Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
Práctica: Determinación de aminoácidos terminales con grupo alfa amino libre.
Método de Sanger
Objetivo: Identificar el aminoácido alfa-terminal de
las cadenas de la molécula de hemoglobina
mediante el método de Sanger.
Interpretación de la preparación del derivado
dinitrofenilado: El primer paso consistió en agregar
30 mg de hemoglobina en un tubo con bicarbonato
de sodio al 4.2%, esto con el fin de alcalinizar nuestra
muestra proteica y desprotonar el grupo N terminal;
a esta disolución añadimos 2 mL de DNFB 1% para
hacerla reaccionar por ataque nucleofilico y se agito
por 1 hora para acelerar la reacción por energía
cinética.
Posteriormente agregamos 12 gotas de HCl 3N con
el fin de ajustar nuestro pH por debajo de 3 para
después extraer con éter 3 veces para retirar el
exceso de dinitrofluorobenceno. Se adicionaron 5
mL de HCl para romper nuestros en laces peptídicos
y de esta forma en l autoclave durante tres horas a
presión constante con esto se logra la ruptura de los
enlaces peptídicos de la hemoglobina, obteniéndose
un “caldo” de aminoácidos que contiene al amino
ácido n-terminal, Se adiciono agua para eliminar los
aminoácidos libres que estos son polares. El caldo
restante se extrae con éter, se pasa a una parrilla y
se evapora casi a sequedad, el residuo se disuelve
en 5 ml de etanol para después continuar con la
identificación por cromatografía.
Esquema del Cromatograma:
Resultados:
Compuesto RF
DNP-Asp
DNP-Val
DNP-Glu
DNFB
Problema
Discusión:
En base a lo realizado en la práctica, la reacción de
Sanger Identifica el grupo α-amino terminal de la
hemoglobina, poniendo en evidencia la coloración
amarilla característica de esta prueba, esto es
debido a un proceso intermedio llamado
Dinitrofenilacion, este cosiste en la adición del grupo
Dinitrofenil al amino terminal de la proteína.
La identificación se hizo por medio de una
cromatografía en papel Whatman , colocando en él,
cada uno de los derivados dinitrofenilados de los
aminoácidos tipo DNP-Asp, DNP-Val, DNP-Glu,
DNFB y la solución problema(obtenida en el
laboratorio), se observa la similitud entre la solución
problema y la solución de valina, la cual se confirmó
con cálculos de Rf, donde la valina es el dato más
cercano al del problema y corresponde al consultado
con la bibliografía.
Conclusión:
 El aminoácido que contiene el grupo α-
terminal de la hemoglobina, es, la valina.
Bibliografía:
Fonaguera J. y G. Gómez (2004), “BIOQUIMICA:
LACIENCIA DE LA VIDA”, Editorial de la Universidad Estatal
a Distancia (2004).
Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005). Lehninger “Principios de
Bioquímica” 4ª Edición. Ed. Omega.