlaces peptídicos.
El método de Biuret en su forma original sirve para la determinación de concentraciones entre 1 y 10
mg/ml. En bioquímica clínica se usa una modificación del método que permite analizar muestras de
mayor concentración sin prediluirlas.
Interferencias: sales de amonio afectan el color, péptidos y Tris también generan el color.
CUANTIFICACION DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD
Este método utiliza la propiedad del colorante azul de Coomassie G-250 de unirse a las proteínas.
El colorante libre presenta un máximo de absorción a 465 nm mientras que cuando está unido a
proteínas el máximo se encuentra a 595 nm. El ensayo estándar sirve para el rango de concentraciones
de 10 a 100 µg/ml (0,01 a 0,1 mg/ml). La curva de calibración es ligeramente curva.
PARTE EXPERIMENTAL
1. ENSAYO DE BIURET
MATERIALES
- Reactivo de Biuret (se entrega preparado): Coloque 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4 x 5 H2O) y 6 g
de tartrato de sodio y potasio (NaKC4H4O6 x 4 H2O) en un vaso de 1000 ml. Agregue alrededor de 500
ml de agua destilada y agite hasta disolución. Agregue, lentamente y agitando constantemente, 300 ml
de hidróxido de sodio 2,5 M. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1,0 g de
ioduro de potasio y agite hasta que esté totalmente disuelto. Diluya a 1000 ml y guarde en frasco de
polietileno. Este reactivo es estable indefinidamente.
- Espectrofotómetro.
- Solución patrón de albúmina 10 mg/ml
- Suero de sangre de bovino (muestra)
PROCEDIMIENTO
CURVA DE CALIBRACION
Grafique los valores de la curva de calibración y calcule la concentración de la muestra usando el factor
de calibración (pendiente de la curva de calibración) obtenido por regresión lineal (i) y, por otra parte,
usando el k promedio (ii). Considere la dilución previa realizada a la muestra para el cálculo final de su
concentración.
Cálculo del k promedio: Calcule para cada punto de la curva de calibración el cociente A/c y promedie
estos valores (si un valor es muy diferente de los demás, elimínelo).
2. ENSAYO DE BRADFORD
MATERIALES:
- Reactivo de Bradford (se entrega preparado): Disuelva 100 mg de azul de Coomassie G-250
(Sigma) en 50 ml de etanol 95% (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregue lentamente 100
ml de ácido fosfórico 85% p/v y luego complete a 1000 ml con agua destilada. Deje el reactivo en
reposo un día completo y luego filtre. El reactivo debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el
blanco de reactivo medido contra agua presente una absorbancia mayor a 0,5.
- Solución patrón de albúmina de bovino 100 µg/ml.
- Espectrofotómetro y cubetas plásticas
- Se utilizará la misma muestra que para el test de Biuret. Establezca como debe prediluir la muestra.
PROCEDIMIENTO:
- Complete la siguiente tabla con los volúmenes de agua y estándar de manera de obtener las
concentraciones indicadas. Recuerde que para calcular la concentración de proteínas no se considera el
volumen correspondiente al reactivo de Bradford.
Tubos Agua Estándar Muestra Reactivo Concentración
destilada (l) (l) Bradford (µg/ml)
(l) (ml)
1 100 -- -- 1 0
2 1 20
3 1 40
4 1 60
5 1 80
6 1 100
Muestra -- -- 100 1
Observación: Si con la muestra se obtuviera una absorbancia mayor que con la solución de mayor
concentración de la curva de calibración será necesario repetir la determinación realizando una dilución
mayor.
Grafique los valores de la curva de calibración y calcule la concentración de la muestra usando el factor
de calibración (pendiente de la curva de calibración) obtenido por regresión lineal (i) y usando el k
promedio (ii). Considere la dilución previa realizada a la muestra para el cálculo final de su
concentración.
INSTRUCCCIONES PARA CONFECCIÓN DEL INFORME
I.-Titulo del trabajo: debe contener un título breve y apropiado que incluya o resuma todo el trabajo
realizado.
III.- Resultados: Se deben informar todos los resultados obtenidos en orden secuencial. Describir
brevemente lo que se hizo, destacando cualquier modificación realizada acompañada de las respectivas
figuras y tablas. Las figuras y tablas deben ser presentadas en forma profesional con una leyenda
que indique el número de la figura, un título breve pero informativo y toda la información
requerida para entender la figura.
IV.- Discusión: En esta sección debe analizar y discutir todos los resultados obtenidos destacando
aquellas observaciones y conclusiones más relevantes. Debe contener citadas las referencias en el
texto.
FIGURA 1. Expression of P-gp (a) and MRP1 (b) in various cell lysates by Western blotting.
Proteins extracted from glioblastoma cell lines were separated using sodium dodecylsulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a PVDF Immobilon-P. The blots were incubated
with 1 ug/ml of the C219 anti-P-gp antibody (a) or with a 1/500 dilution of the MRPr1 anti-MRP1
antibody (b). Results shown are from a single experiment and are representative of 3 different protein
extractions.