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I. PRINCIPIOS DE CROMATOGRAFÍA

El término “cromatografía” fue ideado por el botánico ruso Tswett en 1906 a

La fase estacionaria es
partir de las palabras griegas que significan “color” y “escritura”. Diseño un un sólido, o un líquido
método para separar la clorofila y otros pigmentos de las plantas mediante un inmovilizado sobre un
tubo (columna) lleno de carbonato de calcio seco (empaque de la columna). soporte sólido.
Vació sobre la columna una mezcla de disulfuro de carbono y éter de petróleo
(fase móvil) y observó que al lavar la columna con más disolvente los
constituyentes del extracto descendían por la columna a distintas velocidades La fase móvil se le
conoce como eluyente
y se separaban en anillos coloreados (ver figura 1). o acarreador y puede
ser un gas o un líquido

Figura 1. El experimento de Tswett.

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La separación de los componentes de la muestra

DEFINICIÓN: La cromatografía se
ocurre debido a que cada componente de la muestra
interactúa en forma distinta con los componentes de la define como la técnica analítica de
fase estacionaria. Entre más afines sean los dos, más separación originado por la competencia
difícilmente serán eluídos por el solvente. de dos fases por los componentes de
una mezcla

El proceso mediante el cual el eluyente hace que un compuesto salga de la columna se denomina elución.
Al constituyente mayoritario de una solución se le denomina solvente y al constituyente minoritario soluto.
No es necesario que las substancias a separar sean coloridas, pero sí debe disponerse de algún método
apropiado para su detección. En cualquier caso, los resultados se grafican para dar un cromatograma.
Cada “pico” representa un componente distinto de la muestra, y el área del pico es una medida de la
concentración relativa de ese componente. La figura 2 muestra un cuadro sinóptico con los principales
tipos de cromatografía y su clasificación.

Figura 2. Una clasificación de los métodos cromatográficos.

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MECANISMOS DE SEPARACIÓN EN CROMATOGRAFÍA

El principio para que se separe una muestra en sus componentes puede ser debido a 5 principales
fenómenos físicos:

1. Adsorción. En este mecanismo se utiliza una fase estacionaria porosa, con un área superficial
muy grande (por ejemplo, carbón activado o sílica gel). El soluto se adsorbe en la superficie de la fase
estacionaria. La causa de que se mantenga adsorbido el soluto se debe a la separación de este a lo
largo de la superficie de la fase estacionaria.

Figura 3. Caricatura que esquematiza la diferencia

entre los fenómenos de absorción y adsorción

La cromatografía de adsorción o Líquido-Sólido es la forma clásica de la cromatografía de líquidos. Ha

sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un método importante de la HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografía son la sílice y la alúmina, siendo la
primera la preferida.
Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5 000.
Los métodos de la cromatografía de adsorción y reparto tienden a ser complementarios, aunque en
algunos casos se superponen.
En general la cromatografía Líquido-Sólido es más adecuada para muestras que son solubles en
disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que
se utilizan en cromatografía de reparto en fase inversa. En este tipo de cromatografía también se
pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una característica particular de este
método es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros en mezclas.

Figura 4. Partícula con gran área superficial. A. Libre B. Con 30% de partículas adsorbidas.
C. con 70% de partículas adsorbidas. D. Con adsorción del 100%
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2. Reparto. La fase estacionaria es una película delgada fija sobre un soporte sólido previamente
preparado. El soluto se separa por el equilibrio que se establece por la solubilidad que tenga el soluto
frente a este líquido estacionario y a la fase móvil gaseosa o líquida. Para ilustrar esto, supongamos
que tenemos una serie de vasos de precipitado llenos con agua hasta la mitad. Se añade al primero
de los vasos una mezcla de las moléculas A y B. A posee una Kr (hexano:agua) de 0.9, en tanto que la
Kr de B es 0.1. A continuación se añade un volumen de hexano al primer vaso, se agita, se permite la
separación de las fases y se recupera dicho hexano. El hexano recuperado en este primer vaso se
añade al segundo y se añade más hexano limpio al primer vaso. Ambos se agitan, se dejan separar
las fases y se recupera el hexano. El hexano del segundo vaso se pasa al tercero el del primero al
segundo y se añade hexano nuevo al primer vaso. Este procedimiento se repite hasta que todos los
vasos se llenen con hexano. Si el experimento consistiese de 8 vasos, al final la cantidad de A y de B
presente en cada vaso (sumando lo contenido en el hexano y el agua) presentará una distribución
como la que se muestra en la figura 5.

Figura 5. Distribución de A y B en hexano y agua

Si juntamos los vasos 1 al 3 por un lado y los vasos 6 al 8 por otro y evaporamos el solvente,
habremos separado la sustancia A de la B con una mínima pérdida (lo que se quedó en los vasos 4 y
5).

SEPARACIÓN POR EXTRACCIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO

Ejemplo del principio de reparto entre dos fases inmiscibles. Cuando una mezcla de moléculas
disueltas en un solvente determinado se pone en contacto con otro solvente que sea inmiscible con el
primero, las moléculas disueltas se difundirán hacia la nueva fase hasta alcanzar una concentración
en cada fase (solvente) que depende de la solubilidad relativa de dicha molécula en las fases.

HEXANO

AGUA

Figura 6. Principio de reparto entre dos fases inmiscibles.

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En la figura 6, las esferas rojas representan moléculas muy solubles en hexano y poco solubles en
agua, mientras que las esferas verdes representan moléculas muy solubles en agua y poco solubles
en hexano.

El resultado es que ahora la fase hexánica contiene a las moléculas representadas por esferas rojas y
estas se han separado de las otras, que permanecen en el agua.

La concentración de moléculas "rojas" en el hexano dividida por la concentración de moléculas "rojas"

en el agua, cuando se ha alcanzado el equilibrio, representa el Coeficiente o Constante de
Reparto de la sustancia en cuestión entre agua y hexano.

Kr = (Concentración en Hexáno)/(Concentración en el agua).

Así mismo, se puede calcular un coeficiente de reparto para las moléculas "verdes". Es evidente que
la Kr("rojas") será elevada, mientras que la K r("verdes") será muy pequeña.

Una sustancia determinada presentará una K r diferente para cada par de solventes que se ensaye.
Debe advertirse también que esta definición es válida siempre que los volúmenes de solvente
empleados sean grandes, a fin de evitar que las soluciones se saturen.

Dado que la difusión de las moléculas de una fase a la otra es lenta, el proceso debe acelerarse
agitando la mezcla de solventes hasta formar una suspensión fina de gotitas de hexano en el agua o
viceversa. Para recuperar la fase hexánica se permite que la dos fases se separen por sedimentación
(dado que son inmiscibles y de distinta densidad). Aunque esta separación de fases también puede
acelerarse mediante centrifugación.

La separación puede hacerse más completa si después de recuperar el hexano, se añade una nueva
cantidad de hexano limpio al agua. Esta vez, las pocas moléculas "rojas" presentes en el agua
pasarán al hexano y la cantidad de ellas que permanezcan en el agua será aún menor.

La eficiencia de la separación depende del número de lavados con solvente y de la diferencia en las
constantes de reparto de ambas substancias.

Generalizando:

conc.de X en el solvente 1 [X]1

K 
conc.de X en el solvent e 2 [X]2

Otro ejemplo:
el yodo es 85.5 veces más soluble en tetracloruro de carbono que en agua, de modo que para este
sistema el coeficiente de reparto es:
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conc. de yodo en CCl4
K  85.5
conc.de yodo en H2O
Entonces, una manera sencilla de separar el yodo
de una solución acuosa sería extraerlo con CCl 4. El
sentido común nos dice que entre más extracciones
realicemos, más completa será la remoción del
componente. Aunque no es difícil deducir la fórmula
básica para la extracción por lotes, en esta ocasión la
daremos sin demostración:
8
En teoría, es posible separar una mezcla
de substancias realizando un número
muy grande de extracciones hasta
garantizar la pureza deseada. Sin
embargo, la extracción líquido-líquido
tiene la desventaja de que es un proceso
por lotes, no continuo. Además, realizar
un número grande de extracciones es
tedioso y se puede perder fácilmente una
gran cantidad de muestra entre cada
extracción

 V n

Wn  W0  2 

K V1  V2 

donde:
K coeficiente de reparto para el soluto X entre los solventes 1 y 2
n número de extracciones realizadas
W0 gramos de X en el solvente 2 antes de cualquier extracción
(iniciales)
Wn gramos de X en el solvente 2 después de n extracciones (finales)
V1 volumen del solvente utilizado para cada extracción
V2 volumen del solvente donde está el soluto originalmente

Explicaremos el uso de la fórmula con un ejercicio.

Ejercicio:
Supongamos que queremos extraer 2 gramos de soluto X de 50 mL de agua. Como solvente de
extracción se usará cloroformo. Para este sistema se sabe que el coeficiente de reparto es:
[X]1 [X]CHCl3
K  3
[X]2 [ X]H2O

¿Qué es mejor: hacer una extracción con 150 mL de cloroformo, o hacer tres extracciones con 50 mL
de cloroformo cada una?

Solución:
Identificamos al solvente 1 como el cloroformo. El solvente 2 es el agua. El coeficiente de reparto K
está escrito en la forma correcta (conc. 1 / conc. 2). Entonces,

a) Una sola extracción (n = 1) con 150 mL de cloroformo

V1 = 150 mL de CHCl3
V2 = 50 mL de H2O
W0 = 2 g de soluto X hay inicialmente en el agua
 V 1
W1  W0  2 
K V  V 
 1 2 
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 50 1
La separación se realiza debido a las
W1  2  
3(150)  50   0.2 g
  fuerzas electroestáticas entre cargas
opuestas de la fase estacionaria y los
solutos cargados. La fase móvil es un
Quedaron 0.2 g de X en el agua. Pudimos extraer 2-0.2 líquido.
= 1.8 g, es decir, el 90 % de X.

b) Tres extracciones (n = 3) con 50 mL de cloroformo cada una

V1 = 50 mL de CHCl3
V2 = 50 mL de H2O
W0 = 2 g de soluto X hay inicialmente en el agua

 V 3

W3  W0  2  ¡Tres extracciones

K V1  V2  pequeñas son
mejores que una
grande!
 50 3
W3  2  
3(50)  50   0.03125 g
 

Quedaron 0.03125 g de X en el agua.

Pudimos extraer 2 - 0.03125 = 1.969 g, es decir, más del 98 % de X.

3. Intercambio Iónico. Para que se efectúe la separación, la fase estacionaria se modifica uniendo
a su superficie especies electro activas (aniones o cationes) de forma covalente.

Intercambiadores catiónicos Intercambiadores aniónicos

La matriz de la columna contiene La matriz de la columna contiene

unidos grupos anionicos con unidos grupos catiónicos con
carga negativa. carga positiva.

Figura 7. Ejemplos de intercambiadores ionicos

Se usa para purificar proteínas. Separa moléculas en base a su carga iónica. La fase estacionaria
presenta una matriz con carga. Al eluir una muestra, las moléculas de igual carga salen con el
amortiguador. Las moléculas de carga opuesta se adhieren al material de empaque con distintos
grados de afinidad. Para desprender las proteínas adheridas se usa una solución alta en cloruro de
La columna puede ser de
matriz negativa
(intercambio catiónico) o
positiva (intercambio
aniónico).
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potasio o de sodio. Esto puede hacerse usando soluciones con incrementos moderados de salinidad,
o de un solo paso, echando la solución de mayor concentración de sal primero. Al subir la
concentración poco a poco podemos recolectar las muestras desde las que menos afinidad por la
columna tiene hasta las de mayor afinidad. Durante la elución, la sal va compitiendo con la proteína
por las cargas de la matriz de la columna, hasta que la desprende.

Figura 8. Principio de la cromatografía de intercambio iónico.

4. Exclusión molecular. Esta separación se debe al tamaño del La cromatografía de

componente de la muestra. Se asemeja a un “tamiz molecular”, en el exclusión, también es
cual la fase estacionaria es un gel poroso que atrapa a las partículas llamada de filtración en gel
o cromatografía de
pequeñas del soluto, mientras que las grandes, no caben por los permeación en gel.
poros de este gel y pasan de largo sin ser retenidos. Por lo tanto, las
partículas pequeñas tardan más en salir de la columna.
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El tiempo de elución es proporcional al peso molecular de los Este técnica se emplea
componentes, por lo que no es muy usada con los compuestos de en la separación de
alto peso molecular. Este tipo de separación por tamaño difiere de proteínas de alimentos,
las demás técnicas de cromatografía en que no existen interacciones determinación de glucosa
y fructosa en zumos de
físicas o químicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una fruta, etc.
técnica reproducible, escalable y rápida. La fase fija está formada por
partículas poliméricas o de sílice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden
penetrar las moléculas de pequeño tamaño. Las moléculas de tamaño grande se excluyen totalmente
y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeño tamaño tienen acceso a todo el volumen
poroso y son las últimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las
moléculas pequeñas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las moléculas se eluyen por su
tamaño decreciente.
Los diferentes tipos de partículas usadas deben ser estables, mecánica y químicamente, tener bajo
contenido en grupos iónicos, uniformidad de poro y tamaño. Los
compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), En resumen los factores
derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel que determinan la
separación de las
P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaños de partícula para un moléculas son el tamaño
gel: a menor tamaño mayor resolución y menor gasto en la columna. del poro, el tamaño de la
partícula y el flujo de
elución.

Figura 9. Principio de la cromatografía de filtración en gel.

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5. Afinidad. Es la técnica más reciente y más Se usa ampliamente en la separación de

selectiva. Se inmovilizan moléculas (como enzimas y proteínas de alto peso molecular.
anticuerpos) sobre la superficie de la fase
estacionaria. Los componentes de la muestra
altamente afines a estas moléculas se retienen con gran eficacia mientras las que no son afines,
pasan de largo a través de la columna y salen en primera instancia.
Proteínas afines a
glucosa unidas a
residuos de glucosa
(G) en el soporte

Adición de glucosa
(G)

Las proteinas
enlazadas a la
glucosa son
expulsadas sobre la
glucosa adicionada

Figura 10. Principio de la cromatografía de afinidad.

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CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA

Cuando solo se tiene miligramos de una mezcla, conviene separar sus componentes por cromatografía
preparativa, pudiéndose obtener un miligramo o más de sustancias puras, por repetidas cromatografías,
usando columnas preparativas o papel de filtro grueso (tipo 3MM). En columna, se tiene el sistema de
columna abierta, o de flash, en el cual simplemente se alimenta el analito y los solventes desde la parte
superior, y se colectan las fracciones en la parte final de la columna.
Un sistema sencillo, diferente del de columna abierta, consiste de una columna y una bomba para proveer
la presión necesaria para obtener la separación, optimizando el tiempo.

Figura 11. Principio del equipo de Cromatografía Büchi

Con este sistema, pueden separarse desde 1 mg hasta 100 g de analito.

Figura 12. Equipo de Cromatografía Büchi

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Cartuchos de extracción en fase sólida.

Una aplicación de la cromatografía preparativa consiste en la purificación o pre-concentración de muestras

mediante extracción en fase sólida (SPE). Esta técnica es útil para preparar las muestras líquidas y extraer
loa analitos semivolátiles o no volátiles, pero también puede ser utilizada con los sólidos que son pre-
extraídos en disolventes. Productos de la SPE son excelentes para la extracción de la muestra, la
concentración y la limpieza. Están disponibles en una gran variedad de químicos, adsorbentes, y tamaños.
(Para información más detallada, visite:
http://www.sigmaaldrich.com/Graphics/Supelco/objects/4600/4538.pdf)

Figura 13. Algunos ejemplos de cartuchos de extracción en fase sólida

Figura 14. Ejemplo de una SPE.

Tomado de www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10048919

Si se realiza la cromatografía preparativa en papel, concluida la cromatografía se recortan las manchas y

los compuestos separados se eluyen del papel con disolventes apropiados; se evapora el disolvente y se
cristalizan las sustancias, obteniéndose sus puntos de fusión y otras propiedades físicas (UV, IR, RMN,
EM, etc.). Si se trata de compuestos líquidos, conviene convertirlos en derivados sólidos, por ser más
fáciles de purificar y manipular.

Actualmente existen en el mercado sistemas con aceleración centrífuga para la realización separaciones
preparativa radiales en capa delgada. Lo que permite separaciones relativamente rápidas (aprox. 20
minutos), sin necesidad de raspar bandas separadas como en la Cromatografía de Capa Fina tradicional.
(ver http://www.ichromatography.com/cyclograph-centrifugal-chromatography-device.html).
Material de apoyo para ElectroQuímica Analítica y Cromatografía 15
En estos sistemas el compuesto a separar se aplica en solución en el dispositivo circular, que se encuentra
rotando a una velocidad predeterminada; la mezcla de disolvente elegido se bombea a través de una capa
que funciona como fase estacionaria, de manera que como resultado de las diferentes afinidades para esta
capa y la mezcla de disolvente se realiza la separación de los componentes individuales; cuando éstos
alcanzan el borde exterior del rotor, la fracción separada se colecta en un contenedor especial.

Figura 15. CycloGraph ™