Citometría de flujo.

Es una técnica de análisis celular multiparamétrico aplicando tecnología que permite

la medida simultánea de múltiples características físicas de una sola célula o partícula.

Citómetro de flujo.

Aparato que es capaz de medir componentes y propiedades celulares que fluyen e

n suspensión. Existen citómetros que poseen, además, la capacidad de separar partícu
las de forma selectivas, a partir de una suspensión líquida, denominados sorters.

Componentes principales.

El citómetro necesita un sistema combinado por:

1. El sistema óptico: que incluye la fuente de iluminación (que puede ser un láser o
una lámpara de arco voltaico), la señal de ruido, y los filtros necesarios para
discriminar la señal lumínica y llevarla al detector adecuado.

1.1. instrumentos basados en una fuente de iluminación laser: tienen los ejes de
iluminación perpendicular, detección y paso de muestra. Algunos citómetros
poseen dos o más láseres como fuentes de iluminación

Existe un detector para luz dispersada hacia adelante o dispersión frontal de la luz,
que es en función del tamaño celular. La cámara de flujo puede ser cerrada o abierta s
egún la lectura se realice en el seno de la cámara o una vez el líquido ha abandonado l
a misma, hay que tener en cuenta que las cámaras cerradas producen menos señal de
ruido que cuando la lectura es en aire.

2.2. Instrumentos basados en lámparas de arco como fuente de iluminación:

emplean una lámpara de mercurio o xenón con objetivos de alta apertura numérica
y epiluminación. En algunos casos pueden detectar la dispersión de luz frontal.

2.3. Ruido de fondo: se debe eliminar la luz que no sea la emitida o dispersada por
las células. Hay que tener en cuenta la llamada luz dispersada de Raman
(inelástica) por el agua que pasa de ser de 488 a 529/584 nm y no se puede
eliminar por filtros. Para suprimir la luminiscencia de ruido se utiliza un pinhole.

2.4. Filtros: se usan para eliminar y separar la luz recogida. Debe tener alta
transmitancia dentro de su banda de paso, banda de paso limitada y estrecha,
baja autofluorescencia, buena estabilidad y resistencia a la luz. Hay de dos tipos:

Coloreados o de absorción: se usan como filtros de paso largo, absorben la

luz.
De interferencia o dicroicos: reflejan la luz que tiene una longitud de onda
superior o inferior a la que dejan pasar. No absorben la luz, solo la reflejan
.
2. Fuentes de luz: existen dos láseres sintonizables o de emisión fija. Pueden ser
refrigerados por agua o por aire (menor potencia). Lo más empleados son lo de
Argón o Kriptón. Actual. También se pueden usar lámparas de arco de mercurio o
xenón, pero su emisión decrece con el tiempo y son menos estables. Las ventajas
 más importantes de los citómetros con láser frente a los de lámpara son: menor
rendimiento para isoticianato de fluoresceína, posibilidad de iluminación con dos o
más láseres, y posibilidad de sorter celular.

3. Detectores: existen dos tipos de detectores de la luz: los fotomultiplicadores y los

fotodetectores diodos o de estado sólido.

4. Cámaras de flujo: son muy diferentes según sea la fuente de iluminación del
aparato.

4.2. Citómetro con fuente de iluminación láser: se basan en la cámara de flujo

descrita por Crosland- Taylor (enfoque hidrodinámico). Hay dos tipos: las
cerradas y las abiertas. Las cámaras cerradas consiguen flujos laminares con
velocidades de flujos inferiores y producen menos ruidos lumínicos, en cambio
no permiten una fácil eliminación de coágulos o suciedad.

2.2. Citómetros con fuente de iluminación de arco: hay varios sistemas, ya sean
abiertos o cerrados. Generalmente los sistemas son más complejos que los de
los citómetros basados en la iluminación tipo láser.

5. Sistema de inyección de la muestra: es muy importante que la velocidad sea

constante (la velocidad óptima depende de la aplicación). Hay dos sistemas: Por
presión y por inyección isovolumétrica por jeringa (permite velocidades inferiores
de flujo y contar las células).

6. Componente electrónico: los pulsos detectados por los fotodetectores pasan a

un amplificador y después son convertidos de señal analógica a digital (ADC). Se
pueden efectuar amplificaciones lineales a 256 canales (8bits), 1024 canales
(10bits) o bien logarítmicas. Después del procesamiento informático de la señal se
obtiene histogramas mono o biparamétricos.

Marcadores fluorescentes de unión covalente:

Se utilizan para marcaje de proteínas, lípidos o bien otras moléculas biológic
as. El más empleado es el isotocianato de fluoresceína (FITC). Otros que se
han descrito son: rodamina, rojo Texas, cianinas y ficoeritrinas. Este último
se utiliza mucho porque, tras ser excitado a 488 nm emite más allá del espec
tro de la fluorescencia, permitiendo el doble análisis con un solo laser.

Marcadores fluorescentes de unión no covalente:

Marcadores del contenido en ADN y ARN: Hoechst, DAPI, DIPI,
cromomicina A3, nitramicina, naranja de acribina, y otros de uso
común es el yoduro de propidio.
Marcadores de potencial de membrana: cianinas y RH123. También
se utilizan para marcaje de mitocondrias, dado la alta diferencia de
potencial de su membrana.
Otros fluorocromos: fluorocromos que se utilizan para estudiar la
actividad de bomba de membranas, receptores ceulares o actividad
 encimatica. Se emplean sustancias fluorescentes que se acumulan
en el interior celular o que cambia su capacidad fluorescente o
espectro de emisión/excitación por acción sobre ellas de unas
proteínas que las expulsan o introducen en las células o que ejercen
sobre ella una acción enzimática.
Proceso:
La realización de la citometría de flujo consta de las siguientes fases:
 Fase pre- citometría: preparación de los reactivos, de las células, diseño
del protocolo y coloración de las células con los reactivos fluorescentes.
 Fase de citometría de flujo: involucra el procesamiento de las células
marcadas y la recolección de los datos para una de las medidas
(parámetros) realizados en cada célula individual.
 Fase de análisis: análisis de los datos recolectados
La suspensión celular es preparada previamente con anticuerpos monoclonale
s conjugados con diferente fluorocromos y es introducida en el sistema hidráulic
o de manera que las células atraviesan individualmente la cámara de flujo, dond
e las del láser interceptan la célula.
El contacto del haz del láser con una célula produce dos tipos diferentes de
dispersión: frontal y lateral (90°). La dispersión frontal da información acerca del
tamaño celular mientras que la lateral informa de la complejidad celular.
Los anticuerpos monoclonales adheridos a la superficie celular son a la vez
excitados por la luz del láser y generan fluorescencias que son recogidas por fo
tomultiplicadores (hasta 4 fluorescencias actualmente) que transforman la señal
óptica en eléctrica, enviándose toda la información al sistema informático para s
u análisis en las presentaciones de histogramas o “dot-plots”.

Aplicaciones:

Hematología: tipificación y conteo de células, conteo de reticulocitos,

análisis de medula ósea y formula leucocitaria.
Farmacología: estudios de cinética celular.
Inmunología: subpoblaciones de linfocitos, estimulación linfocitaria, tipaje
tisular, apoptosis y fagocitosis.
Oncología: diagnóstico y pronóstico, monitoreo de tratamientos.
Microbiología: diagnostico bacteriano y vírico, estudios de sensibilidad a
los antibióticos.