Cap1 Gral

EL
DIAGNÓSTICO
ENZIMÁTICO DE
CAPÍTULO 1
LAS
ENFERMEDADES
LISOSOMALES
Jiménez J., Luis M. (*)
(*) Servicio Bioquímica Clínica. Hospital

Universitario Virgen del Rocío. Sevilla
Índice
INTRODUCCIÓN ....................................................................... 3
EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES LISOSOMALES ......... 6
¿CÓMO SE LLEVAN A CABO LAS DETERMINACIONES

ENZIMÁTICAS? ......................................................................... 9
FUNDAMENTO DE LA DETERMINACIÓN .................................. 10
 Mucopolisacaridosis Tipo I. OMIM 607014 (IH)-607015(IHS)-607016 (IS) ..... 12
 Enfermedad de Fabry (OMIM 301500) ........................................................ 14
 Enfermedad de Pompe (OMIM 232300) ...................................................... 23
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................ 28
Jiménez Jiménez, Luís M.

INTRODUCCIÓN
En la década de los años 60 del siglo pasado aparecen en Europa las primeras
referencias en torno al concepto de enfermedad rara. Sin embargo, no es hasta 1983,
tras la constitución en los Estados Unidos de Norteamérica de la National Organization
for Rare Disorders (NORD), cuando se acepta de forma oficial el término de
Enfermedad Rara (ER), haciendo referencia a enfermedades con baja prevalencia.
Posteriormente, en 1997, se constituye EURORDIS (European Organization for Rare
Disorders) como federación homóloga a la norteamericana y finalmente, en 1999,
surge FEDER (Federación Española de Enfermedades Raras) con el fin de dar respuesta
a las asociaciones de enfermos con estas patologías que han ido proliferando poco a
poco a lo largo de estos años.
En la actualidad, las ER se pueden definir como “aquel conjunto de enfermedades que
se caracterizan por afectar, cada una de ellas, a un número reducido de individuos de
la población (prevalencia inferior a 5 por cada 10.000 habitantes), que tienen un
carácter crónico y discapacitante, disponen de una elevada tasa de morbimortalidad y
para las que los recursos terapéuticos son, en general, escasos y poco eficaces”.
Actualmente se estima que existen unas 5.000 ER o de baja prevalencia. Entre ellas
destaca un grupo de enfermedades, afortunadamente cada vez más conocidas y
estudiadas, que son las enfermedades de depósito lisosomal (EDL), con una incidencia
individual variable pero con una incidencia combinada de 1 cada 5.000 a 7.000 recién
nacidos vivos.

Estas enfermedades de depósito tienen su origen en un trastorno genéticamente
determinado que origina una alteración en la fisiología de los lisosomas, un orgánulo
subcelular de extraordinaria importancia para la vida de la célula. Los lisosomas son
orgánulos intracitoplasmáticos que contienen enzimas hidrolasas ácidas encargadas de
la degradación de macromoléculas (proteínas, carbohidratos complejos, lípidos,
sulfatos, fosfatos, etc.) procedentes del propio metabolismo celular o bien captadas
del exterior por un proceso de endocitosis. Estos productos degradados son finalmente
reutilizados por la célula o bien eliminados al exterior. La ausencia o pérdida de
función de una de estas enzimas implicadas en el proceso degradativo origina la
acumulación dentro del lisosoma de productos metabólicos intermedios.
Las EDL representan un grupo heterogéneo de unas 50 enfermedades genéticas
provocadas por mutaciones en los genes que codifican para las diversas enzimas
lisosomales, para otras proteínas implicadas en la correcta biogénesis y/o el normal
funcionamiento de los lisosomas tales como coenzimas, proteínas de membrana,
proteínas de transporte, etc.
La etiología de este tipo de enfermedades tienen en común el progresivo acumulo de
productos no metabolizados que originan una disfunción celular y que,
posteriormente, se traduce en alteraciones histológicas en particular, y orgánicas, en
general.
Por tanto, la secuencia de acontecimientos en este tipo de enfermedades (EDL) se
inicia con la existencia de una mutación génica patógena y finaliza con la producción
de una serie de manifestaciones clínicas resultantes del acumulo del material no

digerido. Así pues, es lógico pensar que las EDL deben considerarse como patologías
consecuentes tanto de “deficiencias” como de “acúmulos”.
Aunque el orden en la secuencia fisiopatológica es probablemente el mismo en todas
ellas, cada enfermedad y, por supuesto, cada paciente, tienen unas manifestaciones
clínicas distintas en función de la patología molecular responsable y de las células
afectas en cada una de ellas.
Las EDL pueden ser clasificadas de acuerdo con la naturaleza del material acumulado o
bien por la deficiencia proteica existente. La clasificación más utilizada hace referencia
al material acumulado y, así, se pueden clasificar en: lipidosis, mucopolisacaridosis,
glucogenosis, glucoproteinosis, lipofucsinosis, mucolipidosis y otras.
El diagnóstico de este tipo de enfermedades es extraordinariamente difícil debido a la
variabilidad en la expresión clínica. La severidad y el alcance de cada una de ellas es, a
menudo, inconsistente incluso dentro de las mismas familias, ya que pacientes con el
mismo genotipo pueden expresar fenotipos diferentes. Por ello, hasta hace
relativamente poco tiempo, el diagnóstico preciso no era sencillo, requiriéndose el uso
de técnicas invasivas y complejas. En la actualidad existen una serie de tests que
posibilitan el mismo mediante el uso de técnicas no invasivas o mínimamente
invasivas.
Por otro lado, desde hace unos años, las posibilidades terapéuticas de las EDL han
experimentado un considerable avance. Así, hemos pasado de realizar un tratamiento
exclusivamente sintomático a llevar a cabo una terapia específica para cada una de las

enfermedades mediante la administración de la enzima deficitaria. Desgraciadamente,
en la actualidad, sólo se dispone de este tipo de tratamiento para un grupo reducido
de ellas.
Existe, además, una relación directa entre el momento de inicio de las medidas
terapéuticas y la buena respuesta al tratamiento. Por tanto, resulta imprescindible un
diagnóstico precoz y una atención especializada de los pacientes afectos, la cual se
debe llevar a cabo en centros especializados debidamente capacitados para ello.
EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES LISOSOMALES
El diagnóstico de las EDL, como toda enfermedad de origen genético, debe abordarse
desde el punto de vista bioquímico-molecular a tres niveles diferentes, que deben
realizarse de modo secuencial:
1. El primer nivel consiste en determinar la presencia de determinados
compuestos, diferentes en cada una de las EDL, en distintas muestras
biológicas: orina, sangre, líquido cefalorraquídeo, etc. Este primer nivel puede
completarse mediante el empleo de otras técnicas que incluyen:
 Estudios celulares que nos evidencien la presencia de determinados tipos
de células características de algunas de estas enfermedades (Gaucher,
Nieman-Pick C, etc.)
 Estudios histoquímicos que nos pongan de manifiesto el acumulo de
productos no degradados en diferentes tejidos y órganos

(globotriaosilceramida en el glomérulo renal, glucógeno en músculo, etc.).
 Estudios ultraestructurales o radiográficos que nos muestren alteraciones
orgánicas características de algunas EDL (músculo en Pompe o hueso en
Gaucher).
2. En el segundo nivel, una vez demostrado el acumulo del/los compuesto/s en las
diferentes muestras analizadas, la presencia de tipos celulares característicos o
las alteraciones histológicas existentes, deberemos estudiar la actividad
enzimática específica responsable de la patología.
3. El tercer nivel trata de analizar el gen que codifica la enzima alterada mediante
el uso de técnicas moleculares que precisan el aislamiento previo del ADN.
En la presente revisión nos vamos a referir exclusivamente al diagnóstico enzimático,
al cual podemos acceder tras la existencia de una clínica compatible y la realización
previa de los diferentes tests bioquímicos y/o ultraestructurales anteriormente
mencionados.
El diagnóstico enzimático de este tipo de enfermedades constituye el método “gold
standard” para las mismas, ya que permite poner en evidencia la existencia de un
déficit parcial o total de la enzima responsable, en último término, de la patología
existente.

Este tipo de diagnóstico lo podemos realizar en distintos tipos de muestras biológicas,
dependiendo de la enfermedad de que se trate. Tradicionalmente se han utilizado
diferentes muestras de tejidos: fibroblastos obtenidos mediante biopsia de piel,
hepatocitos mediante biopsia hepática, biopsias musculares, etc. Todas ellas
constituyen técnicas invasivas, que hoy en día han pasado a un segundo plano, y a las
que sólo se recurre cuando no se haya llegado a un diagnóstico definitivo mediante el
empleo de técnicas no invasivas.
Así pues, actualmente, los laboratorios especializados utilizan muestras sanguíneas de
fácil obtención y, según el tipo de enfermedad que queramos diagnosticar, se
requerirá el aislamiento posterior de leucocitos totales o linfocitos individualizados.
No obstante, este tipo de muestras presentan el inconveniente de su rápido deterioro,
debiendo procederse al aislamiento de leucocitos/linfocitos lo más rápidamente
posible. Por ello, deben tomarse en el propio laboratorio o bien enviarse a éste,
debidamente refrigeradas, en un periodo de tiempo no superior a 24 horas tras su
obtención. Llegada la muestra al laboratorio, debe procederse al aislamiento de las
células y a la determinación enzimática inmediata, o bien a su congelación a -80ºC
hasta la realización de la determinación analítica.
En la actualidad, la posibilidad de determinación de las actividades enzimáticas en
sangre seca recogida sobre papel (DBS) ha supuesto una alternativa útil y eficaz. Este
tipo de muestras, introducida por Robert Guthrie en 1963 para el diagnóstico de la
fenilcetonuria, fue aplicada al estudio de las actividades enzimáticas lisosomales por
Nestor A. Chamoles en 2001.

Las muestras, además de su fácil obtención mediante punción en el talón o en la yema
del dedo, presentan una serie de ventajas:
 Pueden enviarse por correo a los laboratorios especializados, sin necesidad de
que el paciente acuda a ellos.
 Se precisa sólo una pequeña cantidad de sangre (de gran interés en neonatos).
 Las muestras no requieren especiales medidas de conservación ni durante su
envío ni tras la llegada a los laboratorios, donde pueden conservarse a 4ºC
protegidas de la humedad durante largos periodos de tiempo.
 Son de fácil manejo.
 Tienen menor capacidad infecciosa que las muestras líquidas.
El uso de muestras de sangre seca recogida sobre papel puede considerarse, pues,
como un método rápido, barato y mínimamente invasivo que puede utilizarse en el
diagnóstico de sospecha de cualquier tipo de enfermedad lisosomal, así como en el
seguimiento de los pacientes ya diagnosticados.
¿CÓMO SE LLEVAN A CABO LAS DETERMINACIONES ENZIMÁTICAS?
El estudio de las actividades enzimáticas debe comenzar mediante la determinación en
muestras de sangre seca recogida sobre papel (DBS). Para ello se emplean unos discos
de sangre de un diámetro determinado, dependiendo del tipo de técnica de que se
trate, obtenidos mediante el empleo de “punchers” especiales. De este modo,
podemos tener una referencia de la cantidad de sangre utilizada y así poder realizar

los cálculos correspondientes. Un disco de 3 mm de diámetro, teniendo en cuenta la
capacidad de imbibición de estos papeles cromatográficos especiales (Whatman 903,
SS 903), tiene un volumen aproximado de 3,2 µL de sangre total.
Las técnicas utilizadas en DBS son las mismas que las realizadas en leucocitos, linfocitos
y otros tipos celulares, con pequeñas modificaciones para posibilitar la cuantificación.
Lógicamente, estas determinaciones enzimáticas deben realizarse bajo estrictos
controles de calidad, por lo que se requiere el empleo de controles procedentes de
laboratorios externos de referencia que garanticen nuestro trabajo.
Mediante este tipo de metodología, iniciada a comienzos de siglo, cada vez son más las
enfermedades lisosomales que pueden diagnosticarse.
Si, tras la aplicación de la técnica en DBS, se pone en evidencia la existencia de un
déficit enzimático, se solicitará el envío de una muestra líquida (sangre total recogida
sobre EDTA), en donde se procederá al diagnóstico de confirmación definitivo.
FUNDAMENTO DE LA DETERMINACIÓN
Para cada enzima en particular, el fundamento de la determinación consiste en utilizar
un sustrato específico para la enzima unida artificialmente a un compuesto
potencialmente fluorescente, como la 4-Metil-Umbeliferona (4MU). Tras la
incubación en placas microtiters con la muestra del tipo que sea (DBS, leucocitos,
linfocitos) a 37ºC y a un pH variable, según la naturaleza enzimática, se producirá una
fluorescencia cuya intensidad dependerá de la cantidad de 4MU liberada. Ésta será
10

directamente proporcional a la actividad enzimática existente en la muestra.
SUSTRATO-4MU + MUESTRA     PRODUCTO + 4MU

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
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DETERMINACIÓN DE LAS ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS DE MAYOR INTERÉS
 Mucopolisacaridosis Tipo I. OMIM 607014 (IH)-607015(IHS)-607016

(IS)
Enfermedad autosómica recesiva con afectación multisistémica. Está causada por la

deficiencia enzimática encargada de la degradación de los glicosaminoglicanos
dermatán y heparán sulfato, los cuales se acumulan en diferentes tejidos del sistema
nervioso central, esquelético, cardiovascular, digestivo, ocular, etc.
 Enzima responsable: α-L-Iduronidasa (EC 3.2.1.76), glicoproteína monomérica
de 653 aminoácidos y un peso molecular de 74 KDa, que hidroliza los residuos
terminales de ácido α-L-idurónico constituyente de algunos
glicosaminoglicanos.
 Gen codificante (IDUA): El gen que codifica la enzima se encuentra localizado
en el locus 4p16.3 y está formado por 14 exones.
 Prevalencia: Es variable según las etnias, pero puede considerase con una
incidencia media de 1 cada 100.000 nacidos vivos.
 Formas de presentación: Fenotipos Hurler (IH), Hurler-Sheie (IHS), Sheie (IS),
de mayor a menor gravedad respectivamente.
 Determinación de la actividad enzimática:
1. Tipo de muestra: Sangre seca en papel (DBS), leucocitos totales,
fibroblastos.
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2. Metodología: Espectrofluorimetría en microplaca o cromatografía líquida
de alta resolución con detección mediante espectrometría de masas (HPLC-
MS/MS).
3. Sustrato utilizado en la determinación enzimática: 4-metil-umbeliferil- α-L-
Iduronido.
4. Protocolo de diagnóstico enzimático: En un principio, y como método de
screening, se debe realizar la determinación en muestras de sangre seca
recogida sobre papel (DBS). En caso de positividad, la confirmación se suele
realizar en leucocitos totales.
La determinación intraleucocitaria es preferible a la realizada en fibroblastos por su
costo, la dificultad que presenta el transporte de la biopsia de piel hasta el laboratorio
de referencia y, sobre todo, por el tiempo que requiere el cultivo de los fibroblastos.
La confirmación de la actividad enzimática intraleucocitaria puede realizarse en un
periodo de 24 a 48 horas, mientras que en fibroblastos se requiere de 1 a 2 meses.
Los resultados deben expresarse en relación a la cantidad de proteína existente en la
muestra analizada, puesto que cada una de ellas tiene un número diferente de
leucocitos y, por tanto, la actividad resultante estará directamente relacionada con
ello.
La determinación en DBS se realiza mediante la técnica descrita por Chamoles NA y
cols. en 2001 con ligeras modificaciones, mientras que la determinación en leucocitos
se lleva a cabo según la metodología publicada por Tsvetkova I y cols. en 1991 con
algunas modificaciones.
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En ambos casos, se trata de técnicas sencillas y económicas cuyo resultado puede ser
indicativo del tipo de síndrome existente. En este sentido, la actividad enzimática
residual se encuentra cercana al 0 % en los pacientes con fenotipo Hurler y es del 5 al
10 % en los pacientes con el fenotipo Sheie, que es el más atenuado. En el caso de
pacientes Hurler-Sheie se obtienen actividades residuales que raramente superan el
5%.
En la actualidad, excepto en programas de cribado universal o poblacional, es más
utilizada la determinación espectrofluorimétrica en microplacas por su rapidez,
economía y no precisar el uso de aparatos costosos que requieren instalaciones
complejas.
Valores de normalidad: En DBS: 2,0 a 11,5 µmol/L/hora.

En leucocitos: 10 a 35 nmol/hora/mg proteína.
 Enfermedad de Fabry (OMIM 301500)
La enfermedad de Fabry es un complejo síndrome con afectación multiorgánica y

herencia ligada al cromosoma X, provocada por alteraciones en la degradación de los
glicoesfingolípidos, concretamente en el paso de Globotriaosilceramida (Gb3) a
Lactosilceramida. Esto origina la acumulación de Gb3 en diversos tejidos
fundamentalmente localizados en el endotelio vascular, corazón y riñón.
 Enzima responsable: α-galactosidasa ácida A (EC 3.2.1.22), glicoproteína
homodimérica de 398 aminoácidos con un peso molecular de 46 KDa.
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 Gen codificante (GLA): El gen que codifica la enzima se encuentra localizado en
el locus Xq22.1 y está formado por 7 exones.
 Prevalencia: Aunque no se conoce de forma exacta, oscila entre un varón
afecto cada 40.000 ó 100.000 nacidos, según las etnias. No obstante, en un
estudio reciente de cribado neonatal, se sugiere que la prevalencia puede ser
muy superior, llegando incluso hasta 1 cada 3.500 recién nacidos del sexo
masculino en determinadas áreas geográficas. Las mujeres portadoras suelen
tener pocos síntomas atribuibles a la enfermedad pero, en ocasiones, pueden
presentar una clínica florida debida a la inactivación aleatoria del cromosoma X
sano (efecto Lyon).
 Formas de presentación: Un único fenotipo, aunque con presentación en
diferentes etapas de la vida, preferentemente, a partir de la adolescencia. Han
sido descritas formas variantes (renal y cardíaca) en mujeres heterocigotas.
1. Tipo de muestra: Sangre seca en papel (DBS), leucocitos totales, plasma.
MS/MS).
3. Sustrato utilizado en la determinación enzimática: 4-metil-umbeliferil- α-
D-galactopyranósido.
4. Protocolo de diagnóstico enzimático: En un principio, y como método de
screening, se debe realizar la determinación en muestras de sangre seca
recogida sobre papel (DBS). En caso de positividad, la confirmación se suele
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realizar bien en leucocitos totales o bien en plasma.
La determinación intraleucocitaria tiene el inconveniente de que la actividad
enzimática es muy inestable, disminuyendo rápidamente. Por ello, las muestras deben
trasladarse debidamente refrigeradas a 4ºC hasta el laboratorio de referencia en un
periodo inferior a las 24 horas. Así, en la actualidad, se prefiere realizar la
determinación en plasma. La muestra se puede centrifugar tras su obtención y enviar
el plasma congelado al laboratorio. Análisis realizados “in situ” han demostrado la
perfecta correlación existente entre los niveles enzimáticos plasmáticos e
intraleucocitarios en la misma muestra.
Cuando se realice la determinación intraleucocitaria, los resultados deberán
expresarse en relación a la cantidad de proteína existente en la muestra analizada,
puesto que cada una de ellas tiene un número diferente de leucocitos y, por tanto, la
actividad resultante estará directamente relacionada con ello.
La determinación de esta actividad enzimática tiene el inconveniente de la existencia
de una isoforma de la α-galactosidasa A, la isoforma B, que puede interferir en la
cuantificación de dicha actividad. Por esto se requiere el empleo de un inhibidor de la
misma, N-acetil-D-galactosamina, que debe usarse siempre, independientemente del
tipo de muestra utilizado.
El análisis en DBS se realiza mediante la técnica descrita por Chamoles NA, Blanco M y
cols. en 2001 con ligeras modificaciones, mientras que la determinación en leucocitos
se lleva a cabo según la metodología publicada por Andrade J y cols. en 2008. No
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obstante, la técnica más usada en la actualidad para el diagnóstico confirmatorio se
realiza en plasma y fue descrita por Mayes JS y cols. en 1981, con pequeñas
modificaciones.
En todos los casos, se trata de técnicas sencillas, de fácil realización y con unos
coeficientes de variación tanto intra como interensayo perfectamente asumibles para
el diagnóstico clínico.
Un hecho importante a considerar es la existencia de valores en los límites inferiores
de la normalidad cuando se realiza la determinación en DBS, en el caso de mujeres
portadoras. En estas circunstancias, y con objeto de poder identificarlas, Lukacs Z y
cols. en 2005 recomiendan la determinación del cociente α-galactosidasa/β-
glucuronidasa que está disminuido en estas circunstancias.
En la actualidad, y excepto en los programas de cribado universal o poblacional en
pacientes con insuficiencia renal de etiología desconocida, es más utilizada la
determinación espectrofluorimétrica en microplacas por ser mucho más económica y
no precisar aparatos costosos que requieren instalaciones complejas.
Las determinaciones en plasma se suelen realizar siempre mediante
espectrofluorimetría en microplaca o en tubo.
Valores de normalidad: En DBS: 2,0 a 14 µmol/L/hora

En leucocitos: 40 a 115 nmoles/hora/ mg proteína
En plasma: 3,0 a 10 nmoles/L/hora
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 Enfermedad de Gaucher (OMIM 230800)
La enfermedad de Gaucher, la más prevalente de las enfermedades lisosomales, es

una enfermedad autosómica recesiva causada por la deficiencia enzimática
responsable de la degradación de glicoesfingolípidos. Como consecuencia, se
acumulan glucocerebrósidos en los lisosomas de los macrófagos, afectando a todos los
tejidos del organismo que contengan células de la estirpe monocito-macrófago. Así
pues, existe afectación visceral, hematológica, ósea y pulmonar fundamentalmente.
 Enzima responsable: β-glucosidasa o Glucocerebrosidasa (EC 3.2.1.45),
glicoproteína monomérica de 497 aminoácidos con un peso molecular de 55.5
KDa.
 Gen codificante (GBA): El gen que codifica la enzima se encuentra localizado en
el locus 1q21-31 y está formado por 11 exones.
 Prevalencia: Aunque es más prevalente en la población de judíos Ashkenazi
(1/400 a 2.500), presenta una incidencia media en el resto de la población de 1
cada 100.000 nacidos vivos.
 Formas de presentación: En la actualidad se conocen 3 formas de
presentación: Tipo 1 ó forma no neuronopática, Tipo 2 ó forma neuronopática
aguda y Tipo 3 ó neuronopática crónica. Es de una gran heterogeneidad tanto
en la presentación como en la evolución, especialmente en el Tipo 1.
1. Tipo de muestra: Sangre seca en papel (DBS), leucocitos totales o
fibroblastos.
18

MS/MS).
3. Sustrato utilizado en la determinación enzimática: 4-metil-umbeliferil- β-D-
glucopiranósido.
4. Protocolo de diagnóstico enzimático: Como método de screening se debe
realizar la determinación en muestras de sangre seca recogida sobre papel
(DBS). En caso de positividad, la confirmación se suele realizar en leucocitos
totales o fibroblastos.
La determinación intraleucocitaria es preferible a la realizada en fibroblastos por su
costo, la dificultad que presenta el transporte de la biopsia de piel hasta el laboratorio
de referencia y sobre todo por el tiempo que requiere el cultivo de los fibroblastos. La
confirmación de la actividad enzimática intraleucocitaria puede realizarse en un
periodo de 24 a 48 horas, mientras que en fibroblastos se requiere de 1 a 2 meses.
Los resultados deben expresarse en relación a la cantidad de proteína existente en la
muestra analizada, puesto que cada una de ellas tiene un número diferente de
leucocitos y, por tanto, la actividad resultante estará directamente relacionada con
ello.
La determinación de la actividad enzimática en DBS se realiza mediante la metodología
original descrita por Chamoles NA y cols. en 2002 y modificada por Civallero G en
2006, quien introdujo el uso del taurodeoxicolato sódico, previamente usado por
Peters SP en 1976, para incrementar la sensibilidad en el diagnóstico de pacientes
19

portadores de la enfermedad.
La determinación intraleucocitaria se lleva a cabo siguiendo el método de Michelin K y
cols. publicado en 2004.
En ambos casos, se trata de técnicas sencillas y de bajo costo que proporcionan
resultados aceptables para su uso en la práctica clínica. En la actualidad, y excepto en
programas de cribado universal o poblacional, es más utilizada la determinación
espectrofluorimétrica en microplacas por ser mucho más económica y no precisar
aparatos costosos que requieren instalaciones complejas.
Valores de normalidad: En DBS: 2,5 a 40 µmol/L/hora.

En leucocitos: 5,0 a 30 nmoles/hora/ mg proteína
 Monitorización de la enfermedad de Gaucher
Existen una serie de biomarcadores biológicos de gran interés en el seguimiento de los
pacientes con enfermedad de Gaucher. Entre ellos, el que muestra una mayor utilidad
es la quitotriosidasa (ChT), un análogo de las quitinasas de invertebrados cuya
existencia fue detectada en el plasma de este tipo de pacientes en la década de los 90
del siglo pasado (Boot RG y cols, 1995).
Esta actividad enzimática ha sido propuesta como marcador de acumulo de
macrófagos en diferentes enfermedades lisosomales, especialmente en la enfermedad
de Gaucher, en la que llega a alcanzar unos niveles de 100 a 1000 veces respecto a los
sujetos sanos. La ChT comienza a declinar tras el inicio del tratamiento enzimático
sustitutivo y, por tanto, es una herramienta de gran utilidad para los clínicos.
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Enzima: Quitotriosidasa (EC 3.2.1.14), una glicosilhidrolasa capaz de hidrolizar
glicopolímeros de β-(1-4)-N-acetilglucosamina. Existen 2 isoformas de la enzima, una
de ellas de 50 KDa que se localiza en los gránulos de los neutrófilos y es la principal
fuente de la actividad enzimática en el plasma, y otra de 39 KDa que es la isoforma
existente en los macrófagos. Esta segunda isoforma se origina tras un proceso de
proteólisis realizado en los lisosomas de este tipo de células mediante el que se
pierden los aminoácidos constitutivos del sitio de unión a la quitina. Ambas isoformas
presentan el mismo tipo de actividad.
 Gen codificante (CT): Se encuentra localizado en el locus 1q31-32 y consta de
12 exones.
 Polimorfismo del gen CT: En la especie humana existe un polimorfismo en el
gen codificante de la quitotriosidasa consistente en la duplicación de 24 pares
de bases en el exón 10. Esto da origen a un “splicing” alternativo con pérdida
de 29 aminoácidos (Val344 a Gln372), entre los que se encuentra el Trp
localizado en la posición 358, cuya presencia es fundamental para la actividad
enzimática. Este polimorfismo, con transmisión autosómica y dominancia
incompleta, se encuentra en aproximadamente el 6% de la población. En ellos
existe un déficit absoluto de actividad ChT y, por tanto, no es posible utilizar
este biomarcador como control de la enfermedad de Gaucher. En estas
circunstancias es la citoquina CCL18, producida asimismo por los macrófagos, el
biomarcador de elección utilizado (Boot RG y cols, 2004).
21

La prevalencia de portadores de este polimorfismo en la población general es del
orden del 35% con unos niveles de actividad enzimática prácticamente disminuida a la
mitad. En estos casos también deberá estar limitado el uso de la ChT, debiendo
emplearse asimismo los niveles plasmáticos de la citoquina CCL18.
 Determinación de la actividad enzimática.
1. Tipo de muestra: Sangre seca en papel (DBS), plasma.
2. Metodología: Espectrofluorimetría en microplaca o en tubo.
3. Sustrato utilizado en la determinación enzimática: 4-metil-umbeliferil- β-D-
N-N´-N´´triacetil-chitotriósido.
4. Protocolo de estudio enzimático: Aunque la determinación de la actividad
ChT puede realizarse en DBS mediante la metodología descrita por Civallero
G y cols. en 2006, los resultados no son plenamente satisfactorios. Por ello,
la técnica de elección, publicada por Hollak CE y cols. en 1994, se realiza en
el plasma de una muestra extraída en EDTA obtenido por centrifugación
inmediata y envío refrigerado o congelado al laboratorio de referencia. Si la
determinación no se va a realizar en las primeras 24 horas, el plasma se
deberá mantener congelado a -80ºC hasta el estudio analítico.
La determinación de la actividad ChT también puede realizarse en polimorfonucleares
o en leucocitos totales. No obstante, y debido a los valores tan altos existentes en
ambos tipos celulares en relación a los niveles plasmáticos, no es recomendable su
utilización, puesto que pueden pasar desapercibidos los portadores heterocigotos del
polimorfismo anteriormente descrito para el gen CT.
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La metodología es sencilla, de bajo coste y extraordinariamente sensible. Aunque las
muestras de los pacientes Gaucher han de ser diluídas debido a las altas actividades
enzimáticas existentes, la técnica presenta unos coeficientes de variación tanto intra
como interensayo asumibles por los laboratorios clínicos. Así, junto a otros
biomarcadores, como la citoquina CCL18 constituye la técnica “gold standard” para el
seguimiento de los pacientes Gaucher.
Valores de normalidad:
En DBS: 0,5 a 20 µmol/L/hora
En plasma: 4 a 76 nmol/ml/hora
 Enfermedad de Pompe (OMIM 232300)
La enfermedad de Pompe o glucogenosis tipo II fue la primera enfermedad lisosomal

descrita y reconocida como tal, además de ser la única glucogenosis que es también
una enfermedad lisosomal. Es una patología de transmisión autosómica recesiva
causada por una deficiencia enzimática en la degradación del glucógeno que se
acumula, por tanto, en los lisosomas de determinados tejidos (músculos esquelético,
cardíaco y liso). Ello conduce a una debilidad muscular generalizada, clínicamente
progresiva y debilitante, que desencadena una enfermedad multisistémica y, a
menudo, una muerte temprana.
 Enzima responsable: alfa-glucosidasa ácida (EC 3.2.1.20), glicoproteína
homohexamérica de 952 aminoácidos y con un peso molecular de 110 KDa en
su forma inmadura recién sintetizada. Existen 2 isoformas activas de la misma,
de 76 y 70 KDa según se produzca o no el último paso en el proceso de la
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maduración proteolítica. Este hecho no tiene especial trascendencia en la
actividad enzimática resultante. Ambas isoformas coexisten simultáneamente y
son las encargadas de la hidrólisis de los enlaces tanto  1-4 y  1-6 existentes
entre las moléculas de glucosa constitutivas de la estructura del glucógeno.
 Gen codificante (GAA): El gen que codifica la enzima se encuentra localizado en
el locus 17q25.q25-3 y está formado por 20 exones de los que sólo 19 son
codificantes.
 Prevalencia: Resulta bastante complejo hablar de la prevalencia de la
enfermedad de Pompe. Se ha estimado una incidencia combinada de 1 cada
40.000 nacidos vivos, aunque existen considerables variaciones entre
diferentes etnias o localizaciones geográficas, siendo más frecuente entre los
afroamericanos y en el sur de China. La forma infantil, de aparición precoz,
afecta globalmente a 1 de cada 138.000, mientras que la forma de inicio tardío
se cree afecta a 1 de cada 57.000. En los caucásicos, y según publicaciones
recientes, se estima una incidencia media global de 1 cada 100.000 nacidos
vivos.
 Formas de presentación: En la actualidad se ha establecido la existencia de 2
formas de presentación.
La forma infantil incluye a su vez a 2 fenotipos: a) “forma clásica”, con una rápida
evolución y muerte en el primer año de vida y b) “forma no-clásica”, con progresión
más lenta y una miocardiopatía menos severa.
La segunda forma de presentación es la de aparición tardía. Esta incluye: a) pacientes
en edad infantil o juvenil con un espectro heterogéneo de patologías musculares sin
24

inclusión de miocardiopatía y b) pacientes cuya patología aparece más tarde, entre la
2ª y 6ª década de la vida, caracterizados por una miopatía lentamente progresiva con
afectación fundamental del músculo esquelético.
1. Tipo de muestra: Sangre seca en papel (DBS), linfocitos, fibroblastos,
biopsia muscular.
MS/MS).
3. Sustrato utilizado en la determinación enzimática: 4-metil-umbeliferil-α-D-
glucopyranósido.
4. Protocolo de diagnóstico enzimático: Como método de screening se debe
realizar la determinación en muestras de sangre seca recogida sobre papel
(DBS). En caso de positividad, la confirmación se puede llevar tanto en
linfocitos aislados como en fibroblastos o en biopsia muscular.
El diagnóstico de confirmación, según ha recomendado el “Grupo Europeo para el
Diagnóstico y Seguimiento de la Enfermedad de Pompe”, se debe realizar en linfocitos
aislados. Las determinaciones en fibroblastos y/biopsia muscular retrasan el
diagnóstico, además de presentar una serie de inconvenientes tanto en el proceso
analítico como en el traslado de las muestras al laboratorio de referencia.
25

Así pues, para la confirmación diagnóstica tras un test positivo en DBS, se debe llevar a
cabo la determinación intralinfocitaria. La separación previa de este tipo de leucocitos
es debido a la existencia de otra alfa-glucosidasa ácida, la maltosa-glicoamilasa (MGA)
localizada en los neutrófilos, que interfiere en la determinación de la actividad alfa-
glucosidasa ácida. Por ello, y tras la separación de los linfocitos del resto de leucocitos
mediante centrifugación en gradiente de densidad, se procede a la determinación de
la actividad enzimática, expresándose los resultados en relación a la cantidad de
proteína existente en la muestra analizada.
La determinación de esta actividad enzimática en DBS se realiza mediante la
metodología original descrita por Chamoles NA y cols. en 2004 con ligeras
modificaciones, fundamentalmente dirigidas al proceso de elución de la muestra. Esta
determinación tiene el inconveniente de la interferencia de la actividad MGA existente
en los polimorfonucleares, imposibles de separar del resto de leucocitos existentes en
la muestra impregnada en papel.
Este problema se solventa mediante el empleo de un inhibidor específico de la MGA, la
Acarbosa, que se suele usar incluso en la determinación intralinfocitaria, dado que
durante el proceso de aislamiento linfocitario puede ser arrastrado algún
polimorfonuclear.
En la determinación analítica realizada en DBS se debe expresar tanto la actividad α-
glucosidasa ácida total como la actividad efectiva, debido a la eliminación de la
actividad enzimática resultante de la acción de la MGA.
26

La actividad α-glucosidasa ácida intralinfocitaria se realiza según la técnica descrita por
Lukacs Z y cols. en 2010, ligeramente modificada.
La determinación de la actividad α-glucosidasa ácida también puede realizarse
mediante HPLC con detección de espectrometría de masas en muestras de sangre seca
recogida sobre papel, pero presenta los mismos inconvenientes y soluciones descritas
con anterioridad.
Valores de normalidad.
En DBS: Actividad alfa-glucosidasa ácida total: 1,3 a 6,0 µmol/L/hora
Actividad alfa-glucosidasa ácida efectiva: 0,75 a 5,0 µmol/L/hora
En linfocitos: Actividad alfa-glucosidasa ácida total: 0,15 a 1,0 nmol/min/mg
proteín
27

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30

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EL

Jiménez J., Luis M. (*)

(*) Servicio Bioquímica Clínica. Hospital

EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES LISOSOMALES ......... 6

¿CÓMO SE LLEVAN A CABO LAS DETERMINACIONES

FUNDAMENTO DE LA DETERMINACIÓN .................................. 10

 Mucopolisacaridosis Tipo I. OMIM 607014 (IH)-607015(IHS)-607016 (IS) ..... 12

 Enfermedad de Fabry (OMIM 301500) ........................................................ 14

 Enfermedad de Pompe (OMIM 232300) ...................................................... 23

Jiménez Jiménez, Luís M.

referencias en torno al concepto de enfermedad rara. Sin embargo, no es hasta 1983,

tras la constitución en los Estados Unidos de Norteamérica de la National Organization

for Rare Disorders (NORD), cuando se acepta de forma oficial el término de

Enfermedad Rara (ER), haciendo referencia a enfermedades con baja prevalencia.

Posteriormente, en 1997, se constituye EURORDIS (European Organization for Rare

Disorders) como federación homóloga a la norteamericana y finalmente, en 1999,

poco a lo largo de estos años.

En la actualidad, las ER se pueden definir como “aquel conjunto de enfermedades que

se caracterizan por afectar, cada una de ellas, a un número reducido de individuos de

la población (prevalencia inferior a 5 por cada 10.000 habitantes), que tienen un

carácter crónico y discapacitante, disponen de una elevada tasa de morbimortalidad y

destaca un grupo de enfermedades, afortunadamente cada vez más conocidas y

Jiménez Jiménez, Luís M.

determinado que origina una alteración en la fisiología de los lisosomas, un orgánulo

subcelular de extraordinaria importancia para la vida de la célula. Los lisosomas son

orgánulos intracitoplasmáticos que contienen enzimas hidrolasas ácidas encargadas de

la degradación de macromoléculas (proteínas, carbohidratos complejos, lípidos,

reutilizados por la célula o bien eliminados al exterior. La ausencia o pérdida de

función de una de estas enzimas implicadas en el proceso degradativo origina la

acumulación dentro del lisosoma de productos metabólicos intermedios.

Las EDL representan un grupo heterogéneo de unas 50 enfermedades genéticas

lisosomales, para otras proteínas implicadas en la correcta biogénesis y/o el normal

funcionamiento de los lisosomas tales como coenzimas, proteínas de membrana,

proteínas de transporte, etc.

La etiología de este tipo de enfermedades tienen en común el progresivo acumulo de

productos no metabolizados que originan una disfunción celular y que,

posteriormente, se traduce en alteraciones histológicas en particular, y orgánicas, en

Por tanto, la secuencia de acontecimientos en este tipo de enfermedades (EDL) se

de una serie de manifestaciones clínicas resultantes del acumulo del material no

Jiménez Jiménez, Luís M.

consecuentes tanto de “deficiencias” como de “acúmulos”.

Aunque el orden en la secuencia fisiopatológica es probablemente el mismo en todas

clínicas distintas en función de la patología molecular responsable y de las células

afectas en cada una de ellas.

al material acumulado y, así, se pueden clasificar en: lipidosis, mucopolisacaridosis,

glucogenosis, glucoproteinosis, lipofucsinosis, mucolipidosis y otras.

El diagnóstico de este tipo de enfermedades es extraordinariamente difícil debido a la

variabilidad en la expresión clínica. La severidad y el alcance de cada una de ellas es, a

relativamente poco tiempo, el diagnóstico preciso no era sencillo, requiriéndose el uso

de técnicas invasivas y complejas. En la actualidad existen una serie de tests que

posibilitan el mismo mediante el uso de técnicas no invasivas o mínimamente

experimentado un considerable avance. Así, hemos pasado de realizar un tratamiento

Jiménez Jiménez, Luís M.

en la actualidad, sólo se dispone de este tipo de tratamiento para un grupo reducido

terapéuticas y la buena respuesta al tratamiento. Por tanto, resulta imprescindible un

diagnóstico precoz y una atención especializada de los pacientes afectos, la cual se

debe llevar a cabo en centros especializados debidamente capacitados para ello.

EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES LISOSOMALES

desde el punto de vista bioquímico-molecular a tres niveles diferentes, que deben

realizarse de modo secuencial:

1. El primer nivel consiste en determinar la presencia de determinados

compuestos, diferentes en cada una de las EDL, en distintas muestras

completarse mediante el empleo de otras técnicas que incluyen: