BIOETHANOL PRODUCTION FROM PINEAPPLE WASTES

1. Introduction

Pineapple wastes (PW) comprise fruit trimmings produced in large amounts by canning industries
through out the world. Nearly 75% of the fruit processed in canneries results in peeled skin, core, crown
end, etc., which is not utilized and generally discharged as a waste. The dry matter content in pineapple
waste is around 10%, and composed of about 96% organic and 4% inorganic matter These materials
exhibit both high biochemical oxygen demand (BOD) and chemical oxygen demand (COD) values and
give rise to serious pollution problems if not properly disposed of.

In the past, PW were utilized as sources for bromelin extraction, wine and vinegar production, yeast
cultivation for food/feed proteins, or also for organic acids production. The high sugar and
lignocellulosics amounts found in PW provide a potentially interesting source of valuable fermentation
and non-fermentation products.

Enzymatic hydrolysis is regarded today as the most promising approach to liberating fermentable sugars
in an energy-efficient way from the carbohydrates found in lignocellulosics in order to produce ethanol.
Sugars releasedby enzymes then can be fermented to ethanol by yeasts. In this study three different
processes were used to obtain bioethanol from PW: direct fermentation (DF) followed by enzyme
addition to verify the real yeast capacity of fermenting the untreated substrate; separate hydrolysis and
fermentation (SHF) in the same reactor; simultaneous saccharification and fermentation (SSF).

2. Materials and Methods

2.1 Substrate

Pineapples were obtained from a local market in Norwich, UK. For analytical purpose, the pineapple was
divided into four parts: crown (the top part), skin, pulp and core (the inner part). In this study only skin
and core were used for fermentation tests.

2.2 Yeasts

Saccharomyces cerevisiaeNCYC 2826. The strain was maintained on YM agar medium (yeast extract 3
g/L, malt extract 3 g/L, peptone 5 g/L, glucose 10 g/L) at 4 ºC. To carry-out the tests S. cerevisiaewas
grown overnight at 30 ºC on a rotary shaker at 200 rpm, in tubes containing 20 ml YM medium.

2.3 Experimental Set-up

Fermentation tests were carried out in a 2.5 L batch fermenter. The fermenter was equipped with one
four-bladed rushton turbine, and the common control systems: temperature, pH, CO2detector and gas
mass flow meter. Pineapple wastes, comprising fruit skin and core, were homogenized in a fruit blender.
The resulting homogenate, with a dry matter content of 14% (w/w), was diluted with water to a 9% dry
matter, in a working volume of 1.5 L and immediately treated at 100 ºC for 10 min under continuous
mixing to inactivate endogenous enzymes and reduce microbial spoilage. No further sterilization
procedure was adopted. Three different processes were used to obtain bioethanol. All fermentations were
carried out until no further CO2fluctuations were observed. pH was not controlled by the addition of
alkali during fermentation.

2.4 Chemicals

Chemicals were provided is galacturonic acid and glucose, glycerol, enzyme solutions Depol TM740 L
(ferulic acid esterase), and Accellerase®1500 (endoglucanase).

2.5 Alcohol-Insoluble Residues (AIR) Preparation

AIRs were prepared from pulp and residues prior to analysis for cell wall sugars. Wet fermented
pineapple waste samples, after defrosting, were homogenized for 1 min at max speed in a homogenizer at
room temperature.

2.6 Moisture Determination

The dry weights both of the fresh pineapple waste and fermentations samples, were calculated as steady
weights after 2 h at 110 °C

2.7 Sugar Determination

Sugars were released from AIR samples by Saeman hydrolysis by sample dispersion in 72% H2SO4for 3
h at room temperature followed by hydrolysis in 1 M H2SO4for 1 h at 100 ºC.

2.8 Ethanol Determination

Ethanol was quantified. 500 µl samples of supernatant from fermented pineapple waste were centrifuged
for 10 minutes at 500 rpm and 20 ºC in a 96 deep well, then filtered. Analyses with matching guard
columns operating at 65 °C with ultrapure water at a flow rate of 0.6 mL/min as mobile phase.

2.9 Calculations

Theoretical yield (TY) in this study was calculated as the max ethanol yield in relation to dry matter:
0.511 g alcohol per 1.0 g dry matter.

3. Results

3.1 Direct Fermentation of the Blended Biomass Followed by Enzymes Addition (DF)

Initially, ethanol production by S. cerevisiaeNCYC 2826 using untreated blended biomass, with a dry
matter content of 9.2%, was investigated by batch culture in DF mode as described in section 2.3. Table 1
shows the composition of waste fiber at the beginning of the fermentation, before enzyme addition and at
the end of the process. The main sugars in the soluble fraction were Glc and Man; only small amounts of
Gal A and Gal was detected. Sugars utilization by the yeast in the early phase of the culture was relatively
slow and ethanol production very low. The addition of cell-wall degrading enzymes to the substrate after
12 h caused a rapid sugars concentration decrease, followed by a corresponding increase in ethanol
production. This ethanol concentration remained steady until fermentation was completed. The pH of the
fermentation dropped down from 4.5 to 3.4 at the end of the process.

3.2 Separate Hydrolysis and Fermentation of the Blended Wastes (SHF)

The results show that the enzyme activity at the beginning of the process resulted in a decrease in the
insoluble fraction and a concomitant increase in the soluble sugars. Initial monosaccharide compositions
for the insoluble and soluble fractions were comparable.

3.3 Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF)

By this time, the yeast was fermenting well and after this point the soluble sugars dropped rapidly whilst
the alcohol began to increase up to a plateau of 4%. By 21 hours ethanol production, as well as substrate
utilization by the yeast, stopped as can be observed from the steady sugar and alcohol %.

4. Discussion

The significant amount of carbohydrate-rich materials disposed of in the pineapple canneries makes this
waste an interesting source for ethanol production. pineapple wastes are primarily composed of
celluloses, pectic substances and hemicelluloses. The presence of different polymeric substances in cell
walls justify the need of a pre-treatment on this waste. making these wastes an excellent raw material for
ethanol production by S. cerevisiaeNCYC 2826, as compared with previous studies on juice or rotten
pineapple.

The preliminary tests reported in this paper show the importance of the enzymatic pretreatment of
pineapple wastes to increase the sugar level of the mash for alcoholic fermentation. It should be pointed
out that SHF and SSF show the same trend, both on fiber saccharification and on sugars utilization by S.
cerevisiae. This means that the enzyme activity is not affected by the fermentation parameters used.
where enzymes and yeast were added together to the substrate at 30 ºC, pH 4.5 and 200 rpm. This
facilitates the set up of fermentation processes based on the simultaneous addition of yeast culture and
enzymes, to reduce both process time and total costs. In fact ethanol production in SSF started 3 hours
before it did in SHF. Hence, SSF is probably the most convenient and suitable fermentation mode used in
this study. Enzymatic release of significant quantities of xylose and arabinose points to the use of mixed
cultures and recombinant yeast, or in the development of robust strain that will simultaneously ferment
hexose and pentose sugars for ethanol production. This would be expected to improve the final ethanol
concentration and productivity, since a significant quantity ofpentose sugars were left unutilized in
hydrolysates fermented media.

All the fermentations carried out in this study were characterized by a dry matter loss of around 70%.
This means that 30% of substrate remained unutilized. This could be due to the pH decreasing during the
fermentation period. In fact pH values appear to be steady in the range 3.3-3.5. The significant pH drop is
probably caused by production of yeast catabolites and the release of D-galacturonic acid from pectin,
having a pKa value 3.51 . The observed pH decrease could lead to a diminution on enzymatic activity and
a consequent stop of fiber saccharification. Further tests, carried out with a strict pH control during the
process, could improve dry matter utilization and consequently ethanol production.
 BIOETANOL PRODUKSI DARI LIMBAH NANAS

1. Perkenalan

limbah nanas (PW) terdiri hiasan buah yang dihasilkan dalam jumlah besar oleh pengalengan industri di
seluruh dunia. Hampir 75% dari buah diproses dalam hasil pengalengan di kulit dikupas, inti, mahkota
akhir, dll, yang tidak dimanfaatkan dan umumnya dibuang sebagai limbah. Kandungan bahan kering
limbah nanas sekitar 10%, dan terdiri dari sekitar 96% organik dan 4% materi anorganik bahan ini
pameran baik kebutuhan oksigen biokimia tinggi (BOD) dan kebutuhan oksigen kimia (COD) nilai-nilai
dan menimbulkan masalah pencemaran yang serius jika tidak dibuang.

Di masa lalu, PW dipergunakan sebagai sumber untuk ekstraksi bromelin, anggur dan cuka produksi,
budidaya jamur untuk protein makanan / pakan, atau juga untuk produksi asam organik. Gula dan
lignocellulosics tinggi jumlah yang ditemukan di PW menyediakan sumber yang berpotensi menarik
berharga fermentasi dan non-fermentasi produk.

hidrolisis enzimatik dianggap hari ini sebagai pendekatan yang paling menjanjikan untuk membebaskan
gula difermentasi dengan cara hemat energi dari karbohidrat yang ditemukan dalam lignocellulosics untuk
menghasilkan etanol. Gula releasedby enzim maka dapat difermentasi menjadi etanol oleh ragi. Dalam
penelitian ini tiga proses yang berbeda yang digunakan untuk mendapatkan bioetanol dari PW: fermentasi
langsung (DF) diikuti dengan penambahan enzim untuk memverifikasi kapasitas ragi nyata fermentasi
substrat diobati; hidrolisis dan fermentasi (SHF) di reaktor yang sama terpisah; sakarifikasi simultan dan
fermentasi (SSF).

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1 Substrat

Nanas diperoleh dari pasar lokal di Norwich, UK. Untuk tujuan analitis, nanas dibagi menjadi empat
bagian: mahkota (bagian atas), kulit, pulp dan inti (bagian dalam). Dalam penelitian ini hanya kulit dan
inti yang digunakan untuk tes fermentasi.

2.2 Ragi

Saccharomyces cerevisiaeNCYC 2826. Ketegangan dipertahankan pada medium YM agar (ekstrak ragi 3
g / L, ekstrak malt 3 g / L, pepton 5 g / L, glukosa 10 g / L) pada 4 ºC. Untuk membawa-out tes S.
cerevisiaewas tumbuh semalam di 30 ºC pada rotary shaker pada 200 rpm, di tabung berisi media YM 20
ml.

2.3 Eksperimental Set-up

tes fermentasi dilakukan dalam fermentor batch yang 2,5 L. fermentor dilengkapi dengan satu turbin-
baling berbilah empat rushton, dan sistem kontrol yang umum: suhu, pH, CO2detector dan flow meter
massa gas. limbah nanas, yang terdiri dari kulit buah dan inti, yang homogen dalam blender buah.
homogenat yang dihasilkan, dengan kandungan bahan kering 14% (w / w), diencerkan dengan air ke
bahan kering 9%, dalam volume kerja 1,5 L dan segera dirawat di 100 º C selama 10 menit di bawah terus
menerus pencampuran untuk menonaktifkan enzim endogen dan mengurangi pembusukan mikroba.
Tidak ada prosedur sterilisasi lanjut diadopsi. Tiga proses yang berbeda yang digunakan untuk
mendapatkan bioetanol. Semua fermentasi dilakukan sampai tidak ada CO2fluctuations lanjut diamati. pH
tidak terkontrol dengan penambahan alkali selama fermentasi.

2.4 Chemicals

Kimia diberikan adalah asam galacturonic dan glukosa, gliserol, solusi enzim Depol TM740 L (esterase
ferulic acid), dan Accellerase®1500 (endoglukanase).

2,5 Alkohol-larut Residu (AIR) Persiapan

Mengudara dibuat dari pulp dan residu sebelum analisis untuk gula dinding sel. fermentasi sampel limbah
nanas basah, setelah pencairan, yang dihomogenisasi selama 1 menit pada kecepatan max dalam
homogenizer pada suhu kamar.

2.6 Moisture Penentuan

Bobot kering baik dari limbah nanas dan fermentasi sampel segar, dihitung sebagai bobot stabil setelah 2
jam pada 110 ° C

2.7 Sugar Penentuan

Gula dibebaskan dari sampel AIR oleh Saeman hidrolisis oleh dispersi sampel di 72% H2SO4for 3 jam
pada suhu kamar diikuti oleh hidrolisis dalam 1 M H2SO4for 1 jam pada 100 ºC.

Penentuan Etanol 2,8

Etanol diukur. 500 sampel ml supernatan dari limbah nanas fermentasi disentrifugasi selama 10 menit
pada 500 rpm dan 20 ºC dalam 96 sumur, kemudian disaring. Analisis dengan pencocokan kolom penjaga
beroperasi pada 65 ° C dengan air ultra murni dengan laju alir 0,6 mL / menit sebagai fase gerak.

2.9 Perhitungan

hasil teoritis (TY) dalam penelitian ini dihitung sebagai hasil etanol max dalam kaitannya dengan bahan
kering: 0,511 g alkohol per 1,0 g bahan kering.

3. Hasil

3.1 Direct Fermentasi dari Blended Biomassa Diikuti oleh Enzim Penambahan (DF)

Awalnya, produksi etanol oleh S. cerevisiaeNCYC 2826 menggunakan biomassa dicampur diobati,
dengan kandungan bahan kering 9,2%, diselidiki oleh budaya batch dalam modus DF seperti yang
dijelaskan dalam bagian 2.3. Tabel 1 menunjukkan komposisi limbah serat pada awal fermentasi, sebelum
penambahan enzim dan pada akhir proses. Gula utama dalam fraksi larut yang GLC dan Man; hanya
sejumlah kecil Gal A dan Gal terdeteksi. Gula pemanfaatan oleh ragi pada fase awal dari budaya itu
relatif lambat dan produksi etanol sangat rendah. Penambahan sel-dinding merendahkan enzim untuk
substrat setelah 12 jam menyebabkan penurunan konsentrasi gula yang cepat, diikuti oleh peningkatan
yang sesuai dalam produksi etanol. Konsentrasi etanol ini tetap stabil sampai fermentasi selesai. PH
fermentasi turun ke bawah 4,5-3,4 pada akhir proses.
3.2 Hidrolisis terpisah dan Fermentasi Limbah Blended (SHF)

Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas enzim pada awal proses mengakibatkan penurunan fraksi
tidak larut dan seiring bertambahnya gula larut. komposisi monosakarida awal untuk fraksi tidak larut dan
larut yang sebanding.

3.3 Simultan Sakarifikasi dan Fermentasi (SSF)

Pada saat ini, ragi itu fermentasi dengan baik dan setelah titik ini gula larut turun dengan cepat sementara
alkohol mulai meningkat hingga dataran tinggi 4%. Dengan 21 jam produksi etanol, serta pemanfaatan
substrat oleh ragi, berhenti seperti dapat diamati dari stabil gula dan alkohol%.

4. Diskusi

Jumlah yang signifikan dari bahan yang kaya karbohidrat dibuang di pabrik pengalengan nanas membuat
limbah ini merupakan sumber yang menarik untuk produksi etanol. limbah nanas terutama terdiri dari
selulosa, zat pectic dan hemiselulosa. Kehadiran zat polimer yang berbeda di dinding sel membenarkan
membutuhkan pra-perlakuan limbah ini. membuat limbah ini bahan baku yang sangat baik untuk produksi
etanol oleh S. cerevisiaeNCYC 2826, dibandingkan dengan studi sebelumnya pada jus atau nanas busuk.

Tes awal dilaporkan dalam makalah ini menunjukkan pentingnya pretreatment enzimatik limbah nanas
untuk meningkatkan tingkat gula mash untuk fermentasi alkohol. Perlu menunjukkan bahwa SHF dan
SSF menunjukkan tren yang sama, baik pada serat sakarifikasi dan gula pemanfaatan oleh S. cerevisiae.
Ini berarti bahwa aktivitas enzim tidak terpengaruh oleh parameter fermentasi yang digunakan. di mana
enzim dan ragi ditambahkan bersama-sama untuk substrat pada 30 ºC, pH 4,5 dan 200 rpm. Ini
memfasilitasi set up dari proses fermentasi berdasarkan penambahan simultan budaya ragi dan enzim,
untuk mengurangi baik waktu proses dan biaya total. Bahkan produksi etanol di SSF mulai 3 jam sebelum
melakukan di SHF. Oleh karena itu, SSF mungkin modus fermentasi yang paling nyaman dan cocok
digunakan dalam penelitian ini. rilis enzimatik jumlah yang signifikan dari xylose dan arabinose poin
untuk penggunaan kultur campuran dan ragi rekombinan, atau dalam pengembangan regangan yang kuat
yang secara bersamaan akan memfermentasi heksosa dan gula pentosa untuk produksi etanol. Ini akan
diharapkan untuk meningkatkan konsentrasi etanol final dan produktivitas, karena jumlah yang signifikan
ofpentose gula yang tersisa yang tidak digunakan dalam hidrolisat media yang difermentasi.

Semua fermentasi dilakukan dalam penelitian ini ditandai dengan hilangnya bahan kering sekitar 70%. Ini
berarti bahwa 30% dari substrat tetap yang tidak digunakan. Hal ini bisa disebabkan oleh pH menurun
selama periode fermentasi. Bahkan nilai pH tampak stabil di kisaran 3,3-3,5. Penurunan pH yang
signifikan mungkin disebabkan oleh produksi catabolites ragi dan pelepasan asam D-galacturonic dari
pektin, memiliki nilai pKa 3.51. Penurunan pH yang diamati dapat menyebabkan berkurangnya aktivitas
enzimatik dan berhenti akibat serat sakarifikasi. pemeriksaan lebih lanjut, dilakukan dengan kontrol pH
yang ketat selama proses tersebut, bisa meningkatkan pemanfaatan bahan kering dan produksi akibatnya
etanol.