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  • Capitulo 8 e 9 - Genetica - Junqueira

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    8 | Nudleo da Célula Acexisténcia do niicleo é a principal caracteristica que dis- tingue a célula eucarionte da procarionte. A maior parte da informagio genética da célula esta contida no DNA do niicleo, havendo apenas uma pequena porgio fora dele, nas mitocon- drias ¢ cloroplastos. Além disso, 0 niicleo controla 0 metabo- lismo celular pela transcri¢ao do DNA nos diferentes tipos de RNA, que sio traduzidos em proteinas, os efetores finais da informagao ge ‘O ciclo de vida da célula é dividido em duas fases principais: a mitose € a intérfase. Na mitose ocorre a divisio da célula, enquanto o periodo entre duas divisdes constitui a intérfase. Assim, de acordo com a fase em que a célula se encontra, dis- tinguem-se 0 niicleo interfasico (Figura 8.1) e o niicleo mité- tico, Neste capitulo, serdo abordados os aspectos estruturais © funcionais do niicleo interfésico, enquanto o nticleo mitético sera assunto do Capitulo 9, ‘A maioria das células apresenta um tinico nticleo, apesar de existirem células com dois ou mais niicleos. Sio exem- plos algumas células hepaticas que sio binucleadas e a fibra ‘muscular estriada esquelética, que contém varias dezenas de niicleos. niicleo, geralmente, localiza-se no centro da célula, No entanto, em células que armazenam material a ser secre- tado, como as células acinosas do pancreas ¢ as caliciformes do intestino, 0 niicleo tem posicio basal. Por outro lado, as células vegetais apresentam muicleo periférico em razio do {grande vactiolo citoplasmatico, Estudos recentes mostram que niicleo ocupa uma posigao fixa no citoplasma gragas & sua associagao com componentes do citoesqueleto,tais como fila~ Lamina nuclear nuclear Ribosomes Fgure®. = Esquema doncleointrfsico, O envoltrio nuclear éconsttido por dus membranas, que delimtam oespago perinucear Em algumasregioes, a duas membranes se funder, formando 0s patos, que sd preenchidos pelos complexos e por. 0 envalténio nuclear tem comtinuidade com o reticulo endoplasmatco, € s membrana nuclear externa apresentatbossomos igados 3 sua face itoplasms 1a. Grumar de cromatinacondensada (Cc) esto ass0Ciados ao envotrio nuclear, enquantoporgoes de cromatina descondensada (CA) esto dspesas no nice. No el arcs apres ns aes ber cone mentos de actina e filamentos intermedisrios (assuinto disct tido no Capitulo 7 Jeralmente, o formato do micleo acompanha o da cétula. As células prismiticas tém miicleos alongados, enquanto as células poligonais ou esféricas apresentam niicleos esféricos Ha também muitos niicleos com forma irregular (Figura 8.2). Geralmente & dificil perceber a0 microscépio de luz forma das células animais; assim, © formato do niicleo & u para inferir a forma da célula. AlteragGes no formato da célula causam alteragdes no do miicleo, uma ver que este associa-se a filamentos de actina que, por sta vez, ligam-se a proteinas da ‘membrana plasmitica ‘© tamanho do nticleo pode variar de acordo com © meta- bolismo e com 0 conteiido em DNA da célula, Células com ‘metabolismo intenso apresentam niicleos volumosos. Métodos bioquimicos permitiram detectar, nesses mticleos, maior quan: tidade de proteinas relacionadas com a transcrigao do DNA, ‘A quantidade de DNA também é fator determinante do tama- tho do niicleo, Em geral, os niicleos das células dos urodelos apresentam alto contetido de DNA e estio entre os maiores {que se conhecem nos vertebrados; os micleos das aves, por sua vvez, com baixo contetido de DNA, sao, em geral, pequenos. © micleo interfisico é composto por envolt6rio nuclear cromatina, nucléolos e nucleoplasma (Figura 8.1), = Oenvoltério nuclear protege o material genético O envoltério nuclear separa 0 micleo do citoplasma, sendo responsivel pela manutengio do niicleo como um compar: timento distinto ¢ permitindo que a célula controle 0 acesso a0 seu material genético. Ble € visivel apenas a0 microscépio cletrOnico, pois a espessura de suas membranas esta abaixo do poder de resolugao do microscépio de luz. © envolt6rio nuclear & constituido por duas unidades de ‘membrana concéntricas, que limitam uma cavidade interna, espago perinuclear, que tem espessura de 30 a 50 nm Juras 8.1 € 8.3) e contém proteinas soliiveis. A face nucleo- plasmatica da membrana interna associa-se uma rede de fila- ‘mentos que constitui a lamina nuclear. A membrana externa ‘contém ribossomos aderidos & sua superficie citoplasmatica e apresenta continuidade com o reticulo endoplasmitico rugoso (Figuras 8.1 e 8.3), razio pela qual é considerada uma porgao especializada do reticulo. ‘As membranas do envoltorio sto lipoproteicas, contendo em torno de 30% de lipidios e 70% de proteinas, dentre as quais algumas sio glicoproteinas. Cerca de 90% dos lipidios sio fosfolipidios e 05 10% restantes sio trigliceridios, coles- terol e ésteres de colesterol. A maioria das proteinas da mem brana externa é comum as membranas do reticulo. Algumas, 1o entanto, sio especificas, tais como aquelas da familia das hesprinas, que interagem com componentes do citoesqueleto € sdo responsaveis pela ancoragem e pelo posicionamento do niicleo na célula, A membrana interna apresenta uma compo- sigio prépria de protefnas intrinsecas e periféricas, virias delas ja caracterizadas, Algumas estabelecem ligagdes com protei- Ga i tromicrografia de medula éssea na qual se observam células com niicleos de formas irregulares. 1.nticleo em forma de; 2. em forma: ‘iicleo alongado; 5, nticleos com cromatina descondensada; 6. nticleos com cromatina condensada, 4.000x. Figura 84 » Reresertagioesquerstc de evohire mace que Mose reece: ds amas Com 2 TERENAS PERSE Se MEDEA ST cscompinos de poe As mines asocadas & poten: errant fs Win (ue crttoen 3c oe DU Se MONEE SESE SMT 3 STS NCE fea as laminas do nuceoplama fae pare de mae nie. Hors Covance stor to EWORSTS uC DO Mee Se WS SSMS ET ‘Se corns ra membrana itera pla rte gp210¢POMIZ AS peter arsmenerees LP LAPD Sar NE ESET BE oA DEM trast 8 Redo too muipase Aneiprne ¢ one sroters ungen resets MeneraseceTe a interacéo da membrana interna a lamina nuclear ¢ cro- matina. Séo proteinas intrinsecas a emerina, 0 ‘lamentos da lamina (LBR — do inglés lamina 8 receptor), 2s, LAPI e 2 (do inglés lamina-associated polypeptides), 2 MANY ¢2sSun] 2 (Figura 84). ‘As proteinas dessas membranas sfo sintetizadas pelos poliribossomos aderidos @ membrana externa do envoltério, ou seja, em continuidade com o RER. Elas séo inseridas na bicamada lipidicae se difundem no plano da membrana, loca- lizando-se na membrana interna, na qual sto mantidas grecas a sua associagéo com a lamina nuclear e/ou com a cromatina. = Oenvoltdrio nuclear é perfurado pelos complexos de poros O envoltério nuclear nio é continuo como as demais mem- branas biolégicas. Em alguns pontos, a membrana externa fun- de-se com a interna, formando os poros nucleares (Figuras $4 85), Esses poros séo parcialmente preenchidos por agrege- dos proteicos, os complexos de poro, que permitem ¢ regulam © trinsito de macromoléculas entre 0 micleo ¢ o citoplasma (Figuras 8.4 e 8.6). Os poros so uniformemente espacados, sua quantidade por unidade de area do envoltério varia om o tipo de célula e com seu estagio funcional (Figura 83). (Calulas com alta atividade de sintese proteica, como as célu- Anilises detaladss, que indioem esmados 29 micesopio eminico, tomegrafa cbraesrumaral, proeeieaica € MDS posicio octagonal desces dois andis leva 20 estabelecimnent® © complen de poro é ancorado na Becamads Epica, nos [Pontos em qoe as membrana esto fundies por dois Sous de [Proteinas intrinsecas, 2 POMI2I (do ingiés rore memeirame) ¢ 8. gp210 (do inglés copreeein) (Figura 84). Estima-se que os complenss de poro seam coasting sais de 100 moléculas proteicas coletivamente dencminads nadeoporinas (Nep). Cada compleno coasém cerca de 30 tips diferentes de madeoporinas 2 maioria dels i caracte- As Nap tim localizagies especificas no complena. alge ‘mas sdo simetricamente distribuidas outras reskdem exces vamente na face ctoplasminica, outras na nocieoplasmatica € outras, ainda, exabelecem o penmetro do canal central (Figura 87). Duas cases de Nup foram identiicadas (1) as que apresentam sequéncias dos aminoacsies fendilanins ¢ que mostra o grande ntimero de poros nucleares. 2000s cin obtido pelo metodo de criofratura, Figura 8.5 + Envoltorionuciear da ameba Entamoeba histolytica, de A. Martinez-Palomo) igura 8.6 + Eetromirografiade corte cbliqu de alata nude de cll eral nba ot to, en Fraeracleates Em alguns pos evs uma esta elton ens, um aan ey nel Gots) ora ae seinenepe nase coespone ) ui 0$ complexos de poro. 45.000 a 7 te 2] 4 ) R68 2 sore seine rstegans coe pode po 800 § | ideo da Cla ‘Soa ot Sonam inn (FG) que a opetem es ntrcalam entre seu {E iinodcos polares de omprimentonvaradon' eo ‘vbvidas no transporte entre o mile eo cola, (2) das ue apreentam dominios FG e fre parte da arora dos complexos de oro. As sequin das Nop eam expt nos Slaments mclaren, to perimetro do canal ental no qual las partiipa “Etanspoe de malic ‘Os cmplexos de poro tém vm dismetr externo de 120 ameum peso molecular de 125 MDa (meat = 10 tos) O canal ental, por sua ver tem um dimetro de 25 8 Slam. A daposgto dow Glamenton das Nop no interior do ‘al central fecha parcialmente a abertura do complexo de Povo gura 82) ‘0 trinsto de molécuas através dos complexos de poro de acrrer tanto por transporte pasivo quanto por av ‘ga one pequenas moléculas de aé 9 nn de'cameto ausewam rapudamente 0 complexo de poro nos dois sen tuo Hs se difendem passivamente pelo canal central. A nora das proteinase KNA, no entant, so grands demas pus we difundiemn por esses cana. Essas macromolculs §avesam os complexos de poro por um proceso que con sone energa, em gue tanto ax peteinas quanta os BNA sio ‘eeecidoe © tansportados Seetivamente. Normalmente, «nice importa do eitoplasma protelnas de peso molecular kad como a polimerases do DNA (100.000 dalton) edo A (2nn.000 dons). As proteins propias do nico sio Sinead no citoplasma com sais de localiza ‘eco sem ern uma ou das sequenciascurta de amino ‘ids, ras em lisina e arginina. As proteins marcadas para svi nuclear atravesam os complexos de poro por um Mecanismo que cansome energia forneckla pelo GR. Os Sous de estinagto muclear so reconhecdos pelos recep rs de importa que #40 proteinas citplastics da foo pera iy semmethante§imponag RNA, 1RNA e FA, hex ‘dees completon BNP estin preventer na protcinas AG Intadeccreceado um Upo de espetina ur seliadretament sl, As mahiculas de mRNA, po tutto complxadas com crea de 20 precinas evan poten 20 om deve conte um wf que@reconhecio © liyado uma exportina, formando o complexo de exportacio. Durante o proceso de heck plas sequéncis FG presents nas Np que const tum os filamentos nucleate o canal central do complex de poro ¢aluam como tls no tataporte do complex exporting mitNA para ctoplsma. Uma ver no cops, ‘exportinaibera ua carga retoena Feuliznda em ou idle, onde pode ser a proceso de exportag, Como er visto ‘mal adit, trem ov rNA sb exportads do nico ma forma de particuas complexads com protelnas, ou se}, m8 forma de subunits bossimicas, = ARan controlao sentido da translocagéo de moléculas pelos poros | directo do transporte de moléculas entre oacleo € © ‘plasma € egulada pela Kan (do ingles As-related nuclear [role uma proteina de baixo peso molecular perencemte ‘familia das enzimas que quebram GP ou GTPases, Or receptors de importagio nicleae(importinas) «de expor {agio (exportinas) contam com dois dominiots um que se Tat Ran e outro que se liga molécula ss transportada (figura). 4 an hdeolisao GT, fornecend energa para a translocagio das molécults por meio dos completes de Importina Citoplasma @ & Figura 8.8 » Representacdes esquemiticas do transporte de molécula Molécula a ser exportada ‘dos complexos de poro.A esquerda, esta representado 0 processo de import lizagao nuclear SLN) que é reconhecido pela importina ese liga acl, léculas pelo nicleo. Nesse processo, a moléculaa ser importada contém um sina de loca importina-molécula importa ia se 3s sequencas FG das Nup (1), que Tuncionam coms tilhos efazem a transtocagio do complexo através do canal en, (23). No interior do ceo (4, a RanGTP ligase 8 mportna,fazendo com que ealibere a molécula importada no nucleoplasma. A dirt, o proceso dey se inicia quando a molécula a ser exportada, contendo um sinal de exportacdo nuclear (SEN), ¢ reconhecida pela exportina, liga-se a ela © & RanGTP (1). Ee reconhecido pelas sequéncias FG das Nup (2) ¢ translocado através do canal central do poro (3). J4 no citoplasma, a Ran, ativada pela RanGAP, hidrolisa o Grp a configuracao RanGDP. A molécula exportada poro, A Ran pode adotar dois estados conformacionais dife rentes, dependendo da sua ligagao & molécula de GTP ou de GDP, sendo a RanGTP concentrada no miicleo e a RanGDP, no citoplasma O processo de importagao inicia-se no citoplasma, quando a proteina que contém o sinal de importagio nuclear liga-se & 6 mportina atravessa 0 com importina. O complexo proteina. plexo de poro, como visto anteriormente, e, entio, no nucleo, a RanGTP liga-se & importina, promovendo uma alteragio conformacional no sitio de ligagao da importina e causando a liberagao da proteina no nucleoplasma, O complexo impor- tina-RanGTP retorna ao citoplasma, no qual outra proteina, chamada GAP (do inglés G'TPase-activating protein) ou pro teina ativadora de GTPase, induz a atividade hidrolitica da Ran, que quebra o GTP, adotando a configuragio RanGDP e liberando a importina no hialoplasma. Na exportacao, que se inicia no nucleo, a exportina liga-se, ao mesmo tempo, a proteina que contém 0 sinal de exportagio nuclear e 4 RanGTP (Figura 8.8). Esse complexo ¢ translocado através do complexo de poro, e, uma vez no citoplasma, a Ran, ativada pela GAP, hidrolisa 0 GTP, assumindo a configuragio RanGDP, liberando a proteina e a exportina no citoplasma, A exportina retorna ao nticleo, no qual iré participar de um novo processo de exportagao, a exportina si liberadas no citoplasma (4) = Alamina nuclear confere forma e estabilidade ao envoltdrio nuclear Associada 4 superficie interna do envoltério nu a lamina nuclear, uma rede proteica com i encontra nm de espessura (Figuras 8.1 € 8.4), que se interronpe poros nucleares. A Lamina é constituida pelas proteins nas que pertencem a uma classe de filamentos interme nucleares. Nos vertebrados, ha trés genes que couifca tipos de laminas: duas do tipo A (A e AA10) (A delta); duas do tipo C (C e C2) e trés do tipo B (BI, 2¢ As laminas dos tipos A e C sio codificadas por um tno cujo RNA sofre diferentes modos de processamento |p alternativo), originando as quatro laminas. Os trés ti laminas B, por sua vez, sio codificados por dois gens que um deles, também por processamento diferencial.” as laminas BI e B2. ‘Todas as células de vertebrados exp" enquanto as laminas pelo menos uma lamina do tipo B, A eC sao expressas em células diferenciadas, Sugett laminas apresentem fungdes célula € tecido-especiliis Cada molécula de lamina é um dimero de subi! Proteicas que se associam através das porgdes em \ cada cadeia polipeptidica e tem duas porgdes nie li has extremidades de cada cadeia. As extremidades > 8 | Nicleo da Célula coils, carboxi e aminoterminal, variam entre os diferentes, tipos de laminas ¢ estabelecem associagdes cabega-cauida for mando os protofilamentos. Os protofilamentos, por sua ver mse lateralmente, formando filamentos muito pareci dos com 0s filamentos intermedisrios do citoesqueleto, raze. pela qual sio classficados com tal ‘As laminas associam-se ao envoltérlo nuclear por meio de proteinas intrinsecas & membrana nuclear interna, tais como is LAP 12, emerina e a LBR (Figura 8.4). Blas se associam também aos complexos de poro, provavelmente por n rveleoporinas Durante @ mitose, a fosforilagio tempordria das lami causa a desorganizagao da Kamina nuclear. Ao final da mitose, as laminas sto desfosforiladas e se associam novamente para refazer a limina, levando & reconstituigio do envoltério ruclear Alem de manter a forma ¢ garantir suporte estrutural ao emvolt6rio nuclear, a lamina nuclear também éresponsivel pela ligacio das fibras cromatinicas ao envoltério, A observagio de quealteragdes na lamina afetam varias fungdes nucleares levou ’ proposicio de fungdes adicionais para a lamina nuclear, tis, «como participagao nos processos de replicagdo e transcrigio {do DNA, na expressio génica, na manutengio do citoesque eto ena Sobrevivencia da célula, tages aos genes que codifcam protenas presentes ou aiocadas 20 eio muclear causam uma srie de doenas gentias denominadas emlopatas Dente as envelop, pods citar as aminopatias, queso ‘aus por mutagdesna gene que coda lamin Vas essasindo es esto dsctas a eatura A distofia muscular de Emery Deis (EON) ccasionada por uma mutacin 0 gene que cdi a protein inti sacaemerina, 6uma miopata degeneratva caracerizadporconraturas dos iscals ds calanhares cotoveos pesca Com oprogesso da dena a candugoardiaca alterada, podendo evar opacente 3 more. Outotipode mult que acre no gene que codiica laina A ocasiona uma dstofia usar menos grave que 2 EDMO, mas que também cause anormalidades catia. 0 dlagnésticeprecoce ds efeitos cadiacas da doen pode sabar {via de seus potadoes, = Omaterial genético esté na forma de cromatina 0 termo cromatina (do grego croma, cor) designa, com txcegio dos nucléolos, toda a porgéo do niicleo que se coraeé visivel a microscépio de luz. Em células eucariontes, 0 DNA s complexa com proteinas especificas, constituindo a cro- natina. Sua organizagao é dinamica, pois se altera de acordo «om a fase do ciclo celular e com o seu grau de atividade. No nicleo interfisico, a cromatina se apresenta compactada e/ou descompactada (Figura 8.9). No miicleo em divisio (mitose ou eos), acromatina estéaltamente compactada, constituindo ‘oscromossomos. Assim, a cromiatina € os cromossomos repre- sentam dois aspectos morfolégicos ¢ fisiolégicos da mesma estrutura, ‘A disposigdo da cromatina no interior do nticleo e 0 seu /grau de condensagéo variam de um tipo celular para outro e sio caracteristcos de cada tipo celular. Além disso, a mesma «élulapode apresentar cromatina com varios graus de conden- el sagio, de acordo com o estagio funcional com o estado de diferenciagio em que se encontea, De modo geral, as células nervosas ¢ os espermatécitos (células. precursoras dos espermatozoides), em certa fase, apresentam cromatina pouco condensada (Figura 8.10). Os plasmdcitos (células produtoras dos anticorpos) apresentam niicleos com gruumos densos de cromatina, Os eritroblastos (eritro, vermelho,¢ blast, erme), células que se transformam nos glébulos vermelhos do sangue, sofrem uma condensagao ‘gradual da cromatina durante sua maturagio (Figura 8.9), € ‘esse processo culmina, nos mamiferos, com a expulsio do nidcleo, Como seré estudado mais adiante, o estado de con densagéo da cromatina tem um significado funcional impor- tante = A cromatina é constituida por DNA complexado com proteinas ‘As proteinas que se associam ao DNA para formar a cro- ‘matina sio classficadas em histonicas e nao histonicas. Além disso, sempre que a cromatina é isolada, encontra-se pequena quantidade de RNA associado a ela O DNA, segundo o modelo de Watson e Crick, éconstituido por duas cadeias de polinucleotidios complementares e antipa- ralelas, que se associam por pontes de hidrogénio, formando uma dupla hélice com diametro de 2 nm (Capitulo 3). A quan- tidade de DNA por niicleo varia de uma espécie para outra e & caracteristica de cada espécie. Essa quantidade, expressa em pares de bases (pb), é chamada de valor C. As células somé- ticas, diploides, tém um contetido 2C de DNA, enquanto os ‘gametas, que tém um contetido de DNA reduzido & metade, apresentam uma quantidade C de DNA. Nos nicleos das célu- las eucariontes, o valor de C varia de 10” até 10" pb. Nos seres vivos, a andlise do contetido de DNA mostra, em. geral, um incremento a medida que se progride na escala evolu- tiva (Figura 8.11), Entre os vertebrados existem excecies entre © nivel evolutivo eo contetido de DNA, e 0 caso mais evidente € 0 de certos urodelos, com teor cerca de 30 vezes superior a0 hhumano. Nos peixes pulmonados, também se encontram altas taxas de DNA, e, em ambos os casos, desconhece-se 0 signi- ficado bioldgico desse fendmeno. Essa discrepancia na quan- tidade de DNA entre 0s organismos foi chamada de paradoxo do valor C, 0 qual é uma consequéncia direta da comprovacio de que a quantidade de DNA nas eélulas dos vertebrados esta acima do teor minimo necessirio para armazenar a informagao genética da espécie. Ess fato levou & proposigdo de que a maior parte do genoma de uma célula eucarionte nao é funcional ou tem outras fungdes que nao a codificagao de proteinas. Alguns aspectos referentesa esse aparente excesso de DNA serio discu- tidos mais adiante neste capitulo. ‘O RNA associado & cromatina representa 3% da sua com: posigio e & constituido, basicamente, de cadeias de RNA nas- centes, que ainda estayam associadas a fita molde do DNA no ‘momento em que a cromatina foi isolada {As fibras cromatinicas apresentam DNA associado a protei- nas bisicas, as histonas. As histonas sio proteinas bastante estvels, ndo sendo renovadas constantemente, como a maioria Biologia Cea "y apace com us nicks sto eblasos PEER os ea, ey Figura 89 + Eletromicrosyaia de corte de rela ose. As quit ui tra pelo tnee aaa cea muds apresemam os nclos mais Condensodes, 1.07, esses icleos, mostra diferentes gras de candensgao, 0 etobastos m0 ee rgoaasa «arose sil cons done ots Acoma dexcompactad est nflomerente dps no no As das merase os 4 | Nuleo da Célula Contenido de DNA nos organismos Mamiforos = 100% oor 10 10400 a a i ‘ana | opt © Anti Toleosteo @ Elasmabranquo/ ® Equinoderna, Celentorado 1 10 ot [Numero de pares de bases por célula Fgua8. + Contadode DNA encontrado na avore ogendtic (Dados de Hood, [Mata ogy of Eacanote Cel, Benjamin Publ, 175) 4s protenas celulaes. A quantidade em massa de histonas &, apvoximuacamente, gual do DNA total do ndleo, em wma tan el, Fssas proteinas tém peso molecular baixo e apre- sean forte carter bisico, pois sio rieas nos aminoscidos Discos (carga positiva), arginina e lisina, Elas se ligam ao DNA gragas a ineragdo de seus radicais amino com 0s radi- «xstaslato do DNA, Nem todos 0s radieaisfostato esto neu tualizaos pelashistonas, o que confere & cromatina um cars ter vo, isto & uma grande capacidade para ser corada por are} corantes bisicos, propriedade denominada basofilia. Como as bases nitrogenadas nio se ligam as histonas, as interagdes DNA-histonas independem dla sequéncia de nucleotidios do DNA. Hi cinco tipos principais de histonas, classificadas de acordo com seu teor em lisina e/ou arginina: H1, H2A, H2B, H3 e HA, As histonas H2A, H2B, H3 e Ha pequenas, com 102 135 aminodcidos. Esses qu 0 tipos de histonas parttham uma estrutura molecular comum, com as aleias polipepticicas constituidas por trés sequénncias dispos- tas em achelice ¢ conectadas por das sequiéncias filamento~ sas, que se dispoem como algas (Figura 8.12). Elas apresentam uum longo segmento N-terminal composto prineipalmente por aminoseidos basicos. Os aminoscidos das histonas podem ser acetilados, metilados ou fosforilads, processos que levam a tuma modificagdo da carga eletrostitica da histona, alterando sua interagio com o DNA e influindo na configuragao da fbra ‘romatinica, Foiobservada, por exemplo, uma correlagao entre 4 fosforilagio das histonas eas diferentes fases da mitose ‘A sequencia de aminodcidos dessas histonas se conservou dde modo excepcional durante evolugio. As histonas H3 ¢ H4 apresentam sequéncias idénticas em organismos tao distintos quanto 0s da ervilha do boi, sugerindo que elas desempe- rnham fungdes idénticasem todos os eucariontes. Os tipos H2A ¢ H2B também apresentam sequéncias idénticas, com algumas variagdesespéce-especfias Fstudosreentesapontam para 4 existéncia de histonas com estruturas variiveis, coiicadas por genes diferentes daqueles que codificam as histonas prin- cipais. Algumas dessas histonas apresentam grande homolo- gia comas histonas principais, como €0 caso das H3.3, H2A.X, € HRA, A associagao dessas histonas variantes com 0 DNA seria responsivel por alteragdes na esteutura da cromatina. yea 12 « Esta grads hstonas H2A, HB eH Ashistonas HRA eH3 so constitu por ts sequtnas em hice, conectodas por das equenclas amen ‘os Easapesentam um ongo segment N-terminal compost principalmente por aminoicdos bios. Astona M apresena in regio globus, calzada entre ‘ossegnerosflamentososN-e terminal AS egibes no heloidais das histonas do cent do ncleossomo dobram-efavorecend a formacio dos dimers, que se ‘socom pels egies helcodas Neste esquema est represenado um dimero de H2Ae H28 apenas, Ashi (PM 25,000 dliltons) ¢ apresentam trés regides distintas: uma regido globular, em razio do enovelamento da cadeia pol peptidica, localizada entre dots se nentosos, N-€ Coterminal (Figura 8.12), Blas apresentam @ menor grau de conservagao durante @ evolugio, havendo variagdes entre as 0 aminosicidos tonias do grupo HI contém cerca dh nentos fl diferentes espécies ¢, mesmo, entre diferentes tecidos de uma nesma especie, As histonay HL sio caracterizadas como histonas de liga so, uma ver que, ‘omo seri estudad mais adiante, las tem ago das fibras «le cromatina, Em eritrécl aves, a histona 115 € encontrada em substitul 0 A He desempe Nos espermatozoides de alguns peixes, como salmio, tuba a mesma fungi, € truta, outro tipo de proteina lisica ests associado a cro na: sto is prota s protaminas, Nesses espermatozoid \s substituem as histonas, Além das protet proteinas nao histOnicas, dentre as quais muitas sdo aeidicas, As protel nas no histonicas do nticleo podem estar ligadas a0 DNA ou dispersas no nucleoplasma, Elas constituem um grupo muito heterogenco, no qual estdo i nas nucleares, com exceyio das histonas. As células metabo sate: mais ativas, como os neurdnins ¢ as células glan- dulares, apresentam alto teor de proteinas nao histonicas. De acordo com suas atividades funcionais, é possivel distinguir os seguintes grupos: is bisieas, a eromatina con cluidas todas as protei = Proteinas que participam da esteutura dos cromossomos. 10 mais de 30 proteinas acidicas que tem essa fungio ¢ na organizagio e compactagio do DNA nos cromossomos. Dentre elas, as mais relevantes slo a topoi- fase Ie a condensina (discutida mais adiante neste lo) as relacionadas com os processos de replicagio aro. do DNA, como as DNA polimerases, helicases, topoisomerases ete. ‘= Proteinas que participam do processo de ativaglo e repres- ‘sio génica, Dentre as proteinas ativadoras, estio aque las pertencentes ao grupo HMG (do inglés high mobility group). Essas proteinas se ligam as fibras cromatinicas, Feduzindo sua compactagio e ativando, portanto, sua ati dade transericional. que colabora Dimero de H2A-HOB DNA (200 pb) Dimero de f2A-H28 Biologia Clue, = Estrutura molecular da cromatina de nucleossomo, O nucleossomo € uma patticula co Crigura 813) Cada nuceossome & constitu yy dle bases (pb) de DNA associados a um octamero de. (0 octimero € formado por duas moléculas de ca histonas H2A, HB, H3 ¢ Hd. As histonas H3¢ Hé for tetrimero central enquanto H2A e H2B formam doi ga ‘Quando preparados totais de niicleos submetides 8 fibras cromatinicas assumem o aspect de um colar de, ny as quais mantém certa distancia entre si. Aniliss biog, Te or deco ear que cna coma 2 real anol un wpent de DNA com core arnt Essa estrutura foi denominada centro do nuckos! aophchuro i DNA deligeria O museum {choatnlds pao cnt 30 acleomomo mals uae treo So'DRa de Tiga, tasande 20 ph Seta tuarde cons represen 6 princro nel Seong eee com ee ueateaan tien damned ba de lnm Figure) Svopiode nil de cooparero ds Coma ra tado postr de 30 nm ques fone quando «Nea eeoe a Dine ee acme Sito oda nagar bins ao nies ee cerca eeu cca ae Ee eee eae op Gee cee een ee yee igus 1) Alm dekinons is tanbeecor Rete cemeteries esr niiescias aa ane ae ee cae eee ae {como ons Mg = ns) ex contentaro sends Seadorerd fora tn san malo por fie tnqunto cere de 108 ea elf fore de fe penta oko cas i euros aa Tetramero de Ha-H4 Figurae.3 » Desenno exquemstcosonce mA.ODAcmdyplahticervelasenoo8 tamerode hstonas 2A M28 wen! Cerio conucleossama Ashizons Heh lum tetrrmera de cada ado do 35 ‘imeros de HOA H2B Ao ceo coms Somase 0 DNA de liga, tla bases econstiuinda 9 nuceosor. 155 Fora se 100m gent i + Ousenhoesauerstice das fires romatinicas poo cereral do nciessom ¢constuida pt otémero de hstonas. A assocarSo entre os nuceossomes Senses po ireemicic do DNA de igaco, forma a ira de Tre. Quando a hstonaH] sega fibre de 10m orgnaa bra de 30 nm que mostra uma conformagso Dips tape Mftxa de Sone € marta pencpaimante pela iterates etre coud laments das moles eH) radicais acetila as histonas do octimero desenrola de 30 nm e leva a formacao da fibra de 10 nm. favore- ranscrigao e tornando a cromatina ativa. momento, pouco se sabe sobre a organizacéo da em niveis mais compactados. Niveis superiores de belecidas, tais como, entre outras: a RNA polimerse bee é responsivel pela transcrigio do rDNA, as topoisoms 11 que participam da descondensagao e do relaxame'® DNA; 0 UBF (do inglés upstream binding factor ws envolvido na transcrigdo do rRNA; a nucleolina, que pi da transcrigio do rDNA e do processamento dorRNA«2"" larina, Além disso, estdo presentes no nucléolo RNA de" ‘peso molecular, os snoRNA (do ingles small nuclear X* ‘que podem estar complexados com proteinas, constiit* snoRNP. Um exemplo de snoRNP, formado pela comp do snoU3 com a proteina fibrilarina, & responsive p's" gem inical do FRNA. ‘Ao microscépio eletrénico, trés componentes mf camente distintos sio vistos no nueléolo: (a) 0 <& las elétron-hicido e frequentemente em forma crc componente fibrilar denso, que contém fibrils mut cleo da Clula 118.17 + Bevomrogeatia do milo deus cia de guest de yn ‘see queresta umnuclol Dots cemsfbes CF seton hor sino ene do nual std emoitos pelo component ia en santo 9CFD ehamogenee e bastante elton den ompanente moi um aspect granule condgente com sus angio 1 00 elk B SsnMaria) com 3.25 nm de didmetro, que podem formar uma rede e (e) ‘componente granular, constituido por grinulos com 15 nm igura 8.17). Esses componentes representam os sis de transcrigao ¢ processamento do #RNA e de monta- nls subunidades ribossGmicas. Ni maioria dos nucléolos, os trés componentes apresen. tan um arranjo concéntrico. O centro do nucéolo aparece poucocontrastado quando observado a0 microscépio eet sic (Figura 8.17), Nessa regio esta localizado o centro fibri- la. que contém o rDNA, as moléculas de RNA-polimerase I, 4sDNA-topoisomerases I II, bem como os fatores de trans io do rRNA. Os centros fibrilares sio envolvidos, total cu parcialmente, pelo componente fibrilar denso, no qual sio encontradas moléeulas de FRNA recém-transerito € as eazimas envolvidas no processamento pos-transcricional do RNA. A porgio mais externa contém o componente granu- lar em que ocorre o processamento final do tRNA e é, por- tanto consttuido por granulos de rRNA complexados com proieinas (Figura 8.17). Os genes que codificam os rRNA estio localizados e sio transcitos nos centros fibrilares ou no limite entre os centros frilares eo componente fibrilar denso. O processamento do RNA e a sua complexagao com proteinas inicia-se no com: Ponent fibilar denso, continuando no componente granilar, so qual as subunidades ribossémicas estdo em processo final emontagem, * Biogénese de ribossomos 0s genes que codificam 0 rRNA estéo localizados em por: ‘es de fibras cromatinicas que, apés sua compactagio, irio Consituir as constrigdes secundarias de cromossomos especi- fcos. Essa regides foram denominadas regides organizadoras do muck NOR (do inglés cleolar organizing ret ‘numero e a localizagao das NOR variam de uma espécte para ‘outa, Na espécie humana, por exemplo, as NOR estio local: zadas nas constrigges secundiias de 5 pares de cromossomos acrocéntricos (cromossomios 13, 14, 15,21 €22),enquanto em feijio ela ¢ encontrada em apenas um par le cromossomos. (© miimero de NOR de uma espécie ni los daquela espécie, embora determine © niimero maximo gue contém 10 NOR por genoma diploide, a maioria das células apresenta um dinico refleteo de nucleo por niicleo, Na especie hum ‘nucléolo, Esse ferdom 10 pode ser explicado porque, durante x tel 1 biogenese do nucléolo, que ocorre e, pode ocoreer tanto a associagio das diferentes NOR que transcrevem wm Ainico nuclgolo, como a fusio de pequenos nucléolos, indivi lualmente formados, em um tinico grande nucléoo, Em células eucariontes, os genes que codificam 0s RNA, miliplas copias por genoma, As células nas contém cerca de 400 c6pias do gene para o FRNA, estio presentes ¢ dlispersas em 5 pares de cromossomos, enquanto células de 1 de 600 cépias desse gene ers um tinico par de cromossomos. As jadas in tandems, ow soja, repetids em sequéncia, estando ‘ead gene separado do préximo por um segmento de DNA rio transcrito ou NTS (do inglés no transcribed spacer), que ‘em um espacador intergénico. Assim, o rDNA apresenta sequéncias transcritas alternadas com sequéncias transcritas, Cada sequencia transcrita contém de 8,000 2 13.000 pb, enquanto, nas sequéncias ndo transcritas, esse ‘ndimero varia muito entre as especies Xenopus contem cet rias cOpias do gene estio arran- = Sintese e processamento do rRNA (Os genes que codificam o rRNA sio transcritos pela RNA- polimerase Ie cada gene proxluz.o mesmo transcrito primsrio, Em células de eucariontes superiores esse transcrito primario € uma molécula de rRNA com cerca de 13.000 nucleotidios « coefciente de sedimentagio de 45S, denominada pré-rRNA (Figura 8.18). 0 pré-tRNA contém, nas ext dis espagadores transeritos externos, ETS (sigla origina do termo em inglés), dois espagadores transcrites imlernos, ITS1 eTS2, Antes de sair do micleo na forma de subunidades, ribossomicas, 0 pré-rRNA é clivado para retirar esses espaga- lores e produzir uma c6pia de cada uma das moléculas finais de FRNA: 0 FRNA 28S (com 5.000 nucleotidios), 0 FRNA 18S (com 2.000 nucleotidios) e © FRNA 5,88 (com 160 nucleoti- dios). As sequéncias de nucleotiios que sio retiradas de cada rmolécula de rRNA sio degradadas no micleo, A medida que a RNA-polimerase I transcreve © rDNA (DNA que codifica rRNA), proteinas sio adicionadas is mol culas dos pré-rRNA nascentes, formando particulas de py ribonucleoproteinas (pré-rRNP). A molécula de rRNA 458 presente em cada particula de pré-rRNP ¢ entdo clivada, pelas, snoRNP, em sequencias especificas para formar as moléculas, maduras de rRNA (Figuras 8.18 e 8.19). A molécula de rRNA 458 (transcrito primario) é, ini cialmente, quebrada em duas, uma com 32S e a outra com 208. A molécula de rRNA 20S ¢ clivada, originando 0 RNA 185, enquanto a clivagem da molécula de FRNA 32S origina midades 5! © 3, Giese eeeeceeseeeeeeeeeseeeeeseseeseeeeeLeEevEe-eeLeLesea ae eeeeeeeveveeeeeseaeeeeeeeeeeeveee Las A ® HHH Ul aio P Montagem das subunidades ribossinjc, ania etbassdrate en akan aes HIRNAS 1, 288, ywewatleay 0 Vygys Am esas as ce roelngs, Hse proce Je ones que cenlicann as proteins tbo ath lo pel RNA pullnner99e 1 7 oe ‘Meat ath tae scot So : \ rilsfnviea menor, qe COHKENT apensy 0 ha Go Sop ofA Su an WINS spe as moléculas de FRNA 288 ¢ 5,88, Esse padido de proce samento é observado em cdlulas humanas, enquanto, em fouteas espécies, existeny diferengas na ordem de algunas elivagens. Al Iyém metlagies nas riboses dos pre aRRNA ea isonyeriago de ‘que sho convertidas a nv la civagem, durante o processamento ocorter tam uuma eentena de moléculas se urd ppseudtouridina, Ei células so adicionados is moléculas de rRNA durante sua transcrigo cereade 100 gruposmetl « poucos grupos metil so adicionados depois da teanserigie, yados durante o process Todos esses radicals meti so pres mento, dle maneira que eles podem ser detectads nas mole las maduras das FRNA, A metilagio provavelmente protege 0 FRNA das clivagens, de nyado que a FRNA em processamento 6 éclivado em pontos no metilados, Fssis modificagbes dos pre-rRNA tém também, provavelmente, alguma fungi na ‘montagem dos ribossomes, © FRNA 58 (com 120 nucleot essen genes esto ‘Os genes que codiic dlios) nao esto presentes no DNA, ou seja localizados em outra regio do DNA, que nda a NOR, Assinn, ‘esse FRNA & transcrito fora do nieléolo ¢ separadamente das ‘otras molgeulas de RNA, Esses genes também estdo pre sentes em cdpias miiltiplas por genoma, ¢ as células humanas ccontém cerca de 2.000 cépias desse gene Lambénn atranjadas Jn tandem. Os genes que codilicam 0 RNA 58 so transeritos pela RNA-polimerase IIL, O FRNA $8 ndo é provessado, come fos outros FRNAs, Esse FRNA, depots de transcrito, migra para ‘6 nucléolo, onde ¢ complexado com os FRNAS 288 © 5,86 ¢ proteinas para formar « subunidade maior do bossomo (Figura 8.19) Ale que algunas prota 88 ular cen tate ae IPO Ne WNSOC KIERO A FRNA formar a subunklade meno Moisehr metade das prt RIVA ns muomnento de eins can FRNA SS, so Ine POFACAS 18 He ye micas dr medada que acortem as clive, Ala, | ee Tas, torn se madara mals rapldamente que a sah, no clematis FRNA, H evidencin apenas quan cla est mo eltoplasins. Unis desc p rn, crac terval er fangs, ligase & sla da su maior ¢ €responsivel pela unite entre as as subynid Ada tradugao, lisse comport lo pracesse de sintere protec Inigo 0 ‘Con elucidado anteriormente neste capital, « lo day subuanidades ribossOmieas para 0 eitopla ‘sistema Ran GTPase ¢ proteinas do comple fimcionany come telhos para o transporte das si Ain isso, as proteinas presenter (rico no aminodcidoe de ‘osinal de exportagto nucle " 6 reconhecilo por uma molgeula de exporting, tga sea subunidade &transportada = Outras fungées do nucléolo © nueltolo desempenha outras fungdes além doy tradicionalmente conhecidas na blogénese & monly subunidadesribossOmicas, Una delay & 4 maturai cula reconhecedora lo sinal (PRS), que, conto verdest Capitulo 10, € un complexo de RNA de baixo pes vn com proteinas, A PRS feconhece as proteinas a seren lay e destina-as para ax membranas dy reticulo eb tico rugoso, Sabe-se que no nucléolo ocorre a con RNA pequeno com proteinas para montar a partici injo esteja ainda deternvinado qual dos componente ul res 6 responsivel por esse processo, © nueldolo esti rnvolvide, também, 1a comply RNA ¢ protetnay na montagent da telomerase (alist aiante neste capitulo) e no processamente de a » Nucleoplasma © ucleoplasma é constituide por dima soluy proteins, RNA, nucleosidiog, nucleotiion e fons," very mado heterogeneos, poly apresentany diferentes a! hados os nuckéolos © a cromatina, Os RNA Biologia Celular ay dades ribossémicas sy ‘nas rbossdmicas sig at yuematizado 98 Fig iu -polimerase-- Eas pa 11 importadas pelo ma 0 a pata consttuira subunidate ssoclardo a0 FRNA 18S pare possmicas aca 8690 px ito. As pooteinas restates age nas presumes nasclivagens. A sabunidage peas a molécula do rRNA ime subunidade as sige onda 9 subunice mien sma, Uma dessis prot :deslga-se da subunilads reas das subunidades no amento indica sua partie, intexe proteica neste capitulo, 8 export para o cltoplasma envobe lo complexo de poro. que wnsporte das subunidades + subunidades presenta saminodcide leucina), que exportina liga-se a ela ea lo fangs além dag gine ¢ monger Fea maturato dapat scomoserdstdao ac baio peso molec prinas aera se fo retut endopsn core complex 2 nara partic, eto Componentes nucle m, na complexacio 4 merase (diseutida ento de alguns (RNA mn cago aquest ose fons a ial na. Os RNA sio heretes tran leo dalla ——+4—_—| t Aros So poctnonete += Reema ramstica dt companies dale dente dsb ‘hse Avarcrie drONA pe Ud porn! coe orc eo “Sheen ry v0 enna ‘Sums chose recess pas sntn CF tse pceamenereser ta ‘saoa prea eles tri eas fais ete pero GD No cose 9 cents meal in cet ema pens ote 9 aro ‘am mide sone ORAS vrs pu ewes ‘Src cmpertade pete nce no qu sampler mle AS “alae anaes de map rma mars ts ek ‘ter de seamaraia de 0 ke lac ee Soon mse ‘moar pan deren sare 9 lpn, euler rau comequentemente, pesos moleculares. Muites dis proteins resents no muceoplasmasio enzimas envelviascom a trans ‘to ecom a duplicagio do DNA, como as RNA-poimerse, DNA polimerases, topoisomerases, helicases entre outras A assocagio das téenicas de extragio fracionamento € ricroscopa eetrinica demonstrou a exsténcia, 0 mtcleo, =n de um endoesacete: a mates mclear. ApoS 4 digetio do DNA com DNase ¢ 2 extagso tt mri ds pron ckeres,«exetira ‘esante mune ¢tamano € forma orig tis dice Fae extra constituids por {tes componente Hine nucle, 4 et tora miclelare wna rede fiblar interna 2 tales cen Vrisproteinas foram detect dosnt, tae como laminas A, mains ‘metaloprotinas (ques liga a met), aetna respi de miosina Alans Ado esque 0 mais estes e oorrem em ‘menor quantidade, quando compas com as Jamin assocadi imine nicer Ha contro rsa, no enfant, sobre a organiza dese Proteinase uma fede trdhmensional em um tdocaquceo ‘ nil intrsico & estruturad em com partimentesdstintos,conecios come do Dos clears. A mate pafticiparia na organ ago deses compartments 0 expago nile 2s bras eromalinicas, por expla, ocpern locas especies no interior do mle, ox cha smades tetris comossmisos, A evcroma tina, constuida por DNA rico em genes cod «adores, localiza se peferencialente no ceed {o milo, enquanto a hetrocromatins co DNA contim seguéacis altamente repettivas, io codficalora, localize na peri. Ess Alsposiio favoreeo slnciamento dos genes dk eterocromatina, bem como a atsiade sfnica da eucomatina, A matriz nuclear teria 2 fungio de ancorat a6 alas cromatinicas, a8 faimas envolvdas na repleaio e tears ddo DNA e também as protenas envolvidas 0 ‘rungpore dos RNA. Disperos no nueleoplasma também sto ‘encontrados proteosomas ue, conforme dis cautido no Capitulo 1, sv agregados prtecos envlvidos coma degradago de protenas. Hesse loeaizam nas repies as tanto quanto na perferia da heterosromstina © ‘dos nlélos Una das Fungoes dos poteossomosnucleates ‘ahidelise ds poteinasenvalvidas no controle do cic el la (Capitulo 9). 8 Res Ainformasio genética das eéluasestécodificadae arma ‘enum sua maior parte, no DNA do ticle. Durante sua ia cla pasa por dois estgios, sendo um de visio em Stas uas-flhas ~ a mitose ~e outro que se intercala entee us dvsdessucessivas ~ a intérfase. O ncleo, na intérise, Fode apeesentar-se sob virias formas, mas, em todas as él Iseacariontes, ele & separado do citoplasia pelo envoltirio. oud, que € constituido por duas unidades de membrana se emolt6rio contém poros que regulam o intercimbio de quef ‘uhincias entre 0 ndcleoe o citoplasma, Associada 8 mem- all branainerna do envoltrio nuclear existe uma rede ilar de proteins a Kimina nuclear. A cromatina est associada essa rede de protenas. A cromatina engloba todo © DNA nuclear ma um complexoestvel com proteinasbiscs:as hs: tas, A unidade isica da cromatina € o nuceossomo, que {constitu por 200 pas de bases de DNA associa a um ‘octimero de hstonas. Dols tpos de bras cromatnicas sto encontrados no nicl intrfsio: a bra de 10m, que for: ‘mada pela asociago linear de nucleossomos, ea fibra de 30 ‘im, formal pela assocagho da hstona HI fibra de 10 nm, m= condensin cea cls edeconensadaem os. 0 ‘edo roma Xd dares de mare ‘eames de DNA pl i ls doce, sor um increment some! quando se pre mt tor de DNA de mn ls vrata, arco ce ones empueenpnlapeleaiencedeas ma de cps alas equa spc hme ih do pone, er sea den Inet as demas Set por prose ee A ampli A eg enpilades do bale oa odo DNA ue Conte geese casa Financ tambon pode softer amplco ey Spas Or malo io ones ere tan ‘lo emt por mbran Sio coms po na ‘Spin, ela pry do DNA gucci one Snot en pen BN rod els propa dteansign dos RNS on, nage dv sbundade boss ae da ance ‘Sedona duis de RNA com proteins coms or, ‘data ds prt econecedrs Slasesde DNA. Sse coro apeeat ts ager =, * Cromossomo metafésica:0 estado ‘mais condensado da cromatina ssn qa nore dara a dvsdo mis ou dare 3 meio O gra deconensao ¢ mibimo na mets, ado pla gal os exudes da estratra rmondimics iia « Estrutura dos cromossomos metafasicos A daplasso do DNA & congo determine pars gue 4 cll ete en dvsn Em comegoenca, 0 cromosano setatisc compost por daus mcs de DNA, ads ual presente om uma das ds cronies ue const o ce rrowoms Cads come ¢ reat d compacta de Sr cromatinca de 0 nm que segundo o oni apre sera dimer ere 025 €2 um ecompeimeno de 025 4 $0 an (Fgura 820) sear dos comossonas metas fj demonstade emespermenton ot use comosomos for rat dos om wbstncns polanniss, ts como heparin oslo ie derrana ses polio removen 2 ions lias 30 DN. Aesratura evant mane 2 mrkgs oignal do 90%) e verificouse gue ela decresce & medida que se desce na escalafilogenética ds ‘mamiferos aos répteis, anfibios e peixes. A homologia entre DNA de peixes ¢ o do homem é de apenas 20%. Esses das forneceram um sélido apoio bioguimico a teoria da evox tem possiblitado uma série de estudos sobre pormenoresé3 ‘evolugdo dos seres vivos. A hibridagio molecular possibilita também quanta 0 -ndimero de cépias de um determinado gene existente em und célula, pois a quantidade de material radioativo hibrdado: proporcional a0 nimero de sequéncias existentes. Pores! téenica foi possivel saber que os genes do RNA ribossimico das histonas esto presentes nas células em c6pias mils ao passo que os genes para coldgeno e enzimas digesivasexs tem apenas em cépia tinica por eélul. ‘A técnica da hibridagéo tem também sido muito wait para a localizagdo de segmentos especificos de DNA nos to ‘mossomos, por meio da hibridagao in situ, Nessa varia cromossomos dispostos sobre limina sio submetidos a0 cls com consequente separacao das cadeias do DNA. Esss cv ‘mossomos sio, entdo, incubados com suas sondas espe por um tempo determinado, em condigées nas quais ocorte® hibridagio. Apés a hibridagio, lava-se 0 preparado, retin do-se o excesso de DNA radioativo, e realiza-se, na lint. © processo de radioautografia, que indicars, nos cromoss Nucleo da Célula Hibridagao in vitro do ONA fttentes entre o DNA, os animais Xe ¥ mos, onde esta localizado @ DNA em questo. A hibridagio insite pode também ser feta usando-se RNA radioativo, 0 sual vai associar-se as regides cromossomicas que apresen- lam DNA com sequéncia de bases complementares a0 RNA uilizado, Uma variante desta técnica utiliza, em ver de um ‘stop radiativo, uma molécula fluorescente ligada ao ido tuclco, azio pela qual recebe o nome de FISH (do inglés fuorescent insta bridization) (Figura 8.32). + Gonagem do DNA Tecnica que consiste em inserir um fragmento isolado de DNA em outra molécula de DNA de uma célula hospedeira, ‘we seja capaz de replicagio independente. O resultado é uma nnogcula de DNA recombinante. Sea molécula recombinante relic em uma célula hospedeira apropriada, podem ser sbvidas grandes quantidades da sequéncia de DNA que foi Medi is ; luigi do DNA io bread © ragiotivo do animal Y Figura 8.31 + Ténia dihiidaio de DNA utizada em bilogo molec. al 929 a0, | FE| Fes] 5 OCT iS ) ye, |= ¢ y LY z fe on, re es ee Smt. Ouest men cea oe ee cee, “eae eee Gan | ene’ "eam > x Redugao da tempeatura jcsfa radioatnidade hibrdagdo dos 0 ecaleuio da % Segmentes homblogas idagdo inserida, Fragmentos de DNA humano, por exemplo, podem ser clonados em bactérias. Assim, a partir de uma Ginica mole cula de DNA podem ser copiados muitos bilhdes de moléculas idénticas. Além do DNA, podem também ser clonadas molé culas de RNA. Inicialmente, uma molécula de DNA é copiada 4 partir de um molde de RNA, pela enzima transcriptase reversa, A molécula de DNA obtida é complementar a0 RNA olde, sendo denominada cDNA, ¢, entdo, pode ser inserida no DNA de uma célula hospedeira. © processo de clonagem esté esquematizado na Figura 8.33, Outra maneira de se obterem grandes quantidades de fragmentos individuais de DNA in vitro é pela técnica de rea ao em cadeia da polimerase ou PCR (do inglés polymerase chain reaction). A PCR s6 & possivel gragas i utilizagaio de um tipo de DNA polimerase cuja atividade enzimatica é mantida ‘mesmo em temperaturas elevadas. Essa DNA polimerase & extraida da bactéria Thermus aquaticus, que vive em fontes 172 Biologia Cellar e Mole Figura 8.32 + Fotomicogtafa de cromassomos metafisios de Slonum cxymbifoum | com 20 = 24, contacorados com DAP (6 samino-2-dherylndae hateery $dmedasatéeica de vorescentin ty ibidlaton) pra detect eos sey {e genes de A com sondas tds de tiga. 0 ONA 485 fel marado om boing oto vo OMA 38 marae on din ‘etectad com aii {UTP edetsctad com andgoxigeninsrosamina fluoocrome vermelh) 1000 Leticia A Alida Rego e Andre tatorgaVanzel) acter < 5 |e Grameen . [eee opine |=. + DONA complomentar = cacela dupa Integragae do plasmisio Figura 8.35 + Esquema qu lusraresumidament 0 procedimento utiliza para 3 cleragem de um gene fm bacteria, Uma molecla de RNA mensagei serve de mold praa sitsereversa do DNA complementr (8 procusindo um hbo RNA-ONA. Apia de NA ‘do hbido ¢elminad (8) anda wma ead simples de DNA, que €duplads (Esa cade dupla de ONA ‘inserdaem um las quefo ado part de bacteiaspreviamente nfectadas (De boro por 350 de uma enzmo de est, propria 0 asso hibido resultant itrodusido em baci ns guas se eproduz(H). Na etapa segue 03 plesmidiossso iolads es sequlncsespciias de DNASimetiadas so dees seprades, gracasa;so de erzmas erst 20 adequadas 0). posivel em seguida, marc es wacomisetops adits prdusndo asim ogue se chama de sonda de detec que por hid. Capos de quanta (quando se tabalh ia vie) ul Calizarasequtncaespectia de ONA gee) nes as, ‘quando se fa 3 hibedagson i ej = Cr@ Ones. Co L_, — do plasmicio| na bactéra ‘norido na bacteria Isolamento dos plasmidios OO OU DNA complementar inserido Isolamento do NA plasmidio hibrido \\ Solda do DNA de pla Cade srtatzado no DNA CD plasm = Presgto do plasmico hide \ do plasmic Nucleo da Célula Aesigua quente, ¢, por isso, foi denominada Tay: polinerase \ Lag polimerase € usada para adicionar desoxirribonucteo iiosa um pequeno segmento de DNA, ou primer, que dirige swntese do novo segmento de DNA sobre o molde onde 0 prime se liga. A PCR pode ser dividida e 0) Amistura da-amostra de DNA + Tag-polimerase + primers «os quatro nucleotidias que compaem a molécula de DNA CTP. AATY, AGTP e dTTP) € submetida a uma temperatura k 92.4 98C, para que ocorra a separagio dos dois filamen: «do DNAs (2) redugao da temperatura para que os primers scliguem as extremidades 3° de cada filamento de DNA, que coatém as sequéncias nucleotidicas complementares ~ a Ta, jvlimerase vai adicionando nucleotidios 2s extremidades 3 dos primers, copiando os filamentos de DNA e formando fila nnetos complementares a cada um deles; (3) a temperatura é novamenteclevada, fazendo com que os novos filamentos de DNA se separem dos antigos, que foram usados como mole, afin 0 processo volta a se repetir vias vezes. Em cada ciclo de repetigio, o miimero de genes (segmentos cDNA) € duplicado, e, como cada ciclo dura 23 h, em algu- nushoras.o DNA pode ser copiado bilhdes de vezes. Além de rida, PCR € uma técnica tio sensivel que pode amplificar 0 DNA de uma tinicaeélula Genes clonadas podem ser introduzidos em células ani iis € mesmo em plantas. Esses experimentos tém possbil: fio de genes que controlam 0 crescimentoe a da eélula, inclusive dos genes responsiveis pelo dksenvolvimento de células cancerosas. Esses genes podem sinda ser introduzidos em células da tinhagem germinativa Ae organismos multicelulares, possibilitando o estudo da sua tapas fundam *— Resumo As modernas técnicas de anilise e manipulagao genética, associadasa métodos de andlise bioquimica de dcidos nuclei cosede proteinas, tm possibilitado que modificagées sejam nlroduzidas nos genomas dos organismos. O conjunto de iésncas com essa finalidade, conhecido como tecnologia do DNA recombinante ou engenharia genética, consiste na inirodugdo de genes de uma espécie em um organismo de outta espécie, de modo que os genes estranhos possam dupli- arse, ser transeritos e traduzidos no novo ambiente celular, A metodologia é complexa e depende do fracionamento do DNA com enzimas de restrigao, que cortam a molécula em. lois especificos. Ela inclui numerosas técnicas, entre as uais se destacam a hibridagio molecular e a clonagem do DNA, As técnicas permitem o isolamento e caracterizagao de e * Bibliografia At eal Molecular Biology ofthe Cal, 4c, Garland 2002 etn, Eand Hake, SB Te nteosomea ie vacation goes along way. cm. Call Bil, 4: 505.517, 2006, toivet Fuse a The multifunctional nucleolus, Nat, Rev, Mol. Cal Bit, 8574585, 2007 expresso em onganismos, Os animais transgenics so, geral mente, produzids por mei da injegio do DNA clonal ne promicleo do ove fertili lantaclo poste mente pa nnascimento, Assim, o aninna wlo,o qual ¢ trang tuma mie hospedeira, na quall se desenvolve até gene eatran, ae poet agora ters expres etl a - __=S=stése de un etd por erempl meet en tambet impor inecicina forense. Fa torna posse jude un ode abel send po is usada ncia no diagnostice de dive doengas here lade = Mutagénese do DNA clonado Técnica pela qu: ws de DNA clonado sie alte radas para produzir versies moulificaclas de genes, que sio reintroduzidos nas células ou em organismos unicelulares. e proceso de murtag delegdes, insergies ou alteragdes le nucleotidios na molécula de DNA. Esses experiments favorecem os estudos da expressio genica, bem como a determinagio da fungi dos produtos desses ines, Por exemplo, alguns aminosciclos de uma determinada proteina podem ser alterados, possibilitando estabelecer a fangao desempenhada por ela na eelula, sequéne ese in vitro pode cau genes especiticos que sio i plasmidios de bactérias) e transteridos para células proca. riontes, nas quais, além da produgio das sequéncias de DNA emalto niimero, o produto final (geralmente proteinas) tam- bém éelaborado em altas taxas, poensdo até aleangar produ io em escala industrial, Esses processos constituem 0 que se convencionou chamar de clonagem genic. A aplicagio da tecnologia do DNA recombinante tem proporcionado diver sas vantagens: desde a determinagao da proximidade entre ala evolutiva, a localizagao de genes espe mplificagio daqueles dle maior dlireta apli ‘organismos na es: cificos no genoma, com a Interesse cientifico, médlico ou econdmico, ate cagio pratica na vida cotidiana, como nos casos de determi nagio de paternidade. Cris, M and Burke, The micear envelope as ‘ytoplasmic architecture, FEBS Letters S82: 21 Cook, Aveta Siractural bislgy of nusleeytoplasnie transport An Rev ‘Biochem, 76647-4691, 2007 DiAngelo, MLA, and Hetzer, MLW. The soe ofthe nuclear envelope in celle “organization. Cell Mol Life Se 68: 16-882, 2006, ara Sth DNA srs ¢ miter, Savi 1997. Ciclo Celular e Meiose pred MWC (eee Uric role genético do ciclo celular, 192 ole que 0s complexos G,-Cak e Gy/S-Cak exercem, 193 Dee Nu ea Lear) Como o complexo M-Cak controlaa mitose, 193 Oreos Oc eR uO Pa Be ct ccs) i IF Be ee i woe & + Aelia do DNA €sericonseratva, 187 a , sme at Ae aE oe Cia Se Sena) os pana ee ee See tenn Cd See ng Be SE ren Te Sune. 3 Sd 4 | Glo Celulare Meiose A capacidade de crescer e de se reprodurir € atributo fun: Jamental de todas as eélulas. No caso das células eucarion tes. 0 processo biisico de génese de novas células obedece @ um padrao ciclico que comega com o crescimento celular, daterminado por um aumento quantitativo coordenado dos nilhares de tipos diferentes de moléculas que a célula tem, inclusive de seu material genético, e culmina com a partigio deseu ticle e citoplasma em duas células-filhas. As células criginadas repetem 0 ciclo, e 0 mimero de células aumenta caponencialmente. Este processo é denominado ciclo de divi- sio cellar ou, simplesmente, ciclo celular, e serve tanto para imantera vida, em organismos pluricelulares, como para gerar svida, no caso dos organismos eucariontes unicelulares. Por ‘no dele, o corpo humano, por exemplo, ini partir de uma tinica céula, 6 zigoto, a qual passa por dupli- cagies celulares sucessivas, tanto ao longo do periodo embrio- nitio como ao longo do desenvolvimento do organismo. E longo de Gy, a maioria metizada continuamente nessa fixe, acd eset dlupicagdo do DNA. os specifcamente identi ares dle Gy ainda 80 Je de algumas enzimn mente subsequente do inadoras da sintese de enimas da sntese da® s dos genes que cot ct nesse periodo, pois aa fase S e-se ao seu papel co” Jar contimuae prolife umm estado quiescen!® ariamente por sl ocaso de eveariont 0 caso de lever) ctetoparaelisno com Ando de prferencia, ‘heii colt, No eran, a esa ella procarionte sj, esse, walls tani ‘pe deve ser duplicado con ata fella se eto dentro de pose rims enone mus complexe, CAulas eu Salil ella, 850 de "us pacas horas acupadan pela period 8. Sonn se abs = Areplicagio do DNA é semiconservativa ca hase fla de DNA. pepsin ‘luo Cri, mecananin bik de ve eng seperti dan can se DNA, alt pel deenvolaent dp hh int me pa a neue de we A sequin de nln “net xa eto ea de parce ae Base por Watson e Crh scission ts correto parennento da bases umequre tia replcag Dara a wept a chai de pate al en one ve a rept Mlaale DNA ra fas slitz, Di allo, Avis cala nv twa nlite preetete xh ye 36 In els fe, ment a rea Ape exytaesse ane sc molecu ae LNA pe ser dete tala pela coloragae cern dan etn Irie en tn rae acy sen Hose a wh (Higa 90, Na Nolae Nova Z VMolécula-finas 5 + Representa simpicads da eplcaco semionseatia do DNA. nce deDNA sabre aposser deservlads Dues novs cade efermam ‘orm sequels de nciciis complements cad ura das cades dao lea erigin le ON or eve mecansma un cade serve de ol, dato» sequen complement de sia cade, Ns cuss moll: que formar, tmscoseeptenale acuta nova local abet nls rg DNA Schama deoguthaderepicaro eestindeado pel setacua, = Caracteristicas gerais da replicacdo do DNA + Areplicacao é assincrénica Uma anilise detalhada da duplicagao do DNA demonstrou que incorporacio de precursores marcados, sej timidina-H (ou 0 andlogo da timidina, bromo-desoxiuridina, nio se dé a0 ‘mesmo tempo em todas as moléculas de DNA de um nicleo e que; dentro de uma mesma molécula, existe um padrio deter- ‘minado de sequéncia de sintese; por isso se diz que a duplica- «a0 do DNA & assincrénica. Dentro de um dado tipo celular, regides especificas do material genético, ou genes individuais, comegam e terminam sua duplicagdo em momentos definidos na fase S. A eucromatina, que constitui a cromatina geneti ‘camente ativa, comega a replica primeiro, fazendo-o desde 0 inicio da fase S, enquanto a heterocromatina geralmente é a tltima a replica, na final do periodo S, sendo considerada, portanto, de replicagio tardia — | ~ = “Lye \ | Figura 9.6 + Fotmicrorta de cromossomos de ls voto cm ny bens ted Gore ura are repatva Ese compost ean Sebi emu do tana modeando 9 aide tr oc fsutand a epunds more em cromessomar consis pr ferret code ona que coramuatofacament Eo rire comitder mos tlt een deincrporso de et ‘na qu arpa do DNA €semiconsernt. A fotomicuyta os {om rcas ene comatides mas que podem ocr duster {Covera deWott Seer Chemosom 4347 1974) + Existem origens de replicagao A velocidade de duplicacio do DNA é caleulada em to de 30 mm por minuto, na Escherichia coli, e de 0.5 a2 [por minuto (ou 0 mesmo que 3.000 bases/min), nos nici das células eucariontes dos vertebrados. Com esse velocdai, s€0 processo comegasse por um extremo da molécula de DS ¢ terminasse no outro, o genoma dos vertebrados gastaria un tempo muito longo para sua replicagio. Calcula-se que ses necessirio 1 més para um eromossomo humano repli Isso realmente no acontece, e foi possivel demonstar ‘enquanto em células procariontes a molécula de DNA a replicasio em um tinico local, chamado origem de repli. ‘fo, em células eucariontes existem miltipas origens. Asin «essas célulassolucionaram o problema de replicar seu enome ‘genoma no curto espago de tempo de $ e superaram a bass Yelocidade de sua replicagéo. O mimero de origens de re ‘ago depende do organismo, do tipo celular e ¢ regulado 20 longo do desenvolvimento. Esse niimero pode ser de uma gem a cada 3 ou 300 kpb (3 mil ou 300 mil pares de bas ‘Como exemplo, em um cromossoino humano médio exis, pelo menos, 200 pontos de origem. Como muitos genes atins replicam no inicio da fase S,€ possivel que o papel de origens de replicacio especificas seja 0 de coordenar a replicagio 60 DNA com a transcricdo dos genes. Caélulas eucariontes, 20 iniciarem a replicagio em vitss origens, apresentam entio muitas unidades dle repliisio distribuidas ao longo do genoma, as quais se denominam cons. Em cada niicleo de mamifero existem 20,000 a 300 réplicons. As tnidades de replicagio que iniciam simulans mente a sintese de DNA constittem as chamadas fami replicons (em inglés, replicon clusters), e diferentes fails destasiniciam em diferentes tempos. Cabe ressaltar que, a cada fase replicativa, todas as vl dades de replicagdo do genoma nuclear sio replicadas ¢ cada réplicon replica somente uma ver, dentro de um in? Biolog Clare Mog, sto DNA ¢ ealeulads em torno hia cle de 05 420 mm 00 bases/min). os icleos, dos. Com essa velocidade, jemo da molécula de DNA Jos vertebrados gastaria un cacdo. Caleula-se que seria ossomo_humano replica | possvel demonstrar que, a'molécula de DNA inicls mado origem de replica muleplas origens. Assim. ma de eplicar seu enorme ‘de Se superaram a bata mero de origens de repl po celular e € regulado 10 nero pode ser de ua oF "300 mil pares de bases). » humano medio exstem. so muitos genes atvO> el que 0 papel de origens pordenar a replicaga0 do a eeplicagio em varia unidales de replica ais sedenominam rp stem 20.000 2 3000 je iniciam simultane chamadas Familts 2 ae diferentes famias plicativa, todas as wa ar sao replicadas © a= 2, dentro de usm unis are Meise Ss impedindo outa letra da mesa orgem + Areplicacdo é bidirecional tia ve inicada a replica em cada pont de origem, case propaga para 0s dois lados da molecla de DNA, ous, em qualquer pont 2 os das cadets erm formagao dos replicons aacentes A ‘See movimento para lados opestos se denominou replicacso Snciona. Estudos radioautogriticns uo micoscepi ele cinco do cromossome de F. cll em dvisso mentraram que oragio de timidina-H? ocore principalmente onde wd flamentos de DNA da dupa helices separa. Eoses wc ma forma da letra ¥ esi chamados de forge de cplicagt0 (Figura 3). Areplicato bdiecional envolve dst ‘ruias de epleag, que se movem em dress oposss + Areplicacdo é semidescontinua A radlouutografa demonstra também que as dass cade paren da dupla helice vio, ambae, endo repadas ‘cada forquilha de replcagio que svancs. Como vere ‘tos mais adit a enzima rexponsavel pla polimerizaao do devoxirsibonucleotiios na sinese Jo DNA, a DNA Polimease,polimeriza somente na direio 5" 3, eto, Ebasan cadeis-fihas deve ser sinttzada a dies805'—> Mas, conforme fol expiado no Capitulo 3 o dae Bl inetos de DNA da hice dupla sto antparlels, it é um seks tema dreg $'—+ 3" 0 outro a dreto contra, 3» 5" Seas das cadet so antiparalelas, urge pergunrcomo is podem ser polimerizadassimltaneamenee a forgua

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