Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Métodos de análisis

Docente responsable de la práctica:

Olguín Ruiz Gabriela Edith

Alumno:
López Portillo Felipe de Jesús

Práctica:
“Estudio de algunos factores que afectan el establecimiento de un método
espectrofotométrico”

Grupo: 5QM2 Sección: 3

 Fecha de entrega: 20 de marzo, 2018.
Objetivos.
 Seleccionara tubos comunes de laboratorio para usarlos como cubetas para el espectrofotómetro.
 Manejara algunos de los parámetros que intervienen en el establecimiento de un método
espectrofotométrico.
 Establecerá las condiciones óptimas de los parámetros probados para la aplicación del método.

Reacción en la determinación de fierro por el método de tiocianato.

Resultados.

En la práctica se seleccionaron tubos para usarse como cubetas, estos tenían que tener las mínimas
imperfecciones posibles con el mismo diámetro.

T abla 1. Selección de los tubos que tengan superficies ópticamente equivalentes para usarlos como celdas y
que dan lecturas de 95 ± 2 %T.

Tubo %T 400 (H 2O) %T 400 (NiSO 4)

1 95.0 100
2 95.5 21.1
3 95.4 21.4
4 95.7 21.7
5 95.8 20.2
6 95.2 20.5
7 94.1 20.8
8 95.0 21.5
9 95.1 20.1
10 96.5 21.4
11 96.6 21.5
12 96.8 20.4
13 96.3 22.1
14 97.2 22.1
15 98.8 -
Una vez obteniéndose las celdas, se procede a realizar la curva de calibración; la cual es útil para: para la
determinación de la sensibilidad del método, la gama útil de concentración, el intervalo útil de valores A y el
límite de detección del método.

T abla 2. Curva de calibración de Fe3+.por el método del NH4SCN con la cual da absorbancia a 480 nm y
posterior ajuste por regresión lineal.

Tubo Alícuota (mL) Fe 3+ (μg/mL) y = As 480 y’ = As 480 ajustada (y – y’) (y – y’) 2

por regresión
Blanco 0.00 - 0.000 -- -- --
1 0.05 0.1158 0.003 0.040 -0.037 0.0013
2 0.15 0.3475 0.047 0.074 -0.027 0.0007
3 0.30 0.6950 0.104 0.124 -0.020 0.0004
4 0.50 1.1583 0.179 0.192 -0.013 0.0001
5 0.75 1.7375 0.292 0.276 0.016 0.0002
6 1.00 2.3166 0.363 0.360 0.003 0.0000
7 1.25 2.8958 0.449 0.445 0.004 0.0000
8 1.50 3.4750 0.545 0.529 0.016 0.0002
9 1.75 4.0541 0.647 0.614 0.033 0.0010
10 2.00 4.6333 0.712 0.698 0.014 0.0001
11 2.50 5.7916 0.901 0.687 0.214 0.0457
12 3.50 8.1083 1.249 1.204 0.045 0.0020
13 5.50 12.7416 1.817 1.879 -0.062 0.0038
∑ ( y – y’) 2
= 0.0555

Cálculos.
Ejemplo para el tubo 1:
De acuerdo a la definición de molaridad tenemos que: PM g – 1000mL – 1M, el PM del compuesto (Fe3+)
analizado es de 55.84 g, por lo que haciendo una regla de 3 obtenemos los gramos en 0.00025M.
55.84g = 1M
X g = 0.00025M
X = 0.0139g

 Sin embargo se utilizó únicamente 0.05 mL de alícuota por lo que:

0.0139g = 1000mL
X g = 0.05mL
X = 6.95 x 10-7g
  Para transformar g a μg se multiplica el resultado por 106; por lo que:

X = 6.95 x 10-7g = 0.695μg

 Finalmente se considera que en el tubo hay 6 mL, entonces, para determinar la concentración en 1
mL se divide el resultado entre 6 mL.
X = 0.695μg / 6mL = 0.1158 μg/mL

 Una manera resumida es:

( Alicuota ) (0.0139)1000 μg
Tubo 1= =X
6 mL

 Absorbancia ajustada por regresión para el tubo 1 con base a la regresión lineal obtenida en
la gráfica 1:
Absorbancia ajustada = 0.1457(Concentración de Fe3+ (μg/mL)) + 0.0234
Absorbancia ajustada = 0.1457(0.1158) + 0.0234
Absorbancia ajustada = 0.040

 Obtención de la desviación estándar del blanco con base a la tabla 2:

SB =
√ ∑ (Di− D́) 2
n−2

SB =
√ 0.0555
11
= 0.0710

 Determinación del límite de detección de un método analítico empleando la ecuación: y 1 = (0.0234 =

ordenada al origen de la grafica1) + 3(SB)
y 1 = 0.0234 + 3(0.0710)
y 1 = 0.0234 + 3(0.0710)
y 1 = 0.2424
  Calculo de la concentración de acuerdo a la absorbancia calculada en el punto anterior para
determinar la concentración mínima detectable.
Fe 3+ (μg/mL) = (0.2424 = y 1) – 0.0234 / 0.1457
Fe 3+ (μg/mL) = 1.5030

Grafica 1. Obtención de la curva tipo para la realización de la gráfica de Ringbom (Grafica 2).

2
1.8 f(x) = 0.15x + 0.02
R² = 1
1.6
1.4
1.2
A s 480 nm

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12 14
Cant idad de Fe3+ (μg/ mL)

T abla 3. Datos para aplicar el método de Ringbom en la determinación de Fe3+por el método de SCN-
Tubo Fe 3+ (μg/mL) Log [Fe 3+] As 480 %T Absortancia
1 0.1158 0.9362 0.003 99.31 0.69
2 0.3475 0.4590 0.047 89.74 10.26
3 0.6950 0.1580 0.104 78.70 21.30
4 1.1583 0.0638 0.179 66.22 33.80
5 1.7375 0.2399 0.292 51.05 48.95
6 2.3166 0.3648 0.363 43.35 56.50
7 2.8958 0.4617 0.449 35.56 64.44
8 3.4750 0.5409 0.545 28.51 71.49
9 4.0541 0.6078 0.647 22.54 77.46
10 4.6333 0.6658 0.712 19.40 80.60
11 5.7916 0.7627 0.901 12.56 87.44
12 8.1083 0.9089 1.249 5.63 94.37
13 12.7416 1.1052 1.817 1.52 98.48

Grafica 2. Obtención de la curva tipo para la realización de la gráfica de Ringbom (Grafica 2).
Para ver el efecto de la concentración del cromógeno se prepararon una serie de tubos con FeCl 3, H2O y
NH4SCN (distinta concentración), los cuales se leyeron absorbancias a 480 nm.

T abla 4. Efecto de la concentración de SCN- en la determinación de Fe3+ para la obtención de la Grafica 3.

Tubo SCN - (μg/mL) Fe 3+ (μg/mL) SCN -/ Fe 3+ As 480
Blanco 870 0 0 0
1 290 4.17 69.54 0.272
2 870 4.17 208.63 0.412
3 2900 4.17 695.44 0.532
4 5800 4.17 1390.88 0.644
5 8700 4.17 2086.33 0.702
6 11600 4.17 2781.77 0.732
7 14500 4.17 3477.21 0.758

Cálculos.
1. Ejemplo para el Fe 3+ (μg/mL) del tubo 1 al 7:
De acuerdo a la definición de molaridad tenemos que: PM g – 1000mL – 1M, el PM del compuesto (Fe3+)
analizado es de 55.84 g, por lo que para determinar la concentración en microgramos con un volumen final
de 5 mL. Usando la formula resumida, tenemos que:

( Alicuota )( 0.0139 ) 1000 μg

[ Fe ] = =X
5 mL

( 1.5 )( 0.0139 ) 1000 μg

[ Fe ] = =4.17
5 mL

2. Ejemplo para el SCN - (μg/mL) del tubo 1:

De acuerdo a la definición de molaridad tenemos que: PM g – 1000mL – 1M, el PM del compuesto (Fe3+)
analizado es de 58 g, por lo que haciendo una regla de 3 obtenemos los gramos en 0.5M.

58g = 1M
Xg = 0.5M
X = 29g
  Usando la formula resumida:

( Alicuota ) (29)1000 μg
[SCN ]= =X
5 mL
( 0.05 ) (29) 1000 μg
[SCN ]= =290
5 mL

Grafica 3. Efecto del cromógeno de acuerdo a los resultados de la tabla 4.

0.8

0.7

0.6

0.5
A bsort ancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

S CN/ Fe3+

 ¿Qué concentración de tiocianato se recomienda?

Se prefiere que el cromógeno no sea un reactivo limitante, si se usa una solución saturada la reacción se
desplaza a la formación de productos.

T abla 5. Estabilidad del color respecto al tiempo.

Tiempo As 480 nm
0 0.523
30 0.486
60 0.455
90 *
120 *
*Debido a un descuido por parte de los analistas no se obtuvieron estos resultados.

 ¿Es estable el color?

No, conforme pasa el tiempo pasa la absorbancia va disminuyendo por lo que la reacción no es constante.
  ¿Cuál es el tiempo óptimo para hacer las lecturas?
El tiempo 0, porque es donde tenemos la mayor absorbancia.

T abla 5. Efecto del pH.

Tiempo As 480 nm pH
0 0.890 0
30 0.920 1
60 0.875 2
90 0.013 7
120 0.021 8

 ¿De qué manera influye el pH en el sistema colorido?

A pH alcalino el hidróxido reacciona con el fierro formando hidróxido de fierro, por lo que al añadir el tiocianato
ya no reacciona con el fierro ocasionando ausencia de color.
A pH acido se forma más rápido el complejo colorido ya que el fierro reacciona con el tioacianato.
 ¿Cuál es el pH recomendado para que se efectué la reacción Fe 3+ - SCN -?
A un pH acido.

T abla 6. Efecto de algunos aniones en la reacción de Fe3+ - SCN-

Tiempo As 480 nm Inicial As 480 nm final ∆As 480 nm
Fluoruro 0.871 0.084 0.787
Oxalato 0.828 0.083 0.745
Tartrato 0.891 0.887 0.004
Fosfato 0.842 0.785 0.057

Grafica 4. Efecto de algunos aniones en la reacción de Fe3+ - SCN- de acuerdo a la tabla tabla 6.
 Fosfato

Tartrato
Anión

Oxal ato

Fl uoruro

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

∆As480 nm

 ¿Cuál es el efecto de los diferentes aniones sobre la reacción entre el ion férrico y el
tiocianato?

 ¿A qué se debe este efecto?

Se debe a la electroneatividad del anion.

Discusión.
Conclusiones.

 Se elaboró una curva de calibración para la cuantificación de proteínas empleando un

método fotométrico.
 Se determinó el efecto de algunas sustancias no proteínicas, que pueden interferir en el
método.
 Existe evidencia significativa que respalda el hecho en que la precisión de Bradford a
diferencia de la de Lowry es menor, en contra parte en exactitud no la hay.

Bibliografía.

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