UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Departamento de Ingeniería Química

Laboratorio Diseño de Bio-Reactores

LABORATORIO 1: Determinación de Actividad Enzimática Específica

(Enzima Libre) y de Contenido de Proteínas

I. Introducción
La mayoría de las enzimas son proteínas especializadas en la catálisis de
reacciones biológicas. Sus principales características son su gran poder catalítico
y alta especificidad. La catálisis tiene lugar en un centro específico de la enzima
llamado sitio activo. La producción de enzimas es seguida por una purificación
y una estandarización del producto. En la formulación del producto se agregan
diversos excipientes (otras proteínas y azúcares, por ejemplo), por lo que un
preparado enzimático comercial no es 100% puro.
La reacción más simple que pueden catalizar las enzimas está representada por
la ecuación:

Donde E, S y P, representan a la Enzima, Sustrato y Producto, respectivamente.

ES y EP representan a los complejos transitorios Enzima-Sustrato y Enzima-
Producto.
En este práctico trabajaremos con lactasa, la cual es la enzima encargada de
convertir la lactosa en glucosa y galactosa.
Los objetivos son la determinación de la actividad específica enzimática de
lactasa y del contenido de proteínas de una formulación comercial de lactasa a
partir de Aspergillus Oryzae.
En este ensayo se utilizará lactosa como sustrato, y se monitoreará la
concentración de glucosa en el tiempo mediante el método de glucostat.
Para la determinación de proteínas, se utilizará el método de Bradford, por ser
una técnica sencilla, rápida y que presenta menor interferencias que otros
métodos de análisis.
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II. Determinación de Actividad Enzimática Específica

Con respecto a la determinación de la actividad de la enzima, debemos recordar

que la actividad enzimática:
 Indica el máximo potencial catalítico de una enzima y está dado por la
velocidad inicial de la reacción.
 La velocidad de reacción se mide cuantificando la evolución del
producto o del sustrato de reacción en el tiempo, pero este último es más
dificultoso ya que se utiliza en exceso y las variaciones en corto tiempo
no son notorias.
 Se determina en las mejores condiciones para la enzima (T y pH óptimo)
y a concentraciones saturantes de sustrato.
 La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de
enzima que permite catalizar 1 mol de sustrato por minuto de reacción
a las condiciones antes mencionadas.
 La medición de actividad se ve afectada por los siguientes factores:
o Denaturación de la enzima (por temperatura)
o Reversibilidad de la reacción enzimática.
o Inhibición de la enzima (por producto o inhibidor externo)
o Desaturación de la enzima (baja concentración de sustrato)
Para evitar los tres primeros factores, la medición se realiza a tiempos cortos;
el último factor se evita al utilizar una concentración saturante de sustrato.
Al evitar tales problemas la velocidad de reacción sólo está condicionada por
la cantidad de enzima utilizada en la reacción.

III. Procedimiento Experimental

a. Determinación de la actividad de lactasa de Aspergillus oryzae.

 Adicionar en tubos de ensayo 1,8 mL de lactosa.
 Pre-Incubar durante aproximadamente 3 minutos a 30ºC, para llevar el
sustrato a la temperatura óptima de reacción de la enzima.
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 Adicionar 0,2 mL de la solución de lactasa previamente diluida.

 Incubar durante el tiempo de reacción seleccionado (0, 2, 5, 10, 15
minutos).
 Detener la reacción mediante ebullición durante 5 minutos.
 Determinar el contenido de glucosa en la muestra mediante el método de
glucostat.

b. La determinación de glucosa se realiza según un Kit enzimático:

 A 0,01 mL de muestra (solución inactivada) agregar 1 mL del reactivo
(en oscuridad).
 Incubar a 37ºC por 10 minutos (para realizar la reacción).
 Leer el valor de la absorbancia a 505 nm, contra un blanco de agua
destilada y reactivo.
 Medición del estándar (estándar y reactivo)

Notas:
*Se utilizarán diferentes concentraciones de enzima para medir la actividad de
ésta.
*Las experiencias deben ser realizadas por duplicado.
*La solución enzimática debe ser realizada en buffer acetato pH 4.5 0.1 M de
manera de mantener la actividad de la enzima.

c. Determinación de la concentración de proteínas

El alumno deberá realizar la dilución correspondiente a partir de una
solución patrón de lactasa (100 mg/L) y determinar su contenido en
proteínas según el protocolo que se indica a continuación:
 A 0,1 mL de muestra agregar 1 mL de reactivo Bradford (entregado por
el ayudante).
 Agitar suavemente para homogeneizar la solución y permitir la reacción.
 Esperar por aproximadamente 15 minutos (no más de una hora).
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 Leer en espectrofotómetro a una longitud de onda de 595 nm contra un

blanco de agua destilada y reactivo.
 Interpolar el valor obtenido en la curva de calibración (entregada por el
ayudante).
Nota:
*Las diluciones en este caso se pueden realizar con agua destilada.

IV. Resultados Fundamentales a entregar en el informe

1. Cada grupo deberá recolectar los resultados obtenidos en las experiencias

hechas por los distintos grupos. Con estos resultados se deberá hacer el informe
del práctico de laboratorio. Deberán obtener de cada grupo la evolución de la
concentración de producto (glucosa) en el tiempo, para la concentración
específica de enzima usada en cada grupo.
2. Con estos resultados se deberán construir 2 gráficas. La primera de ellas
debe mostrar la evolución de la concentración de producto (µmoles/L) en el
tiempo (min) para cada una de las concentraciones de enzima. La segunda
gráfica debe mostrar la evolución de la velocidad inicial de reacción
(µmoles/L.min) en función de las concentraciones de enzima (mg prot/L)
usadas.
3. Se deberá entregar el valor de la actividad enzimática específica del
preparado enzimático original, expresada en UI/mg enzima (proteína).
4. Finalmente se deberá comparar el valor teórico de cantidad de proteína de la
enzima con la experimental.
IMPORTANTE: La concentración de enzima que se usó es de preparado
enzimático y NO de enzima. Para obtener la concentración de enzima considere
que el preparado enzimático contiene un 30% en peso de enzima (el 70%
restante son excipientes azúcares, estabilizantes y otros) por un lado, y por otro
considerar el valor calculado mediante el Método de Bradford.