Técnicas de DNA Recombinante

Toda esta tecnología de DNA recombinante tiene que ver con que se tenga la capacidad
de poder aislar el DNA, purificarlo, identificarlo y poder recombinar y amplificar estos
genes. Para expresar se puede usar el mismo huésped de donde es el DNA o en un
huésped que sea heterologo (que sea distinto).
Por ejemplo si uno tomara un genoma humano uno podría virtualmente expresarlo en un
sistema bacteriano. A esto se refiere cuando dice a un huésped homologo o heterologo.
Homologo cuando coincide con el mismo organismo donde se crearon estos genes y
heterologo cuando se utiliza otro organismo.
(3)
com ose procede a esto.
A ese procedimiento uno normalmente lo que esta haciendo es clonación, y la clonación
a la que nos vamos a referir es una clonación de genes.
Ese procedimiento requiere de etapas.
1. Purificar y obtener este DNA. de buena calidad, ojala obtener DNA no
fragmentado y degradado, tener un DNA limpio sin proteínas ni otras moléculas.
una vez obtenido este DNA
2. Obtención de moléculas de DNA recombinantes. si queremos manipular este
DNA hay que hacerlo a través de poder cortar estas moléculas y unirlas con otra
molécula de DNA a través de un diseño prefijado. Una vez que tenemos esa
combinación de genes nuevos tenemos que introducir ese DNA a la célula.
3. Introducción del DNA a la célula. Hay que tener un buen método para que esto
ocurra. Hay que tener en cuenta que no todas las células recibirán este DNA por
eso hay que saber cuales lo reciben y cuales no. Una ve que tengamos algún
procedimiento para introducir el DNA debemos llegar a la etapa de
4. Selección de clones de interés. Donde hay que ver cual es la célula que tiene el
DNA que nosotros queremos.

(4)
Veremos como obtener este DNA híbrido.
Para obtener moléculas de DNA recombinantes se debemos usar los siguientes métodos
1. cortar, cortar secuencias que son específicas, no se corta en cualquier parte. Una vez
que esas secuencias están en fragmentos hay que
2. pegar, ver que estos fragmentos se puedan unir en una molécula continua.
3. copiar, una vez que tengamos esa molécula continua de DNA la célula debe copiar en
las células muchas veces.
Aquí tenemos las funciones básicas para obtener moléculas de DNA recombinantes.

(5)
¿Cómo cortar el DNA?
El DNA se puede cortar de muchas maneras. Hay buenas y malas
maneras, a que se refiere con esto a que por ejemplo si se aísla el
DNA el procedimiento de purificación hace que este se rompa por
fractura mecánica.
También se puede tratar con DNasas, que no tiene una
especificidad en el corte por lo tanto cada vez que se hagan estos
cortes tendremos fragmentos que no serán reproducibles. Por lo tanto este
procedimiento no nos sirve.

Una forma de hacerlo en utilizando enzimas que también son endonucleasas como las
enzimas de Restricción. En la metodología del DNA recombinantes para hacer cortes
específicos depende de la utilización de este tipo de enzimas por que los cortes que
realizan estas enzimas son en ciertas regiones definidas dentro de la molécula. El corte
lo hace reconociendo una secuencia, entonces si el DNA tiene la secuencia de
reconocimiento la enzima va a cortar a ese DNA y por lo tanto obtendremos fragmentos
reproducibles.

(6)
Estas enzimas que se llaman en forma genérica enzimas de restricción son
endonucleasas.
En el cuadro se ve una secuencia que tiene
una particularidad donde tenemos la primera
endonucleasa descrita que fue EcoRI.
Se ve esta secuencia

CAATTC
GTTAAG

Esta secuencia tiene una simetría de rotación y esta es la que se reconoce para cortar, el
corte es siempre en la misma posición dentro de esa secuencia.
El corte será donde se indica en las flechas, entre G y A. entonces cada vez que
tengamos esta secuencia tendremos un corte en el DNA.
La enzima de restricción corta en enlace.

Estas enzimas de restricción se caracterizan por que reconocen estas secuencias, pero
estas enzimas tienen una función dentro de la célula.
Para la célula esta enzima esta en una parte de una función que se llama Restricción-
Modificación. Primero que todo, ya se dijo que estas endonucleasas son sitios
especifico, que formen parte del sistema Restricción-Modificación significa que;
supongamos una bacteria de E. coli que tiene su genoma que produce esta enzima
EcoRI pero no cortan su propio DNA por que tienen un sistema de protección que se
llama Modificación. La bacteria modifica la secuencia de su DNa y la modifica
poniendo un grupo metilo en la secuencia, metila a esta adenina y al metilar ya no puede
ser cortado este DNA. El DNA que entra a la bacteria no esta metilado y por lo tanto lo
puede cortar.
La función de Modificación y de restricción están en la misma molécula, una parte de la
enzima hace modificación y otra parte la de restricción. Este es un problema para las
empresas que venden esta enzima, uno necesita que estas funciones estén separadas. Las
enzimas que se usan para este sistemas de DNA recombinantes tienen enzimas de
restricción en las cual las dos funciones (metilacion (modificación) y restricción) están
separadas. Lo que a uno le venden en un catalogo de enzimas en la función de
restricción.
¿es la misma enzima? No son dos distintas que forman parte del mismo sistema.
Una tiene actividad de endonucleasas y la otra la actividad de metilasa, juntas son el
sistema de Restricción-Modificación.
Estas enzimas son conocidas como enzimas de tipo II y son las mas útiles en sistemas
de trabajar de DNA recombinantes porque las dos funciones están separadas en
moléculas distintas y se pueden purificar independientemente una de la otra.

(7-8-9)
Entonces la enzima una vez que reconoce la secuencia la corta en dos sitios, el
DNA se separa y quedan dos colitas de hebra simple una para cada hebra. Estas
colitas son complementarias y son los que se llamas terminales pegajosos o
cohesivos.
Así que no solamente produce un corte específico sino que además produce un
Terminal cohesivo. Generalmente reconocen secuencias entre 4 a 8 pares de bases.
Vemos en el cuadro unos ejemplos de enzimas donde
cada enzima siempre reconoce el mismo número pares de
bases y cortan siempre en el mismo lugar (indicado en la
figura con flechas). Todas estas secuencias tienen una
simetría rotacional.

Dados los cortes, estas enzimas producen terminales

pegajosos pero también hay enzimas que no hacen el
corte desfasado (como la figura anterior) si no que lo
hacen en la misma posición en las dos hebras
generando lo que se llama terminales Romos.

Las siglas de la enzima significa por ejemplo

para EcoRI, la E representa al genero en este
caso Echerichia, la co s de coli que será la
especie, R representa la cepa y el I (numero)
el sistema de transcripción que tiene.

Una cosa que puede ocurrir es que cuando se tienen dos enzimas por
ejemplo SmaI y Xma I que reconocen la misma secuencia pero hacen
cortes distintos se le llaman isoesquizomeros.
También puede ocurrir que se produzca un extremo compatible, en este
ejemplo dos secuencias que no son idénticas. Si cortamos con enzimas
distintas cortaran en lugares distintos pero si nos fijamos en los
nucleótidos que hay en el medio vemos que son iguales, entonces estas
dos enzimas dejaran las mismas colas al cortar y si vemos el detalle nos
daremos cuenta que estos extremos se pueden pegar o son compatibles.

(10)
Ahora vamos a pegar el DNA cortado.
Tenemos dos situaciones, moléculas lineales. Una molécula A y
otra molécula B. tenemos el sitio de reconocimiento para una
enzima de restricción, las dos moléculas deben tener la misma
enzima de restricción por que si no es así no serán compatibles,
se forman los extremos pegajosos o compatibles. Y ahora, en el
tubo de ensayo se podrá hibridar, se podrán pegar. Estos
extremos no están unidos covalentemente, para poder sellar hay
que ligar con la DNA ligasa y ahí tendremos unido covalentemente esas dos moléculas
de DNA. Hay que dejar a estas dos moléculas para que se formen los puentes de
hidrogeno y se pueda sellar, para luego tener el
recombinante.

Lo mismo ocurre para una molécula circular y una

molécula lineal. También se debe tener para las dos la
misma enzima de restricción para que tengan
extremos pegajosos. Se corta la molécula lineal y
circular, se forman los terminales cohesivos para
luego el pedazo de DNA lineal entre al circular y se
una. Si nos fijamos en el dibujo hay un pedacito que
no esta unido entre el DNA lineal y circular, esos son
enlace que no están unidos que se ligan con DNA
ligasa. Y finalmente tenemos una molécula que es
recombinante por que tiene DNA de dos orígenes
distintos. Esa molécula circular por ejemplo puede
ser un plasmidio.

(11)
Copiar el DNA significa hacer varias copias de las secuencia.
Habíamos hablado que un DNA dentro de la célula tiene ciertas señales para que se
replique. La manera de que tenga estas señales el DNA que queremos copiar varias
veces conviene colocarle un vector que es una molécula que para el caso de este
ejemplo en una molécula circula, insertarle ahí el DNA de interés. Este vector de interés
puede ser un plasmidio, el plasmidio es un replicon por lo que cualquier cosa que lleve
este plasmidio se va a replicar.
Es importante saber como elegir estos vectores. Estos vectores deben tener la
particularidad de llevar y amplificar, replicarse y replicar el DNA que llevan. Y este
DNA que llevan es un DNA exógeno a este vector y a la célula.
Este vector puede ser plasmidios, fago o virus, o también recombinaciones (mezclas
entre fagos y plasmidios) que estén funcionando como vector.

(12)
Veremos el protocolo genérico, es la forma en la cual uno debería
trabajar.
Debemos tener nuestro DNA, y queremos hacer clones de mi DNA de
interés para eso lo corto con una enzima de restricción y lo inserto en un
vector. Para insertarlo con la misma enzima de restricción y colocarlo en
el mismo tubo de ensayo.

(13)
Aquí tenemos lo que estaría sucediendo exitosamente, tenemos el
vector (azul y nuestra secuencia que queremos insertar. Vemos
los extremos compatibles de hebra simple donde ocurrirá la
hibridación molecular.
Esto es la Reacción de ligamiento. Tiene una particularidad la
reacción de ligamento, es que de partida se necesita la enzima
para que liguen estos sitios. Para que esto ocurra se debe poner
en muy bajas temperatura para favorecer el ligamiento, la
temperatura se baja de tal forma que la enzima aun este
funcional (10-12ºC).

(14)
Ahora veremos como no se recirculariza el vector, lo que
se hace es que al vector se trata con una fosfataza para
evitar que se recircularse. Se les saca los extremos 5
prima fosfatos con una fosfatasa y queda como grupos
OH.
Una vez que el DNA esta pegado a un vector hay que como ingresa este vector a la
célula.

(15)
Ahora como entra el DNA recombinante a la célula. Nosotros tenemos
nuestro vector recombinante con el DNA exógeno que queremos
replicar. Tenemos plasmidios y células competentes a las cuales vamos a
introducir este plasmidio. Pero estas células son competentes artificiales.
Una forma de introducir este DNA es mediante un shock térmico
durante un par de minutos y el DNA entraba.
Ahora lo que más se usa es la electroporacion. Se le da un pulso
eléctrico que permite reorientar las moléculas y cuando se reorientan se
producen poros en la membrana por donde penden entrar estos DNA.
Entonces estas mezclas de ligamientos se ponen en contacto con la
célula competente y lo que uno espera que en algunas de estas células
ingrese este DNA.
Ahora el siguiente desafió es que pasa cuando tenemos células donde
han ingresado el plasmidio pero este no tienen el inserto que yo quiero
replicar. Hay que ser capaces de reconocer cuales tienen el inserto y
cuales no.

(16)
En eucariótico como tenemos células más grandes se puede ingresar
el DNA a través de un campo eléctrico, mediante una micro
inyección. También se pueden bombardear las células en que
tenemos micro esferas que se recubren con DNA.
Estos métodos por lo general están hechos para eucariontes, en
bacterias lo que se da generalmente es la electroporacion.

(17)

Cuando el DNA entra se utiliza el vector con un gen que permita rastrearlo en aquellas
células que lo tienen, por ejemplo rastrearlo mediante un gen de resistencia a algún
antibiótico. Aquellas células que integraron el plasmidio llevaran la resistencia al
antibiótico y las otras como no lo tienen morirá.
Tengo que ver donde puedo colocar el inserto, aquí juegan un rol importante los sitios
de restricción. A mi me convienen tener solo un sitio de restricción en el vector pero
tengo que ver como sigo estos sitios y ver cual tiene el inserto.
Por ejemplo si tenemos un plasmidio en el cual tenga dos resistencia por ejemplo a
ampiciliona y a tetraciclina. La célula que no lleva vector será sensible. Por lo tanto si
pongo a las dos células con antibióticos me deshago de las que no tengan el vector.
Entonces si yo tengo las dos resistencias y pongo el inserto entremedio del gen de la
tetracilcina ya no se podrá expresar esta resistencia y por lo tanto tendré que esta
bacteria será resistente a ampicilina pero como tengo el inserto de DNA en el gen de
tetracilcina será tetraciclina sensible, de esta forma las podré seleccionar.
Si pongo las cepas en medio mínimo con ampicilina tendré todas las cepas que tienen el
vector integrado junto con el DNA. En la segunda placa yo pongo a crecer en medio
mínimo junto a ampicilina y además junto a tetraciclina y encuentro todas las células
que son resistente a tetraciclina, si embargo yo quiero encontrar las células que tienen
integrado el vector y en el cual el gen que yo integre este entre el gen de tetraciclina y
por lo tanto no lo este expresando. Así que la colonia que me crezca en la palca 2 no me
sirve. Pero como yo ya conozco las células que no integraron el gen de DNA entre la
tetracilcina yo selecciono ahora las que no crecieron en la placa 2 y las pongo en un
medio mínimo con ampicilina y esas serán las que tienen el gen que yo quería integrar.

Placa 2 Placa 3
Placa 1

Los círculos son las colonias que crecieron, los círculos con una barra no las colonias
que no crecieron.

Los palsmidios que interesan son los que son pequeños. Estos
plasmidios pueden entrar por conjugación o por transformación.
Casi todo el DNA recombinante entra por transformación.

(20)
Aquí tenemos un plasmidio llamado pUC18/19. El tamaño es
pequeño. Mientras más pequeño es mucho más fácil de manipular. Tenemos el ori y un
gen de resistencia y un fragmento de DNA lacZ . Este gen expresa β-galactosidasa,
además en el inicio del gen hay una regio azul que es un sitio de clonación múltiple, este
pedazo se a colocado para que tenga sitios de restricción para muchas enzimas y estos
sitios sean únicos.

Técnicas del DNA recombinante 2009; 2º parte

22) Además de los plasmidios se pueden usar otros vectores y estos pueden ser
bacteriófagos. Se ejemplificara esto con el fago lamda. El fago lamda posee una cabeza
icosaedrica una cola y “patitas”. El fago lo que hace es que infecta a coli, inyectando el
DNA en la bacteria y este posteriormente puede seguir el ciclo litico o el ciclo
lisogénico, el cual es un sistema que involucra a los genes del DNA viral. Este es un
genoma bastante grande comparado con algunos plasmidios vistos en la clase (este
posee alrededor de 50kb).

Vamos a ver como se genera este vector desde el bacteriófago lamba. Lo que se quiere
en esta clase es que ese entienda como es el ciclo, no en sus particularidades, sino que
ver que propiedades hacen que este bacteriófago sirva como vector.

23) Este es el genoma de lamba y la zona marcada dice cos. Cuando el fago infecta a la
celula, el DNA que esta al interior de la cabeza del fago es lineal, dentro de la cápside;
cuando ingresa a la célula, posee extremos cohesivos, por lo cual se circularías, y esto se
completa; a esto se les llaman sitios cos, los cuales son secuencias complementarias los
cuales permiten la circularizacion del fago. Nos interesa en esta clase ver el ciclo lítico.
Este fago va a replicar y cuando replique este genoma va a hacerlo mediante el modelo
del circulo rodante y se van a hacer muchas copias en forma de concatemeros
(secuencia genomicas completas juntas, con sitios cos en los extremos y separando las
repeticiones). Cuando el genoma viral se empaqueta en al cápside en el ciclo lítico ¿que
es lo que reconoce para saber que ingreso un genoma completo? R= reconoce el sitio
cos, el cual posee una endonucleasa que corta. Después que se completa la cabeza se le
agrega la cola. Reflexionemos; ¿que es lo que reconoce el fago para encapsidar el DNA
viral? R= el sitio cos, nada mas. Esa es una posibilidad de usar un vector a partir de
sitios cos. También se podría usar el fago lamba en su forma lineal. El sito cos es solo
un sitio de corte, ni siquiera es el sitio por donde se inserta el fago. Supongamos que
usaremos este vector como vector de clonación, este es un fago lineal (en la actualidad
no se usa).
Se puede insertar un fragmento de DNA en el DNA viral. Lo que se hacia es que este
DNA se insertaba en la parte medial, este es un DNA lineal que posee un extremo
derecho y uno izquierdo y estos se proporcionaron por separado (uno estaba hecho y el
otro fue agregado artificialmente).El DNA para ingresar a la cápside posee una
limitación de tamaño. Entonces lo que se hacia es que mirando el genoma, y lo que se
hacia era reemplazar los genes líticos por el segmento genómico que uno quería agregar.
Uno podría hacer algo mejor: reemplazar todo el genoma, dejando solo los sitios cos, lo
cual es relevante para la encapsidacion.

26, 27)Cosmidios: segmento genómico con sitios cos. Es un plasmidio pequeño que
posee un origen de replicación. Uno puede realizar enpaquetamiento de DNA in Vitro,
poseyendo todos los componentes estructurales virales. Esto posee una enorme ventaja
para hacer una librería genética, porque aquí hay una gran cantidad de DNA que puede
ser incorporado en estos sistemas. Aquí esta lo del sitio cos. Se muestra el empaque en
condiciones naturales e in Vitro. En condiciones naturales, el fago hace una precabeza
abierta para ingresar el DNA, hace la cola,( partes) y las patitas. Por lo tanto existe un
sistema de ensamblaje para tener el genoma completo. Si tengo el DNA las cabezas y la
enzima que ingresa el DNA a la cabeza ¿que DNA se va a empacar? R= Aquel que
posea los sitios cos a una cierta distancia que sea la distancia a la cual originalmente se
encontraba en el fago y con eso se puede empacar cualquier DNA.

El cosmidio es el de color rojo que tiene un gen de resistencia, un origen de replicación

y los sitios cos, posee un sitio de inserción. Es muy pequeño. Si uno lo corta; además
cortamos el DNA de interés que está en otra parte.

Entonces lo que se quiere es insertar el genoma de interés inserto en el genoma viral, y

la mejor forma es que lo haga a partir del bacteriófago, por su mecanismo natural de
inserción, ya que el genoma es muy grande. Entonces en la mezcla de ligamiento uno va
a tener, yo les dije que todas las posibilidades se daban (ej. se puede ligar un pedazo con
otro). Lo que interesa es que se liguen un plasmidio- un inserto, otro plasmidio-otro
inserto y otro plasmidio, ya que si el inserto queda flanqueado por dos plasmidios, cada
plasmidio posee un sitio cos, y le puse un genoma similar al tamaño del fago por lo cual
los sitios cos van a quedar lo suficientemente separados para que el sistema crea que
todo eso es el genoma y lo integra. Entonces lo que yo ahora voy a seleccionar no va a
ser el circular, se va a producir igual pero nadie lo va a empacar, lo que empaca es el
DNA lineal que queda flanqueado por los sitios cos. El fago empaca por tamaño, si los
sitio cos están muy cercanos no va a empacar, se hace inviable. Cuando ingresa el DNA
a la cápside el sistema cos corta, y lo que se tiene ahora es el segmento de genoma
inserto, no hay DNA de virus. Cuando el fago inyecta este segmento de DNA a la
célula, este se va a circularizar. Es casi imposible que esto entre por transformación, ya
que es muy grande, y lo mas seguro es que se rompa. Esto se usa para hacer genotecas,
para hacer una librería génica de un DNA cualquiera; se usan los sitios cos. Lo que se
hace en un plasmidio es clonar el sitio cos. El sistema cos lo que permite es obtener
fragmentos grandes (del tamaño del fago ≈ 50 kb) para hacer la librería génica.

Se tienen los sitios cos, este es un cosmidio con un inserto de DNA aquí y un cosmidio
en el otro extremo (bastaría solo con tener los sitios cos), y se encapsida al interior del
fago y ahora este fago infecta a la célula y para infectar lo único que necesita es tener la
estructura necesaria. Adentro el DNA lineal se circularíza ya que posee extremos
cohesivos cos y se comienza a replicar. Cada uno de estos fagos va a recibir un clon
distinto y va a concebir un clon diferente. Nosotros podemos encontrar colonias
resistentes a un antibiótico (ej tetraciclina) que poseen muchos plasmidios. Todas las
células que son resistentes a tetraciclina poseen el inserto.

28) Lo que se tiene aquí son los tamaños del genoma haploide desde las bacterias hasta
los mamíferos. Se ve que para hacer genotecas se necesitan mas clones en los
genomas de mamíferos, los genomas de bacterias necesitan menos clones. Depende del
vector la cantidad de inserto que puede soportar el sistema.
Un plasmidio convencional puede aceptar tamaños mas grandes de DNA ≈ 90kb, pero
va tender a ser menos eficiente cuando uno haga una genoteca.
Se muestran los rangos de tamaño de segmentos de genoma que acepta cada plasmidio.
Aquí están los cosmidios, “los YAC”: vectores que soportan cantidades mucho mas
grandes de DNA, son plasmidios, en realidad son cromosomas artificiales de levadura,
pero derivados de plasmidios de levadura.

29) Entonces como uno construye una genoteca representativa? R= Este es el genoma,
ustedes lo fraccionan y lo insertan en un vector, se inserta a la célula y se espera que las
colonias que crecen tendrán inserto el plasmidio con el segmento de interés, cada una de
las colonias va a representar un clon con una de estas moléculas recombinantes. Si este
genoma es muy grande se necesitaran muchos clones. Depende del tamaño del genoma
(del inserto) el numero de clones que se va a necesitar (mas pequeño-mas clones).Uno
puede hacer una estimación de cuantos clones necesita para que sea exitoso. Se puede
dar el caso que uno tenga la gran mayoría de la genoteca en clones pero no tener el gen
de interés (ej. si son genes de una sola copia, puede que no estén en algún clon). Hay
métodos para hacer que esto resulte.
30) Esta es una formula que nos dice cuanto clones se necesitan para poder realizar una
genoteca que sea representativa, y la mejor probabilidad con la que puedo encontrar un
gen es XXXX. Por lo tanto yo me impongo esa condición para saber cuantos clones se
necesitan para realizar la genoteca. Esto también depende del fragmento que voy a
clonar, si es un fragmento pequeño necesita muchos clones, y depende del tamaño del
genoma que voy a clonar, si voy a hacer la genoteca de un genoma muy grande se
necesitaran mas clones y si el genoma es pequeño se necesitaran menos clones. Por lo
tanto se necesita conocer el tamaño del genoma y el tamaño del inserto promedio.

Para la genoteca de lamba con un tamaño promedio de inserto de 17kb y un genoma de

estas características se necesitarían 800.000 clones para tener la probabilidad de tener
todos los genes representados. Para el mismo genoma con un tamaño promedio de
inserto de 30kb se necesitan 46.000 copias.
Pregunta: el tamaño promedio del inserto tiene que ver con el tamaño de los genes en
ese genoma? R= No. Tiene que ver con lo que tú cortaste. Se selecciona un cierto
tamaño.

31)Que mas se necesita para realizar esta clonación?. Cuando uno quiere clonar un gen
de interes, un gen especifico ej. De una cierta ruta metabólica de un cierto genoma.
Hay dos posibilidades: una es que se hace la genoteca y se busca el gen de interes y otra
es buscar otra alternativa para obtener el gen de interes. Se pueden hacer fragmentos
genómicos a partir de productos de PCR. En es casop de la genoteca, se puede hacer una
sonda la cual se inserta en los distintos clones y ver cual de ellas se encuentra el gen de
interés, pero para hacer esto se necesita conocer algo del gen. Para saber algo se buscan
genes homólogos u ortólogos en las bases de datos existentes por alineamiento (se
buscan secuencias compartidas por linajes distintos). También se podría buscar un gen
que se estuviese expresando en una célula de forma magnificada. (Gran cantidad de
mensajero). Cuando son genes de una copia la célula puede hacer que estos magnifiquen
su expresión. Por lo cual uno puede hacer un cDNA que es complementaria a esa copia,
y con eso se tiene el gen

Entonces uno puede usar

1-. Fragmentos genómicos directamente de DNA
2.-Sacar productos de PCR
3.- hacer copias de DNA utilizando el mensajero.

32) Se pueden hacer cortes con enzimas de restricción de lo que a uno le interesa, y no
hacer un tratamiento de corte inespecífico. Se corre un gel (ver figura) y se ven las
bandas. El DNA debe estar bien arriba comparado a los marcadores de peso molecular.
En las bandas se ve DNA lineal.
 Para poder aislar no se puede tomar todo lo que se clono, ya que lo que se va a obtener
son fragmentos pequeños y estos se van a insertar eficientemente en sus plasmidios,
estos plasmidios van a transformar en la bacteria y vamos a tener una colección de
fragmentos chicos. Entonces hay que deshacerse del plasmidio; lo que se hace es extraer
el fragmento y sacar del gel el fragmento que le interesa (se selecciona por tamaño).

33)Si por el contrario se tiene información del gen y se pueden realizar partidores, uno
puede hacer PCR. Se tiene partidor forward (directo) y reverse (inverso) para poder
amplificar esto, que es la zona que flanquean los partidores, como resultado se tendrán
muchas copias de este gen. Se tiene una forma distinta de copiar, ya que se esta
amplificando selectivamente una región del genoma, pero esta región solo puede ser
mantenida en el tiempo en una bacteria.

34)Otra cosa es preparando cDNA. Se selecciona el mensajero, se crea un hibrido de

DNA de ese mensajero, insertarlo a la célula que posea el mensajero de interés en gran
cantidad, se genera un hibrido DNA-RNA, la enzima transcriptasa reversa (la cual es
utilizada comúnmente por los fagos), la cual se agrega junto con el DNA, por lo tanto
hay una forma de deshacerse del RNA, el cual es mas sensible a condiciones alcalinas y
a cambios de temperatura, y uno puede hacer lo que se conoce como una autoiniciacion,
el mismo terminal debe permitir hacer eso. Hay otras formas en que se puede hacer la
síntesis de la doble hebra ej. A través de la acción de la RNAsa, la cual solo corta RNA
generando nicks. Con lo cual la DNA Polimerasa I hace reparación de eso (acordarse de
que la DNA polimerasa I para replicar el DNA utiliza un partidor de RNA, por lo tanto,
no es de extrañarse).
35)En este otro caso hay una optimización se tiene un fragmento de la DNA polimerasa,
que posee actividad polimerizante, los nucleotidos, la doble hebra, una nucleasa (S1)
que rompe el DNA de hebra simple y aquí se tiene finalmente el fragmento de DNA ,
esto es una copia complementaria de cDNA que corresponde al mensajero que se tenia
inicialmente.

36) Esto se puede clonar, para lo cual estas deben poseer terminales y si no tienen se le
ponen los terminales para clonarlo en un vector especifico (colocarle colas de poli A y
al vector colocarle en sus extremos lo complementario a esto para que se una el
fragmento al vector y asi poder clonarlo), o se puede colocar una DNA transferasa la
cual va adicionando nucleotidos, generando una cola. Otra cosa es agregarle al cDNA
en los extremos algo que se conoce como linker (los bloques que se ven en la figura).
Son secuencias muy cortas donde adentro de esto esta la secuencia de reconocimiento
de una enzima de restricción, estas se adhieren a los extremos con DNAligasa, esta es
capaz de catalizar el alineamiento de moléculas romo, se pueden pegar 1,2 3.. etc.

Pero cuando esto lo digieren con la enzima de restricción, nos vamos a quedar con lo
que quedo ligado, lo demás se digiere. Con esto se logra tener un fragmento de DNA
con los extremos cohesivos para insertarse en un vector. Porque s bueno obtener el
cDNA?= no solo porque uno puede obtener el mensajero, ej. Si se tiene un gen
eucariótico el cual se quiere clonar en una bacteria, la bacteria hay cosas que no hace,
no puede procesar el gen, si se coloca un gen que posee intrones, no se puede procesar,
por lo cual es bueno colocar el cDNA ya que con esto se tiene a la vez el mensajero
procesado, con lo cual se obtendrá un producto génico funcional.

37) Como se selecciona, se tiene que conocer algo de la secuencia especifica, con lo
cual se puede hibridar inmediatamente el gen y detectarlo en clones. Si se coloca el
segmento de DNA en un vector de expresión, se puede replicar, transcribir y obtener un
producto genico del gen. Al tener la proteína se puede utilizar un anticuerpo o antisuero
específico (monoclonal o policlonal, este ultimo reconoce el producto génico) ó se
puede realizar una complementación. Supongamos que buscamos un gen de leucina, lo
tenemos clonado (eso es lo que se cree) y yo ahora tengo mi celula, muchas celulas con
muchos plasmidios y uno de ellos posee el gen de leucina (es una genoteca), nosotros
debemos seleccionar esto, o sea, identificar el clon. Entonces se transforma esta célula,
pero a esta celula se le hace el siguiente supuesto: que este gen es capaz de expresarse al
interior de este huésped. Si se coloca esto en un medio sin leucina uno ve que si esto
complementa, esto crece, si esto no complementa porque tiene eso entonces no va a
crecer. Lo que se esta haciendo aquí es que el producto génico que esta aquí
complementa la función deficiente que acá esta mutada. Esta es otra manera de poder
seguir estos clones. Si eso no ocurre, si yo no tengo esta construcción, yo podría seguir
porque el producto génico igual se va a formar acá, y voy a tener en alguna parte una
proteína, a la cual puedo rastrear. El gen, si solamente se replica y no se expresa, puedo
rastrear la proteína si se expresa, os i tengo la suerte de que ocurra la complementacion,
aunque se deben hacer las pruebas para ver si esto ocurre.

38)Ustedes tienen aquí las colonias, los clones, cada uno formando una colonia en una
placa, entonces uno hace una copia de eso en una membrana, vale decir, se coloca la
membrana arriba y se transfiere, con tal que la colonia quede pegada y luego uno la lisa,
transferida, y se filtra el DNA. Por lo tanto se tiene el DNA fijo a la membrana y uno lo
que hace es realizar una prueba radioactiva (una sonda de DNA, por lo cual previamente
se conoce algo de la secuencia que uno busca). Uno espera que la sonda se pegue al
DNA, por lo cual previamente debo desnaturalizar el DNA para dejarlo de hebra simple
para que asi sea reconocido por la sonda. La sonda buscara el sitio con el cual ella
hibridiza. Se lava todo lo que no se haya pegado y lo voy a poner sobre una placa de
radiografía, para que me deje una marca (ya que son isótopos radioactivos) para asi
saber en que colonia se encuentra la secuencia que busco (se coloca un punto de
referencia en la placa radiográfica, para saber que es qué y compara con el original).
39) Supongamos que esto se expresa, uno toma el mensajero o el DNA total, uno hace
un gel con el RNA con el DNA, este gel se transfiere a una membrana de nylon, se fija,
y ahora en vez de colocar ese molde que se tenia equivalente en la placa, se coloca la
copia que tenia el primer gel, se incuba con la sonda radioactiva, el cual se va a unir
solo a un sector de este gel, por lo tanto en esa colonia se va a estar expresando el gen
(si se hace sonda de RNA) o va a estar presente el gen (si se hace sonda de DNA). Si se
hace el tratamiento con DNA el Sourthen Blot y si es con RNA Northen blot. También
existe el Western blot para el caso de las proteínas.

40) Se puede hacer la replica de los clones en una placa en una membrana, se va a
romper las células y después incubar con un anticuerpo para saber donde se expresa una
proteína en particular. Y la unión del anticuerpo a una colonia va a ser observada por un
ensayo enzimático o por fluorescencia.

Pregunta: Profe, me perdí en la parte de la proteína, puede explicarla?

R= Es que tu cuando tienes esto aquí, este es tu vector con tu inserto, lo que siempre
ocurre es que e inserto se va a replicar a expensas del vector, entonces lo que uno
normalmente registra es el gen, porque de seguro que si esta de verdad funcionando el
gen se esta replicando, entonces para eso se usa un DNA ( creo que dice Sourthen blot.
..no se entiende muxo) , pero si tu haz colocado el fragmento en un vector que tiene
señales para que esto se exprese, es decir para que se transcriba y luego se traduzca, tu
podrias seguir el mensajero ( Northern blot), e incluso podrias ver la proteina en esa
placa( western blot), con un anticuerpo.
Electroforesis en gel: esto no lo pasa ya que dice que esto lo sabemos.

42) Como migra el DNA en un gel?

Lo que se hacia hace tiempo es que para determinar el tamaño se utilizaba un ladder con
secuencias lineales y no circulares. Ya que si eran circulares representaba una
complicación, ya que este se puede romper; Por lo tanto siempre estas moléculas son
lineales y se grafican estas moléculas con respecto a la distancia que se tiene al origen,
es decir, desde donde comenzó a migrar (movilidad electroforetica), y esto es el
logaritmo del tamaño, y esto no es una línea recta, ya que hay moléculas que migran
mas rápido, es decir , la distancia no es lineal entre una que migra menos y una que
migra mas ( 23130 y 2322) por lo tanto uno grafica en logaritmo para tratar de linealizar
esta función. Lo que hace un programa de computador es que interpola con respecto al
los pesos moleculares estándar del ladder. Uno puede hacer una aproximación mirando
al ojo el gen pero no una aproximación exacta.

43) Y porque tiene que ser lineal y no circular?

El DNA circular puede migra de dos formas: una es que migre superenrrollado, en la
cual se va a producir una mayor migración, y la otra es que migre relajado ( que posea
un nick que lo desenrrolle), la cual migra menos que el superenrrollado y distinto a
como migra el DNA lineal. Por lo tanto depende del tamaño y de la conformación el
como migre el DNA. Por eso siempre se usa el DNA lineal.

44) Secuenciamiento: Antes se hacia con dideoxinucleotidos para las cuatro bases (A-
G-T-C), los cuales al agregarse se detenía la reacción de replicación con lo cual uno
hace un mapa para saber que nucleotido se agrego en una posición.
45 y 46) Ahora lo que se puede hacer son cuatro reacciones en uno utilizando
terminadores marcados por fluorescencia ( nucleotidos A-T-C-G marcados
fluorescentemente), cada fragmento terminal lo que va a poseer es un color, que es la
fluorescencia que tiene en el nucleotido terminador fluorescente, entonces lo que se
hace es medir con el láser el cual lo que ve es la fluorescencia y a medida que va
corriendo va viendo tamaño. La diferencia es que detecta la diferencia entre una base y
otra, cosa que no es capaz de detectar un gel, que también es una electroforesis.
Transposones
1-Se observan los pétalos manchados y
también granos de maíz con fenotipo
moteado. También es posible ver un placa
de con E. coli en la cual la mitad de las
colonias tienen un color y la otra mitad tiene
otro diferente. Así estos fenotipos peculiares
son producidos por un tipo de
recombinación especial, diferente a la que
ya hemos visto (recomb. Homologa). Estos
fenotipos se deben a una recombinación
sitio específico, que la diferencia de la
recomb. Homologa, puede ocurrir por ejemplo tanto en cepas Rec A+ como en cepas Rec A- por
lo cual esta recombinación sitio especifica es independiente de Rec A. Así esta recombinación
puede ocurrir incluso en cepas que están privadas de poder hacer recombinación homologa.
Los elementos responsables de esta recombinación son los llamados elementos genéticos
transponibles (EGT), dentro de los cuales encontramos por ejemplo las secuencias de
inserción y también los transposones. Los EGT primero se conocían como “genes saltadores”.

2-Existen dos tipos de recombinación principales: uno es la recombinación homologa también

conocida como recombinación general. Esta se caracteriza por un alto grado de homología
entre las moléculas parentales. Opera para todas las secuencias de DNA. También porque une
segmentos de DNA, sustituyendo un homólogo por otro y crea nuevas colecciones de genes. El
otro tipo es la recombinación sitio especifica, la cual no obedece reglas de homología pero es
integrativa. El evento de recombinación ocurre entre moléculas de DNA con poca o ninguna
homología. La ubicación del evento recombinacional tiene una posición preferencial en una o
ambas moléculas parentales. Ex: inserción y escisión del fago λ. En este tipo de recombinación
podemos encontrar la simple y la doble. En la simple tenemos un evento altamente localizado
con respecto a una molécula parental, pero no con respecto de la otra. Ex: Inserción de
bacteriófagos Mu, también los Tn (transposones) y las IS (secuencia de inserción). Así podemos
ver que los bacteriófagos se considerarían EGT, de hecho el bacteriófago Mu se dice que es un
transposon disfrazado de bacteriófago, porque este se puede encontrar como partícula viral
pero su genoma es un EGT y su replicación depende de su transposición. Por otro lado la doble
sitio específica consiste de un evento de crossover altamente localizado en las dos moléculas.
Ex: Inserción y escisión del fago λ. Inserción del plasmidio F en ciertas Hfr. También hay otro
tipo de recombinación pero que ocurre en muy baja frecuencia, que es la recombinación
ilegitima, la cual al igual que la anterior es integrativa y no homologa (o muy poco homologa),
pero no es sitio especifica, sio que los EGT se insertan en regiones al azar del genoma. Nos
centraremos en la recombinación sitio específica simple, a la cual pertenecen las secuencias
de inserción y también los transposones.

3- Transposición: Es un fenómeno de recombinación que se aparta de las normas generales de

la recombinación, pero está ampliamente distribuido entre la mayoría de los seres vivos (de
hecho está asociada a la activación de ciertos genes de funciones claves en la célula). De este
modo no requiere homología ni la maquinaria asociada a Rec A.
Elementos génicos transponibles: Son piezas discretas de DNA, como las secuencias de
inserción y los transposones, que normalmente constituyen el genoma de un organismo y se
mueven a diferentes sitios. Así estos elementos tienen la capacidad de “saltar” de un lugar a
otro en el genoma. De este modo el fenotipo de esta flor se debe a la segregación de ese
marcador a causa de esos saltos, los cuales no se rigen por las leyes de Mendel, sino que a esos
cambios de posición.

4- La transposición comenzó a ser descrita en la mitad del siglo pasado por Barbara
McClintock. Ella trabajo con granos de maíz con fenotipo moteado (foto). Al comienzo no le
creyeron el hecho de que existieran genes saltadores razón por la cual gano el Nobel muchos
años después cuando se confirmo que era cierto. Sus estudios se basaron en las típicas
proporciones en las descendencias, viendo los patrones de herencia obtenidos de los
respectivos cruces, llegando a la conclusión de que los genes encargados para ese fenotipo
tenían la capacidad de saltar por el genoma.

5- Los primeros ejemplos de elementos de inserción en bacterias fueron reconocidos en un

laboratorio cuyo interés principal era estudiar la regulación génica. Trabajando en el estudio
de mutaciones en operones encontraron que se producían mutaciones inesperadas, ya que
estas no eran producto de sustituciones de bases ni deleciones,tenían una alta reversión
espontánea (una tasa de 10-3 y 10-4, cuando la tasa de reversión espontanea normal es de 10-
6
),no revertían en presencia de mutágenos, ejercen fuerte efecto polar sobre la expresión de
otros cistrones (esto porque esta mutación que afectaba a uno de los genes del operon
también afectaba a los genes vecinos de este operon pero sin había gradiente de polaridad (el
mismo efecto para los vecinos). Esto también se conoce como mutaciones con efecto
pleitropico, es decir, mutaciones que afectan a más de un gen. Finalmente concluyeron que
estas mutaciones eran causadas por la inserción de piezas discretas de DNA con un tamaño de
0,7 a 1,4 Kb.

6-¿Qué experimentos se
deben hacer para
demostrar que realmente
estas mutaciones se deben
a la inserción de piezas
discretas de DNA? Si ocurrió
una inserción de segmentos
de DNA en un DNA blanco,
uno esperaría que este DNA
con la mutación
desconocida aumentara su
tamaño o complejidad en
comparación al DNA no
mutado. Así el grupo de
investigadores de los que
hablábamos recién, estudiaron esto trabajando con mutaciones en el operon gal para lograr
demostrar la existencia de los EGP en estas mutaciones. Entonces ellos tenían varias cepas con
distintas mutaciones en el operon gal (S101, S104, etc), las que eran sospechosas de ser
mutantes causadas por transposición ya que reunían todas las características que vimos en la
diapo 5. Lo primero que hicieron fue construir un bacteriófago transductor (capaz de
insertarse en un genoma blanco y luego escindir y llevarse parte del genoma bacteriano). Este
bacteriófago posee el operon gal silvestre y se denomino λdgal+. Entonces lo que se hizo fue
infectar con este fago, bacterias que presentaban la mutación en operon gal (E coli gal-). De
este modo si la mutación de esta bacteria gal- era causada por los EGT, se esperaría que el fago
λdgal+ con el que infectamos esa célula, tenga ahora un genotipo E coli gal-/ λdgal-, es decir,
la bacteria gal- le traspaso la mutación al fago λdgal+, o mejor dicho, le traspaso ese gen
“saltarin”, lo que demostraría la presencia de estos EGT como causantes de la mutación. Para
demostrar esto se hicieron análisis del tamaño o complejidad del DNA del λdgal-,
comparándolo con el fago λdgal+ (parental), encontrando que el λdgal- es de mayor tamaño
que el λdgal+. Para esto se tomaron ambos tipos de fagos y se centrifugaron en una gradiente
de cloruro de cesio y luego se compararon las densidades de los respectivos genomas (como se
ve en el grafico de patrón de bandeo) observando que el fago λdgal- es más denso que el fago
parental. Esto permitió demostrar que el fago λdgal- adquirió una pieza de DNA. A la vez se
hizo otra prueba para comprobar esto, la que consistió en tomar el fago λdgal+ y mutarlo con
luz UV, pero al realizar las pruebas de densidades de DNA del mutante obtenido, se observo
que el DNA de este tiene la misma densidad que el DNA del fago parental. Esto demostró que
la mutación que se estudiaba no era causada por múgatenos. En cambio cuando se ponía el
fago λdgal+ con las bacterias con las mutaciones S101, S104,etc los fagos mutantes obtenidos
si presentaban el cambio de densidad en su DNA lo que da más apoyo a la idea de la existencia
de los EGP. La última prueba realizada fue la de usar revertantes para el fago λdgal- ,
obteniendo densidades de DNA que bandearon igual que los parentales. Todas estas pruebas
permitieron concluir con total certeza que las mutaciones en las cepas de E coli S101, S104,
etc eran provocadas por la presencia de EGS.

7- ¿Cómo se puede hacer para lograr diferenciar ese segmento de DNA insertado causante de
la mutación? Se hace VIENDO,
con el uso de la microscopia
electrónica. Lo que se hizo fue
aislar el DNA del fago parental
λdgal+ y también del fago con
el supuesto EGT, el fago λdgal-
. Se separan sus hebras de
DNA y luego se permite que
los DNA se reasocien
formando en muchos casos “heteroduplex” (DNA doble hebra hibrido con una hebra del fago
λdgal+ y con la otra hebra del fago λdgal-). Cuando se formaban estos heteroduplex se
observaba la formación de un loop en el DNA, lo cual indicaba claramente la presencia de la
pieza de DNA transponible. Luego se hizo la misma prueba pero ahora con el fago parental
λdgal+ con fagos mutados con luz UV, pero los heteroduplex obtenidos no presentaban el
loop. Otro experimento fue hacer una transcripción in vitro, para lo cual se toma el DNA del
fago λdgal- y se permite su transcripción, obteniendo su RNA el cual sólo hibridaba con el DNA
λdgal- y no con λdgal+. Posteriormente a estos EGT causantes de estas mutaciones se les
denomino secuencias de insercion (IS) que eran diferentes para cada mutación.
8- Las IS se pueden insertar en una dirección o también en la otra. ¿Cómo demostrar que esta
inserción es independiente de la orientación? Para esto se toma el DNA del fago λdgal- y se
desnatura. Luego se toma otro DNA de otro fago λdgal- el cual se sospecha que tiene la IS pero
en la otra dirección y se desnatura también. Luego se toma la hebra (+) de ambos DNA (H en la
diapo) y se
permite que
se
reasocien.
Al hacer
esto se
obtienen
regiones de
DNA que no
se pueden
aparear
(hebras
simples)
pero hay
una región
de DNA que
si puede
aparearse, y
es esa zona
de doble
hebra la
que es
exactamente la IS. Así se tienen por ejemplo los mutantes 1 y los mutantes 2 que tienen sus
secuencias de inserción en diferentes orientaciones pero al hacer este experimento de separar
sus hebras y luego juntar sus hebras (+), se obtiene de todos modos esa región de doble hebra,
lo que indica que la IS se inserta independiente de la orientación.

9- ¿Qué experimento se haría para poder aislar la IS del resto del genoma del huésped? Se
usaron enzimas de restricción S1 que tienen la capacidad de degradar todo lo que sea DNA de
hebra simple, pero no el DNA de doble hebra, con lo cual si lo acoplamos al experimento
anterior, es posible aislar estas IS. Así se pudieron estudiar las distintas IS como por ejemplo la
IS-1 la que contiene 768 pb y aproximadamente 30 pb en sus extremos son repetidos
invertidos. Para demostrar la presencia de estos repetidos invertidos se separan las hebras de
este IS-1 y luego se permite su reasociacion y si realmente se encuentran estas secuencias de
repetidos invertidos, observamos unas formas de “lolipop” (las típicas horquillas). También se
observaron en las IS la presencia de regiones parecidas a promotores u operadores las que
interrumpen la normal acción de la RNA polimerasa lo que explica el efecto polar de las
mutaciones causadas por las IS en genes adyacentes. Por último se han observado algunos
codones sin sentido en estas IS en los tres marcos de lectura produciendo proteínas truncas,
las cuales varían en tamaño dependiendo a qué distancia del promotor del gen se inserto la IS.
10- Tabla de los distintos IS. Tienen distintos números de copias en el genoma y también
difieren en su tamaño y en el de sus extremos repetidos invertidos. Así fueron caracterizadas
esas secuencias saltarinas de las que hablaba Barbara McClintock.

11- Esta es la IS-1 y su estructura. Se ven sus extremos terminales de invertidos repetidos
(verde) adyacentes a zonas llamadas invertidos repetidos directos (morados) que son del DNA
del huésped. Este invertido repetido directo se produce a causa de la transposición y su largo
depende de que IS sea y de su mecanismo de transposición. Las IS codifican para la
transposasa que les permite la transposición y la capacidad de “saltar” en el genoma. Es la
presencia de esta transposasa la que explica la independencia a Rec A de este tipo de
recombinación.

12- Otros EGT son los llamados transposones. Estos se descubrieron en Japón con una
epidemia llamada “disentería” , la que tenía resistencia a muchos antibióticos. Al estudiar las
cepas causantes de esta enfermedad se encontró algo muy curioso, que era que al cultivar esa
cepa resistente a antibióticos con cepas normales, estas cepas normales luego adquirían esas
resistencias que antes no tenían, es decir había una transferencia. Posteriormente se
demostró que esas resistencias a antibióticos se encontraban en estas piezas móviles de DNA,
siendo denominadas como transposones (Tn). Los Tn al igual que las IS poseen todos los
elementos comunes para la transposición, pero a diferencia de las IS poseen resistencia a
antibióticos y también en algunos casos a metales pesados. Así se encontró que por ejemplo el
gen que confiere resistencia a ampicilina β-lactamasa (β-la) reside en un segmento de DNA de
aprox. 3 MDa que es transferible de un replicón a otro, independiente de recA (un
transposon). Uno de los Tn más estudiados es el TnA o Tn3 el cual posee genes que dan
resistencia a ampicilina (β-la). Los plásmidos que han adquirido TnA, muestran una inserción
de 3.2 Mda (4.95Kb), el cual está flanqueado por invertidos repetidos (IR). Al igual que las IS,
los Tn producen mutaciones con las mismas características que se vieron en la diapo 5.

13- Para demostrar la existencia de las IS se trabajaron con varios plasmidios los cuales
confieren resistencia a varios antibióticos (ver tabla). Estos pueden ser conjugativos o no. Si
son conjugativos, es porque el transposon que confiere la resistencia puede saltar a otra
bacteria entregándole una resistencia que esta no tenia. Lo que se quiso demostrar fue si la
resistencia a ampicilina era capaz de saltar de un plasmidio a otro cuando estos coexistían en
una célula.
14- Al hacer este experimento se encontró que al hacer coexistir plasmidios que poseen la
resistencia a ampicilina con los plamidios que no la poseen, estos últimos eran capaces de
adquirir la resistencia a ampicilina. Esto se demostró al centrifugar estos plasmidios y observar
su densidad, comprobando que estos aumentaban de tamaño. Así se comprobó que la
resistencia a ampicilina (alojada en un transposon) era capaz de saltar a otros plasmidios, en
un evento independiente de recA.

15- Se ha observado que los transformantes se clasifican en 3 grupos de acuerdo a la

resistencia que otorgan y a la vez a las resistencias a las que son sensibles. Así por ejemplo el
grupo III es 30 veces menos resistente a Sm que el parental. Estos tres grupos de
transformantes nos da cuenta de que los Tn se pueden insertar en diversos lugares del DNA,
incluso entre secuencias que entregaban resistencia a cierto antibiótico. Así por ejemplo un
transformante que era resistente a cierto antibiótico, puede perder dicha resistencia a causa
de la inserción de un Tn en esa zona, pero a la vez gana la resistencia que le confiere ese Tn.
Así se hizo el mismo experimento de separar las hebras de DNA del plasmidio que tiene la
resistencias a ampicilina y también de un plasmidio parental (sin la resistencia). Luego se
permite que se reagrupen encontrando la formación del típico loop característico de la
presencia de un EGT, en este caso un transposon. Así se pudieron estudiar los distintos
transposones.
 16- Aquí se muestra el mismo experimento
anterior, pero ahora al DNA parental usado se
le agrega un marcador que es una pieza de
DNA (R684) que se va a encontrar siempre
presente y en el mismo lugar. La gracia de
esto es que se pudo demostrar que el Tn se
puede insertar en diferentes lugares.

17- Se encontró que según el lugar de inserción del Tn varia el tipo de mutación. Esto porque
porque según el lugar donde se inserte el Tn será el grupo de transformante obtenido. Así por
ejemplo si el Tn se inserta justo donde había una resistencia a Sm, obtendremos
transformantes del grupo II, los que son sensibles a Sm, pero ahora resistentes a ampicilina.

18- Transposon TnA. PM= 3.2 MDa = 4.95 Kb. IR = 140 ± 38 pb. Sus características también se
determinaron con ayuda de la nucleasa S1. En su estructura se pueden ver las secuencias de
invertidos repetidos (IR) en sus extremos. También se puede ver su resistencia a ampicilina.
También posee dos genes. Uno codifica para el regulador de la expresión de otro gen, que
codifica para la transposasa y también se regula a sí mismo para poder codificar la resolvasa.
Tiene además un centro llamado sitio de resolución interno (IRS) que es un punto de quiebre y
reunión de las moléculas para la resolución de un cointegrado que se produce en el proceso de
transposición.
19- Se ven los lolipop que indican la presencia de los IR.

20- Hay varios

transposones. Por ejemplo
acá tenemos el Tn9 que
posee la resistencia a
cloranfenicol. Se ven sus
IR que son parte del IS (IS-
1) El Tn10 da resistencia a
tetraciclina pero en este
caso sus IR son
completamente los IS-10,
a ambos extremos
también. Es decir los
invertidos repetidos de los
Tn los entrega las IS que
estos poseen.

21- Cuando un Tn se inserta en un genoma puede conllevar distintos cambios en la expresión

fenotípica como por ejemplo afecta , la fertilidad, producción de bacteriocinas, etc (ver tabla).

22- Tabla con distintos Tn, los cuales al igual que las IS, varían en longitud y en sus IR, pero
también varían en el antibiótico al cual son resistentes.

23- Aquí vemos que producto de la inserción de los Tn los plasmidios adquieren resistencia a
distintos antibióticos. Un plasmidio puede tener más de un transposon a la vez.

24- Mecanismo de todo esto: lo

primero que ocurre es que la
transposasa reconoce una secuencia
clave en el DNA blanco, produciendo
un corte escalonado en este, haciendo
que la doble hebra de DNA se separe
dejando así porciones de DNA de
hebra simple en ambos extremos.
Luego el EGT como el transposon se
une a esa regio que quedo libre,
generando unos “gap” a ambos lados
de donde se ha insertado. Luego la
DNA polimerasa repara, rellenando lo
que falta y luego la ligasa termina
secando el nick. Así, luego de este
mecanismo se generan los IR directos
de los que hablábamos antes que son
característicos según cada Tn.
25- Lo mismo de antes, están los IR (morado) y los IR directos (verde) que dependen de del Tn
y su mecanismo de transposición.

26- Como ocurre el mecanismo descrito. Tenemos primero un plasmidio con un Tn y otro con
el DNA blanco. Luego del reconocimiento se produce la inserción del plasmidio en el DNA
blanco mediante el Tn, formándose el denominado “cointegrado”. En este paso se forma una
copia del Tn y posteriormente hay un evento de resolución con intercambio de hebras dejando
finalmente una copia del Tn en el DNA blanco y manteniendo una copia del Tn en el plasmidio
parental.

27- Mas especifico, lo que ocurre es que primero la transposasa produce un quiebre en el DNA
blanco y en algunos también en el Tn (ya que en algunos caso el quiebre de este Tn es
producido por otras enzimas). Así quedan extremos 3’ OH libres en ambas partes (Tn y DNA
blanco). El
transposon se “pega”
uniéndose a los
extremos libres del
DNA blanco
quedando unas
hebras simples
hibridas (unión de Tn
y DNA blanco). Estos
luego son duplicados
por la DNA
polimerasa y sellado
por la ligasa. Por
último la resolvasa
determina la
resolución.
 30- Se tiene el Tn10, con un
marcador “Z” que puede
ser Z+ o Z-. Lo que se quiere
saber es si la transposición
es replicativa o
conservativa. Para
demostrar esto se hace el
experimento desnaturar
estos transposones
separando las hebras de
DNA y luego se permite que
se reasocien.

31- Si se obtienen
heteroduplex (una
hebra Z+ y otra hebra Z-
) es porque la
transposición fue
conservativa, en cambio
si se obtienen
homoduplex (las dos
hebras Z+ o las dos
hebras Z-) es porque la
transposición fue
replicativa. La
transposición
conservativa es la que
explica porque en una
placa se obtienen la mitad de las colonias de un color y la otra mitad de otro. Así se demostró
que la transposición puede ser conservativa y también replicativa.

32- Los EGT en un cromosoma se pueden aparear entre ellos generando en algunos casos
deleciones.

33- También pueden provocar inversiones.

34- Si estos apareamientos ocurren entre dos cromosomas, deja a un cromosoma duplicado y
a otro con una delación. Entonces se concluyo que los EGT los cromosomas pueden causar
fenómenos de delación, duplicación y también inversión.

35-38 Existen los denominados retrotransposones, como lo son los retrovirus en eucariontes,
los Ty1 en levaduras y los elementos de copia en drosofila. Estos tres son análogos en función
pero diferentes por el nivel de especie en el que se encuentran. (esto solo lo menciona, no
profundiza en esto).

39- Acá habla mostrando el video. Como no tengo el video :( tratare de escribir lo más
importante que pueda de lo q dijo el profe, aunque es casi lo mismo de los mecanismos vistos
antes.

La transposasa es codificada por el transposon y esta provoca los respectivos cortes iniciales.
Esta enzima reconoce las secuencias de invertidos repetidos del DNA blanco. Así se forma un
complejo llamado transpososoma. Una vez formado ese complejo (en el cual se producen los
cortes y quedan las hebras simples del Tn también del DNA blanco) se procede a la
recombinación sitio específica. Un aspecto importante es que la tranposasa corta el DNA
blanco y en algunos casos también corta el Tn, ya que en algunos casos otras enzimas son las
encargadas del nick inicial del Tn. Siguiendo con la recombinación sitio especifica, luego de que
se produjeron las hebras simples del Tn y del DNA blanco, estas se unen por los extremos
libres que había quedado y luego esta unión es replicada gracias a la DNA polimerasa, y se
sellan por la ligasa. Se asegura así una copia del Tn tanto en el plasmidio dador como en el
DNA blanco. Finalmente se debe separar el DNA dador del DNA blanco. La resolución del
cointegrado es la que permite que ambos se lleven una copia del Tn. El nick o corte del
cointegrado es producido por una serina recombinasa y la resolución es llevada a cabo por la
resolvasa.

FIN
 Clase Recombinación: bloque 1

Primero que todo, a los que fueron a clases, si recuerdan los esquemas que usó
el profesor para explicar la recombinación, de holliday y la homóloga, tranquilidad los
he encontrado =). Estos son:

 http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jhermoso/ch10_holliday.html

 http://www.uam.es/personal_pdi/ciencias/jhermoso/ch10_homologous.html

Comenzando la clase:

Uno de los puntos cruciales en la estabilidad y perseverancia del material

genético, además de los sistemas de reparación, es la recombinación genética. La
evidencia citogenética, de la posible existencia de un quiebre y reunión del material
genético para dar progenies recombinantes, fue la observación de los quiasmas,
estructuras supuestas de la reunión de las moléculas de DNA cuando recombinan en la
profase I de la meiosis. El punto está en COMO ocurren estos eventos de recombinación
a nivel molecular, tratando de asociar cada una de las etapas con una reacción catalizada
por una enzima o grupo de ellas.
Antes de que se esclareciera de manera como se conoce actualmente la
recombinación, existieron varios modelos, basados en datos genéticos de recombinación
clásicos. Principalmente experimentos realizados por Holliday y colaboradores, en los
cuales estudios en base a cruzamiento entre mutantes y el análisis de la progenie:

Modelo de Holliday (A):

Modelo en base a datos genéticos. Esquema muestra 2 segmentos de
cromosomas, es decir, recombinación homóloga.
- Quiebre (nick) de en una de las dobles cadenas de los
cromosomas.
- Una de las cadenas con el extremo libre, invade a su cromosoma
homólogo por complementariedad, la consiguiente hebra migra
hacia el otro cromosoma homólogo formando una estructura
cruciforme (punto de entrecruzamiento o crossover), llamada
intermediario de Holliday
- La estructura cruciforme migra a la izquierda o derecha,
intercambiando las cadenas.

- Finalmente la estructura se resuelve, formando una zona de

HETERODUPLEX (zona de heterocigocidad molecular). Con una
hebra de 1 cromosoma y la otra de otro cromosoma homólogo.

Una de las características de la recombinación homologa es

que es conservadora, por cada 2 piezas que entran en
recombinación, salen 2! Dependiendo de cómo se resuelve la estructura cruciforme se
pueden generar 2 tipos de recombinantes (como salen en el esquema).

Interludio, Grande coté!: Que significa OR????

Modelo de Meselson- Radding (B):
Basado en modelo de Holliday, también base a datos genéticos.

- Postulan inicio distinto, solo 1 cadena sufriría un nick (quiebre de

azúcar-fosfato).
- Síntesis de DNA, desplazamiento de hebra simple cortada.
- Invasión de la hebra a su cromosoma homólogo, desplazando a la
hebra apareada formando un “D-loop” (formación por la invasión de una
hebra simple a una doble hebra), apareándose con la complementaria
- Degradación del DNA e integración de la hebra invasora.

-Invasión de la hebra en síntesis en extremo libre, invasión de rama o

punto de crossover, generando el intercambio de hebra y zona de
heterocigocidad molecular. Formación del intermediario de Holliday

-Resolución de 2 formas distintas

Modelo de Quiebre de doble hebra (C):

-Quiebre de doble hebra en un cromosoma

- Acción de exonucleasas forman extremos de hebra simple .

- Invasión a la doble cadena, D-loop. Síntesis de DNA

- Recombinación.

- 2 intermediarios de Holliday.

- Resolución

Modelos forman el intermediario de Holliday y se basan exclusivamente en datos

genéticos.
 Esquema clarificador de Holliday y
resolución:
- El único problema esta en el paso de
“e” a “f”. Para imaginarlo, tienen que
dejar fijo el cromosoma negrito. Luego,
hay que tomar los extremos del clarito
y tirarlos hacia el centro.
- Dependiendo donde se haga el corte,
la resolución será de:
Recombinación neta
Parche de recombinación

Acá se muestra el modelo en video, que

según yo es como lo importante de
aprender.
 http://www.uam.es/personal_pd
i/ciencias/jhermoso/ch10_hollid
ay.html

Figura de Intermediario de Holliday

Luego se muestran esquemas más claros del modelo de Meselson- Radding y
quiebre de doble hebra, respectivamente, viendolos con detenimiento se pueden
entender, sino tonces conversemoslo po:
 Todos los modelos tienen en común también que una hebra simple por el
extremo 3’ es la que invade a la doble hebra.
El avance del intermediario (el punto de crossover) puede ser mayor a 10kb.

Pregunta: Como son cromosomas homólogos, y se trata de alelos, cuantas bases

pueden impedir que un alelo….
Respuesta: Va a depender del organismo, en el caso de E.coli, se sabe que
pueden pasar las 50 bases, es decir si hay una zona de 50 bases de no homología el
sistema aún así puede sobrepasarlo, un mayor número bloquea la recombinación.

Sistemas de reparación asociados a recombinación

La recombinación es un producto de un mecanismo de reparación del DNA que
posteriormente habría dado ventajas adaptativas a los organismos y que posteriormente
habría evolucionado a un sistema de recombinación (Profe repite la misma idea en la
misma oración).
(a) La recombinación sirve de reparación a moléculas de DNA que han sufrido
quiebres de doble hebra. Ya que si no es reparado, el sistema de degradación
de exonucleasas de la célula se lo pitea
(b) La replicación dependiente de recombinación, ocurre cuando en la horquilla
de replicación la leading strand se rompe, generando un quiebre de doble
hebra. Los sistemas de reparación generan un extremo 3’ en la doble hebra,
invadiendo la doble hebra e iniciando así la replicación.
(c) Recombinación dependiente de replicación. Se genera un extremo de hebra
simple, el cual se usa para la recombinación.

Finalmente la integración de DNA en la conjugación o transducción, procesos de

integración por recombinación homologa, funcionan con métodos similares a este, por
DNA con extremos de doble hebra que genera extremos de hebra simple 3’ para que
ocurra la recombinación.
EXTRA:
Esta página muestra algo de procesos de reparación con recombinación:
http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/genetic-
analysis/recombination/rec-molecular.html

Si se dan cuenta, el actor principal en estos procesos siempre ha sido el

intermediario de Holligay, pero ¿cómo demostraríamos su existencia?....Mirándolo!!
Viéndolo en microscopía electrónica. El experimento se realizó en la forma replicativa
duplex del bacteriófago  X 174 (se usa DNA viral porque es más shico; 5,4kb)
circular. ¿Como funcionaría esto? Se esperaría tener una estructura de “8” cuando se
formara la estructura de Holliday.
Luego, la resolución puede ser formación de monómeros o de dímeros o
multímeros (un dímero que recombina con un monómero por ejemplo).

Dímero

Pero, esta molécula “8” puede ser causada por la

superposición de 2 moléculas circulares de DNA, esta ambigüedad
se resolvió usando un plasmidio que presentara un sitio de corte
único para enzimas de restricción (se usó ColE1 y EcoR1). Esto
formaría una estructura cruciforme simétrica, denominada “forma
CHI” (  ). “Proceso” en figura de abajo, se muestra el “8”, se trata
con EcoR1, paf X.
Se dice que son simetricas, porque, por ejemplo en la figura
de la izquierda, los brazos presentan zonas ricas en AT denaturadas y
se encuentran a la misma distancia del centro.
Estas estructuras “X” se obserban en
células recA+ (dicese de cepas de coli capaces
de recombinar) pero no en células recA- (dicese de cepas sin
capacidad de recombinar, por la mutación en el gen recA). Se
muestra una tabla resumen con experimentos realizados y sus
resultados, en resumen, moléculas recA- darán moleculas iguales,
es decir, monómero dará monómero, multímero dará multímero,
pero moléculas recA+ dará siempre como resultado monómeros,
dímeros o multímeros.
 Ahora bien, ¿Cómo ocurre la recombinación? ¿Quién la realiza? Estudios
muestran que existen más de 25 productos génicos que participan en el proceso de
recombinación en E. coli y muchos más en eucarionte.
El producto del gen recA, la proteína RecA fue descrita apartir de estudios de
geles y cambios de movilidad electroforética con cepas recA+ y recA- y se le asoció a la
proteasa X de un peso molecular de 40kb.
¿Qué tiene que ver una proteasa con la recombinación? La proteasa X, cuando
las células lisogénicas del fago  infectadas en coli, son tratadas con UV, Mitomicina
C, Ac. Nadilixico, etc. (Pausa: Explicación de ciclo lítico y lisogénico que no viene al
caso poner), provoca que los fagos entren en ciclo lítico, esto se debe a que el represor
que mantiene al genoma del fago en el de coli se cliva en 2 partes, induciendo al ciclo
lítico. Esto también ocurre con la proteína represora del fago P22 y el producto del gen
lexA (represor que reprime su misma síntesis, la de RecA y otros genes involucrados en
la reparación de luz UV), que cuando se cliva, se activa la síntesis de RecA y las
proteínas encargadas de la respuesta SOS para este daño.
Actividad proteasa en presencia de ATP.
Mutantes termosensibles del gen recA (recAts) no recombinan a temperatura
restrictiva pero al cambiar a temperatura permisiva, si recombinan, lo que lo asocia con
la recombinación y la acción de la proteasa X.

Ahora, para el clivaje in Vitro se requiere la formación de un complejo ternario,

RecA-ssDNA-ATP o dATP (deoxiATP). Se observó además que en condiciones
alcalinas LexA y cI (represor  ) se autoclivan. Por lo tanto, la actividad de la proteína
RecA no tienen una actividad proteasa, sino tiene una función de ayuda al autoclivaje de
la estas proteínas, por lo que pasa a tener una actividad de Coproteasa.
* Para clivaje de LexA y cI no se requiere de hidrólisis de ATP.
 Recombinación 2

La proteina RecA es una coproteasa, pero a medida que se van completando las
distintas etapas de purificación de la proteína RecA, está se va haciendo mas inactiva
como proteasa, esto se explica porque en las etapas iniciales de purificación había altas
concentraciones de contaminantes, principalmente un oligonucleotido, que haría que se
forme el complejo RecA – DNAss –DNTps que activan la actividad proteasica. Se
observó que a medida que la proteína RecA está más pura es capaz de interactuar con el
DNA, y esto se relaciona con la capacidad de recombinar. Se observo también que la
proteína RecA tiene una actividad ATpasa que es estimulada por la presencia de hebra
simple. Por lo tanto encontramos dos actividades de la proteina RecA: por una parte
tiene una actividad coproteasa y por otra parte una ATPasa.
Se observo que la proteína RecA tiene la propiedad de renaturar hebras
complementarias del DNA, y esto esta relacionado con la recombinación, pues esta
proteína comienza a juntar las hebras complementarias. Se puede considerar como una
fusión de genomas. Se ha observado que está proteína puede unir a DNA de hebra
simple y de doble hebra, pero une 100 veces mas fuerte DNAss. Si observamos los
modelos que ya ha mencionado, se ve que en general plantean que DNAss invade una
molécula de DNAds. La proteína se une mucho mas rápido a DNAss, pero se ha
observado también que la presencia de DNAss estimula la unión de la proteína RecA a
DNAds. Porl o tanto lo que la proteína está haciendo es uniendose a DNAss primero y
luego de es unida invade al DNAds y inserta el DNAss en el de doble hebra, por la
propiedad de fusión de genomas.
El DNAds sobreenrollado forma esta estructura D-loop, al cual se une la
proteína RecA-DNAss en presencia de ATP, y forman este complejo en el que se va
desplazando la hebra antigua por la hebra simple.

Si se toma otro modelo de sustrato para la proteina RecA en el cual se tiene un

DNA circular de hebra simple + DNAds (Fig2.B) ahora puede formar una molécula
circular de doble hebra relajada (porque tiene un nick) + una molécula DNAss lineal.
También puede ser una DNAss lineal que invade DNAds superenrollado y forma el
primer intermediario D-loop (fig 2.A).Otro sustrato es una molécula DNAds circular
con un gap (hueco) + DNAds lineal (fig2.C), que puede formar un DNA circular
recombinante con una hebra del DNAds lineal + una hebra DNAds recombinante con
una cola de hebra simple. Todos estos son modelos de cómo puede ocurrir la
recombinación.
 Ya vimos por la clase anterior que el intermediario de la recombinacion ocurre,
ahora vemos que el principal motor de que esto ocurra es la proteína RecA, producto
genico del gen recA, que posee 5 funciones distintas involucradas en el proceso de
recombinación: coproteasa, ATPasa, union a DNAss, union a DNAds y fusión de
genomas.

Tomando otro modelo más en detalle, de una DNAss circular y DNAds lineal +
proteína RecA mediante la hidrólisis de ATP, esta es capaz de unir DNAss circular al
DNAds y desplazar la hebra complementaria formando esta estructura de loop.

La proteína RecA tiene alta afinidad por union de DNAss, una vez unido es
capaz de formar un complejo ternario con la molécula de DNAds, en presenca de ATP,
por la hidrólisis de este la proteína RecA tiene la capacidad de cortar el DNAss y volver
a unir. La capacidad de cortar DNAss y volver a unir se a interpretado como una
actividad en busca de homología, busca la homologia entre la molécula de DNAss y
DNAds cuando la encuentra se produce el apareamiento y luego la fusión de genomas.
Se a observado también que la proteína RecA tiene la capacidad de denaturar DNAds,
esto se a probado tomando DNAds circular con un nick que esta relajado, cuando se
pone en presencia de proteína RecA esta se une, luego este nick del DNAds se sella con
una ligasa y no hay cambio en la movilidad electroforetica de esta proteína sellada en
relación a la no sellada. Ahora cuando se toma este mismo modelo de DNAds circular
con un nick, se pone proteína RecA y ATP, y luego se sella con DNA ligasa, y se pone
en electroforesis se observa que hay un cambio en la migración de este DNA.Esto se
interpreta que cuando la proteína RecA se une al DNAds con un nick es capaz de
desenrollar la molécula por la hidrólisis de ATP, y este grado de desenrollamiento se
sella con la ligasa y uno lo puede ver en la movilidad electroforetica. Por lo tanto acá
hay otra propiedad de la proteína RecA, que es capaz de desenrollar parcialmente
DNAds, y generar zonas de hebra simple.
La proteína RecA puede unirse a cualquier DNAss sin importar su origen, lo que
pasa es que en el genoma de E.coli, hay una secuencia que es reconocida por los
sistemas de recombinación y a partir de esa secuencia se genera un extremo 3´ acá es
donde es anclada la proteína RecA y donde empieza el proceso de recombinación.

Se va uniendo al DNA de acuerdo a este modelo:

Tenemos una proteína recA que en presencia de ATP aumenta su afinidad y se

une a DNAss en el lado 3´, cuando hay hidrólisis de ATP, entonces se forma un
complejo RecA-ADP y pierde la afinidad por la hebra simple, lo que puede ocurrir es
que se libere el ADP y se cargue ATP para mantener el sistema, luego hidrólisis de ATP
y cargue de nuevo, se va formando un sistema interno en el cual se va hidrolizando para
mantener a la proteína RecA unida al DNAss. La proteína RecA se va uniendo en el
lado 3´de la molécula, por lo que por este lado ocurriría la invasión de la doble hebra en
el proceso de recombinación.
En la formación de este filamento de proteína RecA, se une una proteína por
cada 3 nucleótidos de DNA, una interacción entre monómero y monómero y entre
filamento y filamento.
La proteína RecA tiene un sitio de unión al DNAss y otro al DNAds que mas o
menos compiten entre ellos, entonces la proteína une DNAss , luego une DNAds y
mediante la hidrólisis de ATP produce el intercambio de bases entre ellas:
En A: une DNAss y dp DNAds
En B: une DNAds y dp DNAds (intercambio entre dos moléculas de DNA doble hebra,
modelo propuesto cuando recombinan dos moléculas de doble hebra)
 RecA + ATP se unen en un complejo a DNAss, con esto invado la doble hebra
formando este complejo ternario (DNAss - proteína RecA - DNAds), este es un
complejo de preiniciación, esto se ha demostrado tomándolo y pasándolo por un filtro
de nitrocelulosa, donde queda detenido, sin embargo cuando esto se trata con
detergentes, se libera y pasan las moléculas a través del filtro, lo que indica que no hay
intercambio de bases, sino que el DNAss y DNAds permanecen juntos por la unión a la
proteína RecA. Posteriormente y por hidrólisis de ATP, se forma el complejo D-loop,
este queda detenido en el filtro de nitrocelulosa luego del tratamiento con DNAsa, lo
que evidencia que aquí si hay intercambio de bases.

Acá se ve el proceso de recombinación donde se forma un intermediario de triple

hebra, como productos se genera un heteroduplex en la recombinación + una molécula
parental de hebra simple. La molécula de doble hebra que se genera es 3´5´, lo que
indica que la proteína RecA va migrando en el sentido 5´3´ y desplazando la hebra
complementaria, por lo tanto hay una polaridad.
En la figura b, sería lo que ocurriría en el proceso de recombinación de dos
moléculas de DNAds

Para determinar la polaridad de RecA, se tomo DNA circular + DNAds lineal

dimerico que tiene parte del genoma homologo al DNAss circular y otra parte DNA no
homologo a éste. Como se ve en la figura cuando se genera un extremo 3´ la reacción se
ve favorecida (A), en contraposición a cuando la reacción parte a partir del extremo
5´(B). Lo que indica que la recombinación se ve favorecida al poner un extremo 3´ de
DNAss, ahí parte.
 Se han generado mutantes de las distintas etapas para la proteína RecA, esta es
una representación de la región amino a carboxilo Terminal, cada una de los codigos
son los distintos aa que se han cambiado, las distintas zonas achuradas representan
distintas funciones de la proteína, por ejemplo: la unión al DNA, unión nucleotidos y
hidrólisis de ATP, interacción proteína –proteína. Mut13 cambia leucina por
fenilalanina, esto hace que la cepa de E.coli sea incapaz de recombinar,etc.

Existen una serie de otras proteínas que juegan un papel en la recombinación una de
ellas son las proteínas de unión a hebra simple, la presencia de SSB hace que el DNA
permanezca como molécula de hebra simple. Se ha visto en ensayos in Vitro que la
presencia de SSB estimula formación del heteroduplex, en comparación a la reacción
sin ella, por lo que SSB es una proteína auxiliar de la proteína RecA en el proceso de
recombinación:
Hay una cantidad enorme de productos genicos distintos a RecA en E.coli que
participan en la recombinación. Por ejemplo: RecBCD, es una exonucleasa V que:

Se puede determinar que hay un complejo de presynapsis, la synapsis y posteriormente

la extensión del heteroduplex con el intercambio de material genético. En la etapa de
presynapsis los sustratos son recA, DNA hebra simple, SSB, y se formaría un complejo
DNAss+filamento de recA; en la etapa de synapsis se forma el complejo trimerico,
luego se forma una molécula de unión al DNA, donde el lugar de unión esta en el centro
de la molécula pero que es muy inestable por lo que para pasar a la otra etapa de la
recombinación este sitio debe trasladarse al sitio 3´

Como modelo tomemos una molécula de DNAds circular con un repetido directo de
DNA, este repetido puede ser resuelto y recombinado por varios modelos por ejemplo:
que actue RecE con su actividad exonucleasa DNAds 5´3´, generando extremos 3´de
DNA. También puede actuar RecQ que es una helicasa que denatura DNA en conjunto
con RecJ que es una exonucleasa DNAss en sentido 5´3´, generando un extremo 3´ de
hebra simple. Otro caso es que actuae es RecQ que es una helicasa que denatura DNA.
Luego RecA y RecT (proteína de unión) permite el apareamiento de las moléculas
complementarias y homologas. Finalmente en el caso que haya actuado RecQ actuaría
RecJ para degradar la otra hebra de DNA, y luego se repara la molécula por una DNA
ligasa.
Otro caso es como ocurre recombinación con una molécula circular y DNAds. Una
opción es que actúe RecBCD, que es una helicasa potente, aparte de ser una
exonucleasa, que va denaturando DNA en un dirección 3´5´ muy rápidamente y mas
lentamente va degradando DNA en una dirección 5´3´, generando un extremo 3´.
Otro caso es que actue RecE que degrada DNAds direcció 5´3´generando un extremo
3´libre. También puede actuar el producto del gen RecQ (helicasa) + RecJ
(exonucleasa), generando un extremo 3´libre. También puede actuar RecQ sola.
El extremo 3´libre en conjunto con recA va a invadir al DNAds, formando el
intermediario D-loop donde ocurre el intercambio de bases. Posteriormente se forma la
estructura de Holliday y la extensión del heteroduplex , por RuAB y RecG, que son los
motores que permiten el movimiento en el intermediario de holliday, finalmente la
estructura se resuelve en una o en otra dirección por RuvC.
El producto génico del gen recBCD, forma un complejo trimerico con 3 proteínas, que
reconocen una secuencia de extremos romos o cercanos a extremos romos, o sea puede
tener una cola de DNAss pero esta no se puede extender por más de 17 nucleótidos.
Reconoce la secuencia, se une y empieza a denaturar el DNA doble hebra a dos
velocidades, una que va denaturandola hebra 3´ muy rápidamente a causa de la proteina
recB, y otra que va denaturando la hebra 5´ mas lentamente, que esencialmente es una
translocasa (la proteina recC), la cual se va desplazando por el DNA.

Se une y va denaturando en el sentido 3´5´ en relación a la hebra que tiene una

secuencia llamada chi (χ)

.
A medida que va denaturando va degradando la secuencia 3´que se genera muy
rápidamente por su actividad exonucleasica 3´5´y además va degradando la hebra
5´con su actividad exonucleasa 5´3´ mas lentamente (esto no se ve en el dibujo pero
eso es lo que dijo hartas veces). Cuando llega a la secuencia chi, se detiene por 6 a 8 seg
¿?, y detiene su actividad exonucleasa 3´5´; luego avanza nuevamente y sigue
denaturando el DNA con su actividad helicasa pero a la mitad de la velocidad con la que
venía antes de chi. También sigue denaturando el DNAds con actividad exonucleasa
5´3´( porq esta no se detiene), o sea va degradando la hebra complementaria. Al
detener su actividad exonucleasa 3´5´va generando un extremo 3´libre de hebra
simple donde esta la secuencia chi, esta es reconocida por la proteína RecA la que se
une y comienza el proceso de invasión. (ver fig de abajo)
Ahora hay una competencia por la unión al DNA hebra simple entre RecA y SSB, esta
última tiene mayor afinidad por unión DNAss pero en presencia del complejo recBCD
la proteína recA aumenta su afinidad y gana la competencia. Se ha demostrado que el
complejo recBCD carga a la proteína recA en el extremo 3´ que posee chi, la cual
invade la doble hebra y logra la recombinación.
Cuando el complejo recBCD reconoce la secuencia chi, para estos 3 a 8 segundos y
luego, y hace su ultimo corte en la hebre 3´ 4 a 5 nucleotidos antes de la secuencia chi,
generando así la hebra simple 3´donde se va a cargar la proteína recA+DNAss para
comenzar la invasión.
La pregunta es ¿Cómo es reconocida la secuencia chi? , se hicieron una serie de
experimentos en los cuales se introdujeron mutaciones aquí y mutaciones aca¿?, si se
cambian todas las bases de la hebra complementaria a chi, pero se mantiene la secuencia
chi tal cual (generandose una doble hebra mal apareada), chi es reconocido, esto quiere
decir que no importa lo que haya en la hebra complementaria. Ahora si se muta la
secuencia chi, y se deja la secuencia de la hebra complementaria tal cual, no es
reconocido chi.O sea lo que importa es la secuencia chi en la dirección 3´5´.
Cuando se hace un bloque en el cual se reemplazan 22 nucleotidos de la hebra
complementaria, creando una zona de buqle, chi es reconocido, esto demuestra que chi
es reconocido como hebra simple, por lo tanto va denaturando previamente a esta
secuencia. Es por esto que no importa lo que haya en la secuencia complementaria.(hay
una Diapo con las mutantes por si les interesa)

Se ha visto en el genoma de E.coli este es el oric (origen de replicacion) cuando se

estudia la secuencia chi en función de su tamaño, hay muchas regiones chi en el genoma
de E.coli, el numero exacto va en el orden de 2000 o algo así, en el genoma completo.
Sin embargo la gran mayoría de los sitios chi, se ubican a ambos lados del OriC. Se
piensa que se han ubicado ahí para evitar los problemas de quiebre de doble hebra
cuando la bacteria esta replicando su DNA, por lo tanto al quebrarse esto permite que el
sistema RecBCD reconozca esto y se produzca la reparación del DNA por
recombinación.
 Recombinational repair of a collapsed replication
fork.
(a) The unreplicated E. coli chromosome with an
exaggerated view of the asymmetric distribution
of χ sites around the origin.
(b) Replication occurs bi-directionally, initiating
at
oriC; a lesion in the DNA template blocks
progression of one replication fork.
(c) The blockage causes detachment of one arm
and collapse of the replication fork, resulting in a
DSB.
(d) RecBCD enzyme enters at the dsDNA end,
degrading until reaching a χ site; enzymatic
modification of RecBCD enzyme occurs and the
facilitated loading of RecA protein follows.
(e) RecA protein promotes strand invasion of the
χ-containing ssDNA into the homologous duplex,
recreating a substrate for PriA-dependent
reassembly
of the Pol III holoenzyme (shaded
circle).
(f) Replication of the chromosome resumes.
Adapted from Ref. 24

Se supone que quien carga la proteína RecA en el extremo 3´de la secuencia chi es recB
(del complejo recBCD), por una mutación que carece de recB se ha demostrado.

En el 2007 salio un modelo, en el que se ha podido demostrar que en la etapa antes de

chi, el motor de helicasa es recD, esta diferencia en las velocidades de denaturación,
crean un loop de DNAss frente a la proteína recB. Chi es reconocido por recB, y esta se
lo entrega a RecC, lo pone en el sitio de recoocimiento de RecC, esto causa un cambio
estructural en la proteína, lo que hace que el complejo pause, y RecD pierde su
actividad helicasa y exonucleasa 3´, realizando su último corte a 4 -6 nucleotidos antes
de chi, y ahora quien asume la propiedad de motor de helicasa es recB, por lo tanto va
mucho más lento, y ahora como la secuencia chi esta en recB esta carga a la proteína
recA en el sitio chi y comienza la recombinación.
Ahora muestra los super videos, de cómo avanza la proteína recBCD y para y dp sigue
se acuerda? Era re bonito …..
Y después carga los otros videos comparando los modelos de recombinación de recbcd
con el modelo de Holliday. Y como resuelven las proteínas RuvABC finalmente.

Acá hay un esquema final:

Acá se explica como finalmente se resuelve la estructura por el complejo RuvABC:

Potential Stages in the Association of the RuvA,

RuvB, and RuvC Proteins with Holliday
Junctions
(A) Two homologous duplex DNAs (red and
black) in the process of strand exchange are
encased within a filament of RecA protein (blue
spheres).
(B) Dissociation of the RecA filament in the
vicinity of the junction makes it accessible to Ruv
proteins, although the two DNA mole-cules
remain in a side-by-side orientation.
(C) Hypothetical reaction intermediate in which
RuvA protein (pale blue) binds the Hol-liday
junction and unfolds it into a 4-fold symmetric
square–planar structure. RuvA is shown as a
tetramer binding to one face of the Holliday
junction, consistent with X-ray crystallographic
data (Rafferty et al., 1996).
(D) Interactions between RuvA and RuvB lead to
loading of one (or two) RuvB hexameric rings
(dark blue) to the arms that flank the Holliday
junction.
(E) A tripartite RuvAB branch migration complex
in which the junction lies in a square–planar
configuration sandwiched between the concave
faces of two RuvA tetramers. This complex is
thought to be capable of extensive ATPdependent
branch migration, a process that will
also dissociate the RecA filament from the
flanking DNA.
(F) Replacement of one (the uppermost) RuvA
tetramer with a RuvC dimer (red) leads to the
formation of a roposed RuvABC branch
migration/resolution complex. In these diagrams,
the DNA and proteins are not drawn to scale

RuvB forma un hexamero en el punto de recombinación, que va avanzando en la

molécula de DNA, se unen dos hexameros de ruvB a cada lado de la molécula y dos
tetrameros de RuvA, como que RuvB los acompleja y forma una especie de sándwich y
este motor con gasto de ATP va produciendo el intercambio de DNA al ir dando vuelta,
lo que entra es la molécula parental y lo que sale son los heteroduplex.
Entonces lo que resuelve finalmente, es la unión de un dímero de RuvC, que es la que
hace finalmente el corte en el punto de crosse-over y lo que reconoce es una secuencia
en el 5´A/T G C G/C 3´ esta secuencia se puede encontrar cada 64 nucleótidos en
E.coli. Los productos de la resolución pueden se reparados por DNA ligasa.
Sitio corte
 Herencia Extranuclear

Hemos visto la herencia tradicional (mendeliana) en los cuales uno puede ver que
independiente del parental que uno tenga, con ciertas características, todos los
cruzamientos son recíprocos de tal manera que el resultado de esos análisis
posteriormente son los mismos. No importa el genotipo del parental masculino o
femenino, igual va a dar un resultado similar. Sin embargo, una de las características
que se observa en otro tipo de herencia, en la herencia extranuclear: que
correspondería a la herencia de genes que no están en el núcleo, es el patrón
variegado que indica que los genes responsables de esto no están en el núcleo (en los
cromosomas).

Patrón variegado (hojas y ramas blancas, otras

verdes y otras mixtas).
¿Dónde creen ustedes que están estos genes? : en los cloroplastos por ejemplo.

Hay una serie de DNA`s que están extracromosómicamente, por ejemplo, en los
organelos como mitocondrias y cloroplastos, en plásmidos en eucariontes. Ejemplo: en
saccaromyces cerevisiae, la levadura tiene algunos plásmidos que pueden encontrarse
en el núcleo o en el citoplasma, sin embargo son extracromosómicos porque no están
en los cromosomas, sino que son elementos cromosómicos independientes. Uno de los
más típicos es el DNA de 2 µ (“micra”), que permitió todo el desarrollo molecular. Es
un plásmido circular y su nombre se debe a que la medida en microscopía electrónica
es de 2 micra.
Neurospora crassa también posee
algunos plásmidos que se
encuentran extracromosómicos.
Uno de éstos se ubica incluso en
mitocondrias.
También existen plásmidos que son
construidos artificialmente (no
hablaremos de esto) y además
algunas secuencias de DNA que se
amplifican en un organismo y que
son parte de los genes que codifican
por RNA`s ribosomales.
Algunos de estos elementos que son
extracromosómicos derivan por
ejemplo de transposones eucariontes
o de secuencias tipo retrovirus que
están insertados en el genoma de los
eucariontes o bien de
retrotransposones que también están
en alguno de los cromosomas
eucariontes.
Si bien están en los cromosomas, éstos en algunas etapas se liberan, y ya sea por
transcripción y luego síntesis de DNA y circularización generan estas estructuras
circulares extracromosómicos. En algunos casos ocurre por recombinación.

Si ustedes ven, se observan repetidos directos o repetidos invertidos en el elemento

viral o retrotransposon. Estos repetidos que son del DNA huésped o del elemento, son
homólogos, por lo tanto por recombinación, por ejemplo (A I figura de abajo)ya sea
estos repetidos LTR (long Terminal repeats) extremos del elemento pueden generar
una molécula circular que sólo tiene un LTR y esto está en el citoplasma o
extracromosómico en el organismo ó bien (A II) la recombinación puede ocurrir a nivel
del repetido huésped que fue blanco del fenómeno de inserción de esta pieza del DNA,
generando dos repetidos del tipo LTR separados por una de estas secuencias del
huésped que están en una estructura circular en la célula. Y así sucesivamente, ( A III)
una recombinación adireccional es la cual genera dos repetidos del tipo LTR con uno
de estos del blanco donde se inserto, más un pequeño sector del DNA del cromosoma
donde estaban estas piezas. En el tema de los retrotransposones, (B I) donde hay un
RNA sintetizado que después se resintetiza en una cadena de cDNA que forma doble
cadena y se circulariza, generando zonas ricas en A.
El material genético de mitocondrias y cloroplastos es normalmente DNA circular y que
codifica por funciones propias de estos, pero que no son suficientes para su
mantención, requieren de productos génicos que son codificados por el núcleo.

Para duplicarse, la mitocondria replica

sus varias copias de DNA circular de
distintos tamaños dependiendo del
organismo, y se divide el organelo,
repartiéndose el material génico.

Este material génico tiene las

mismas características de flujo
génico, se replica y se transcribe,
genera sus mRNA, rRNA y
tRNA`s. Proteínas propias junto
con proteínas de la célula o del
núcleo, permiten esta
maquinaria.

Un ejemplo, es un genoma de cloroplasto, donde se pueden observar una serie de

genes incluido los de los fotosistemas. DNA del cloroplasto en general tiene un tamaño
mayor en pares de bases que el de las mitocondrias.
 Se observa el 23 S rRNA, 16 S rRNA,
tRNA`s, RNA polimerasa y denuevo
hay doble copia de lo mismo en una
posición invertida. También se
observan genes que son propios de
la maquinaria, como los fotosistemas
(para la fotosíntesis).

Un ejemplo ahora de mitocondria, se

observan RNAs ribosomales, tRNA`s,
etc, está el origen de replicación.
Existen dos hebras, la hebra H
pesada y la hebra L liviana, esto
permite separar las hebras de las
mitocondrias y estudiar que genes
están codificados en una hebra y
cuales en otra hebra.
Los tamaños de DNA mitocondrial
varían mucho entre organismos, el
de humanos es de 16 kb, el de ratón
también, pero por ejemplo el de
arabidopsis es 367 kb.

Teoría endosimbionte: un eucarionte anaeróbico antiguo habría ingresado una α-

proteobacteria aeróbica, que se habría adaptado como un endosimbionte y que
evolucionó a una mitocondria propia de las células animales. Esta célula con una
mitocondria, posteriormente habría ingresado una cianobacteria, que habría
evolucionado en un cloroplasto, generando las células de las plantas.

¿Qué pasa con las células cuando uno quiere hacer un análisis genético? En la
siguiente figura, el color de cada una de las mitocondrias representa una característica
génica diferente. Si fusionamos dos células con mitocondrias distintas, lo que estamos
generando acá al separar estas mutantes es un heteroplasmón, hay una mezcla de
mitocondrias de distinto genotipo. Cuando segregan estas células igual segregan con
mitocondrias de dos características, que posteriormente por división y segregación al
azar pueden generar líneas celulares con sólo una de las características de las
mitocondrias y otras líneas con sólo otras características de las mitocondrias.

Mutaciones citoplasmáticas se observaron por

primera vez en levaduras con dos tipos de
colonias, las normales que tienen un tamaño
determinado y las mutantes petite, que son
colonias muy pequeñas.

Se observaron tres tipos de mutantes petite: las segregaciones, las neutras y

supresivas.
 Segregacionales: hay un mutante que da colonias pequeñas que
cuando se cruza con un silvestre da un cigoto diploide normal, que
genera por esporulación después de la meiosis, dos ascas petite y
dos ascas normales (segregación 1:1). Esto es típico de marcador
nuclear. Lo que genera este tipo de mutación está en el núcleo.

Otro tipo de mutantes, las neutras, se vio que al cruzarse una

cepa petite con normal genera un cigoto diploide normal que
genera patrones típicos de segregación mendeliana (1:1) pero
todas normales.

En la supresiva, cuando se cruzaba con una cepa silvestre

daba cigoto diploide que normalmente son pequeños petite, que
luego generaba 4 ascosporas con marcador nuclear o
cromosómicos segregando mendelianamente 1:1 pero todas
petite.

El estudio de DNA mitocondrial en esta cepa mostró que las

mitocondrias tenían muy poco DNA (grandes deleciones). Estas
al cruzarse, se auxilian de las mitocondrias que vienen de la cepa
silvestre. Se habría esperado que al haber mitocondrias
funcionales normales, esto diera colonias normales. Se tienen
dos explicaciones para esto: 1) mitocondrias petite se dividen
mucho más rápido que las normales y por lo tanto tienen un
efecto dominante ó 2) recombinación, un efecto del genoma de
la mutante petite supresiva en el genoma de la mitocondria
normal produciendo un cambio en esta, una mutación, haciendo
que esta crezca más pequeña.

Otros elementos que se encuentran extracromosómicamente son los genes que

codifican por RNA`s ribosomales en Tetrahymena. Este organismo tiene dos núcleos:
el micronucleo (núcleo germinativo) y el macronucleo (amplificación específica de
ciertos genes que se repiten aproximadamente entre 20 y 200 veces y que están para
cumplir su rol en células que se están dividiendo activamente. Cuando se estudio a
nivel de microscopia electrónica las moléculas que constituyen parte del macronucleo
que codifica por el rRNA, se observa que en general se encuentran como moléculas
monoméricas y con un tamaño de 15-20 kb aprox. En algunos casos se pueden
encontrar dímeros o un poco más, pero básicamente son moléculas de DNA circular.
Cuando se hace un estudio y un mapa de denaturación parcial de estas moléculas,
empiezan a someter a una temperatura (empezando a denaturar) y cada cierto tiempo
se va haciendo preparaciones al microscopio y se va observando. Empieza a
denaturarse la molécula de DNA en zonas más ricas en AT, se ve una simetría de la
molécula lineal a distintos tiempos o temperaturas de denaturación.

La mayor distribución es
monomérica, pero también se
observan dímerosa, trímeros
y tetrámeros.

Como ustedes pueden ver, aquí hay una

variedad, la variedad BVII y la GL, cuyas
características en el genoma son distintas.
Esto básicamente porque hay distintas
características en la composición de AT. Hay
una simetría en estas moléculas de DNA
extranuclear (del macronucleo en el
citoplasma).

Se llega a este modelo de molécula

en la cual está sería la molécula de
DNA lineal que está formando parte
del macronucleo (independiente de
los cromosomas), en las cuales
habrían zonas repetitivas y
complementarias. Sería una
estructura palindrómica: el
monómero sería una duplicación de
una información genética en una
organización palindrómica. También
se han hecho mapas de denaturación
de esta molécula, denaturandola
completamente y permitiendo
después que se reasocie. Se observa
que forma una estructura del tipo
pinche (b) y además se observa una
 estructura similar con un extremo de
DNA de hebra simple y además al
microscopio se observa un extremo
de DNA de hebra simple lineal
liberado (c). Esto da información
respecto a algunas características,
que habría algunas zonas de esta
molécula que tendría un nick en el
extremo lo que generaría que
cuando esta se denatura, una de
estas hebras siendo palindrómica
puede aparearse (el A y el A`son
complementarias) y la otra también
se renaturaría generando la otra
parte del dímero.

Se ha observado que en estos extremos de esta molécula de DNA de

aproximadamente 20 kb existen estructuras teloméricas. Cuando se hace un mapa de
renaturación parcial se observa una característica que también tiene simetría, lo que
da cuenta de los resultados anteriores. Aquí “claramente” se observa un eje de
simetría indicando una duplicación de información genética en direcciones invertidas.

Al hacer un mapa de restricción con

algunas enzimas como EcoRI, se
tiene que en los extremos hay sitios
de corte, por lo tanto al digerir esta
molécula se generan fragmentos de
mayor tamaño (A) y otros de menor
tamaño en los extremos.

La organización de esta pieza del DNA del macronucleo es más o menos esta: en la
hebra superior está la información de los RNA ribosomales 17 S y 25 S, lo mismo en la
hebra inferior. Como referencia, se muestran los sitios de corte con EcoRI.
Estas piezas de DNA se observan en el macronucleo, pero cuando la célula se está
diviendo muy lentamente el macronucleo deja de verse o de estar en la célula. Por lo
tanto, para el macronucleo se genera la información en el micronucleo (núcleo
germinativo). Por lo tanto estas piezas deben estar codificadas en el genoma del
organismo y en algún momento de su ciclo pasan a formar parte independiente de los
cromosomas.
¿Qué experimentos harían para ver como está en el cromosoma?
Básicamente en el cromosoma puede estar de varias formas: una, que la pieza esté tal
como está naturalmente, pero insertada. Esto es como está en el macronucleo (a),
están los cortes con la enzima de restricción y el centro de están las A y los extremos
Z. Si esto se corta con EcoRI vamos a tener un segmento que será doble A de
aproximadamente 10 (están todos * 104 daltons), y vamos a tener una duplicación de
este sector (Z) que es de 1,6. Como pueden ver en el núcleo puede estar en la misma
posición insertado (b). Si se corta con EcoRI se genera el segmento A (de 10) pero va
a generar un segmento, cuando encuentre un sitio de EcoRI en el genoma, que va a
ser mayor al tamaño de Z (mayor a 1,6) esto sería YZ y XZ (en ambos extremos). Si
está duplicado (c), vamos a tener lo mismo, pero con la diferencia que tendremos un
fragmento ZZ que será de 3,2. Si está solo la mitad de la secuencia (d), vamos a tener
un segmento YZ (mayor a 1,6) y un segmento AX (mayor que 5, un poco más grande
que la mitad del de 10), no tendremos el segmento AA de 10. Finalmente vamos a
tener un repetido en tándem (e) ZA y ZA, que tampoco me va a dar AA, pero me va a
dar un fragmento AZ de 6,6 (5 proveniente de una A más 1,6 proveniente de Z), un
fragmento YZ y un fragmento AX. Estas son las posibles ubicaciones de esta pieza
extracromosómica cuando está en el cromosoma.
Cuando se hace el experimento con mapeo de restricción e hibridación, se observa que
este fragmento está como la mitad del segmento en una posición ZA yendo de
izquierda a derecha (como en d). Cuando este DNA se escinde o se amplifica para ir al
macronucleo, se duplica formando un palíndrome.

El modelo que se ha visto es que se

genera una zona palindrómica repetida,
donde hay un pequeño repetido invertido
que permite aparear con este pequeño
gancho en el cual se genera un nick (en el
extremo 5´de a´), luego viene replicación
del DNA, y se va duplicando y liberando.
Finalmente se genera la estructura tipo
pinche (c) con la mitad de la información
que está en el macronucleo.
Posteriormente se genera una nueva
ronda de replicación, finalmente,
generando la secuencia palindrómica como
se observa en el macronucleo (e) y
dejando una propia intacta en el
cromosoma, de tal manera que cada vez
que pasen distintos ciclos de crecimiento
puede siempre tener la información y
sacarla afuera en múltiples copias cuando
lo necesite, esto para amplificar el número
de genes que codifican para RNAs
ribosomales.

Hay múltiples formas de genes extracromosómicos que están cumpliendo distintas

funciones en organismos eucariontes. Un modelo es el siguiente: se ha observado en
los extremos de este DNA lineal, múltiples secuencias repetidas de 4 G y 2 T. Estos
segmentos fueron clonados en un vector circular de Sacharomyces, fue insertado en la
levadura y encontraron que en los que entraron a la levadura, la molécula fue
linearizada. Esta estructura terminaba en una especie de pinche que protege al DNA de
la degradación 3`de endonucleasas.

Otro modelo: la pieza que está en el cromosoma sufriría un corte por algunos
repetidos, luego un rearreglo y esto sería la base para la replicación, generando una
estructura lineal de doble hebra.
Volvemos a la
variegación…
Se observó que
cuando se hace un
cruzamiento de estas
variedades de la planta,
en los cuales los óvulos
eran de un fenotipo, por
ejemplo blanca, y el
aporte del polen fuera
cualquiera, ya sea blancas
verdes o variegadas, el
fenotipo de la
descendencia era blanca.
El aporte femenino era el
que importaba. Si el
aporte femenino era
jaspeado, pueden haber
tres tipos de óvulos, uno
que lleva sólo cloroplastos
blancos, otro sólo verdes
y uno que lleva de los dos
(heteroplasmón). El
resultado es también
determinado por el aporte
femenino.
Cuando es variegado, la descendencia es variegada también, luego esta célula va a
mitosis y se producen células blancas y células verdes, teniendo el fenotipo variegado.

Una célula variegada que se divide, tiene que sufrir dos procesos: división nuclear
(mitosis) y el proceso hipotético llamado CSAR: por ejemplo las mitocondrias (o los
cloroplastos) de un tipo migran a un polo, y las del otro tipo migran al otro polo,
generando células con un solo tipo de mitocondrias (de heteroplasmón a
homoplasmón). Esta información genética entonces se debe a elementos
extracromosómicos.

CSAR: ocurre en el citoplasma y sería el

responsable de la segregación y
recombinación de los genes de los
orgánulos, produciendo las nuevas series de
orgánulos de las células hijas.

Otro ejemplo: células de neurospora, mutantes llamadas Poky (de crecimiento lento)
que se caracterizan por ser protótrofas para adenina (ad+). Por otro lado se tienen
organismos normales pero que requieren de adenina (ad-). Cuando se hace un
cruzamiento, donde el protoperitecio (femenino que aporta mitocondrias) es poky y las
esporas son masculinas normales, se produce un diploide que rápidamente hace
meiosis, en la cual se generan 4 esporas ad- y 4 esporas ad+ con segregación 1:1 o
sea mendeliana, indicando que el carácter de requerimiento de adenina es nuclear; sin
embargo todas son mutantes poky, porque el aporte citoplasmático lo da la parte
femenina. Para el recíproco ocurre lo mismo (pero al revés), todas las esporas son de
crecimiento normal. Esto indica que el carácter poky es citoplasmático.

¿Cómo se demuestra esto? Se toman las cepas de crecimiento lento que es marcador
leu+ y se toman unas de crecimiento normal que es marcador leu- (son células del
mismo tipo de apareamiento), se fusionan y se obtiene un heterocarionte. En este tipo
de fusión, los núcleos no se funden, sino que sólo el citoplasma de las dos células con
mismo tipo de apareamiento, de manera que posteriormente se selecciona aquellos
que segregan de genotipo crecimiento lento y leu-. Aquí nunca va a ocurrir una
recombinación nuclear porque los núcleos no se funden. Recordando que las células de
crecimiento lento eran leu+, de manera que si se encuentran células de crecimiento
lento y leu-, quiere decir que el marcador de crecimiento era extranuclear y se
combinaron mitocondrias de este tipo con núcleos que son leu-.
En el caso de clamydomonas tenemos dos tipos de
apareamiento, mt+ y mt-. Cuando se hace un
cruzamiento con un marcador de resistencia a
estreptomicina, que es un marcador que supuestamente
se encuentra en la mitocondria, y se pone este en la cepa
mt+, se hace un cruzamiento y se genera en el cepto de
la clamidomona se genera tipo de apareamiento 1:1
tipico de marcador nuclear, sin embargo todas
resistentes a estreptomicina. Cuando se hace el
cruzamiento recíproco, donde el marcador de sensibilidad
a estreptomicina está en el tipo de apareamiento mt+,
ahora todos los descendientes son sensibles a
estreptomicina, indicando que es un marcador
extracromosómico.

Otro de los ejemplos de marcador de

resistencia es en una levadura, donde
una cepa resistente a eritromicina de
tipo de apareamiento alfa, con una
cepa sensible y de tipo de
apareamiento A, forman un diploide
que es un heteroplasmón, estos se
siembran en baja densidad para que
segreguen, haciendo algunos que
segregan sean homoplasmones,
resistentes a eritromicina y otros
sensibles. Aquellos que son
resistentes, se hace que entren en
meiosis y se observan las esporas: el
tipo de apareamiento segrega 2:2
(cromosómicamente) sin embargo
todas las esporas son resistentes,
entonces este marcador de resistencia
es extranuclear.
 Similarmente con dos resistencias:
eritromicina y espiramicina. Se tienen
dobles resistentes y cuando se hace
que segreguen se puede tener, si un
diploide segrega doble resistente,
todas las esporas van a ser dobles
resistentes y con una segregación
mendeliana del tipo de apareamiento.
Si se hace sensible a ambos, todas las
esporas son sensibles a ambos, etc.
Una de las características de los genes
extranucleares, es que el cruzamiento
recíproco da resultados distintos, a
diferencia de los marcadores nucleares
en que el cruzamiento recíproco da el
mismo resultado.

El profe no explicó la imagen que

viene, dijo que era básicamente lo
mismo que lo que ya había dicho.
Retención o pérdida de la resistencia a
eritromicina cuando se inducen
mutantes petite en un cultivo de
células grandes resistentes. En las
petite, no puede analizarse
directamente la resistencia, por lo
tanto, cualquier posible resistencia
debe rescatarse cruzando las células
petite con células grandes sensibles.
En las yemas diploides si puede
analizarse la resistencia. Células petite
1 y 2 retienen la resistencia, que se
pierde junto con el determinante del
fenotipo grande, durante la inducción
de la mutación petite en las células 3.

Con esto, quería mostrarle que existen marcadores extranucleares con mucha
importancia dentro de la célula, de hecho hay muchas enfermedades que ocurren en el
genoma de las mitocondrias y producen graves alteraciones que afectan el músculo
esquelético y el cerebro, como la epilepsia.
 GENÉTICA CUANTITATIVA

En el lado izquierdo se dan las proporciones ya

conocidas para la genética mendeliana: 75%(alta) y
25%(baja), es decir 3:1. Aquí solo se compara la
dominancia o recesividad de dos alelos.
En el lado derecho las proporciones mendelianas
esperadas no se cumplen, mas bien se obtiene una
mezcla equitativa de ambos caracteres en F1 y luego
la distribución amplía su rango en F2 abarcando una
mayor diversidad de alturas posibles. Esto se debe
principalmente a las interacciones génicas que pueden
darse entre un numero elevado de genes de un pool.
Estas interacciones pueden ser la dominancia,
rececividad, epistasis, etc.
Principal diferencia es el numero de
genes que están en juego para la
determinación de un carácter.

Todos los caracteres que se han estudiado en Genética Mendeliana caen dentro de clases
bien distintas o discretas ( semillas arrugadas o lisas, plantas altas o enanas, flores
blancas o violetas). Estas clases pueden utilizarse para predecir el genotipo de los
individuos. Por ejemplo si cruzamos una planta de arveja alta con plantas enanas y
observamos la F1 conocemos el genotipo de las plantas enanas y podemos dar un
genotipo general para las plantas altas. Además si conocemos el genotipo podemos
predecir el fenotipo de la planta. Este tipo de caracteres se denominan discontinuos y
son generalmente cualitativos.

Otro tipo de características no pueden clasificarse en clases discretas. Cuando se analiza

una población segregante se encuentra una distribución continua de los fenotipos. Un
ejemplo es el largo de Nicotiana. La cual tiene individuos altos y bajos. Cuando se
cruzan estas dos líneas, el largo de la F1 es intermedio entre los dos padres. Cuando se
deja que la F1 se cruce entre sí, la distribución del largo de la F2 varía entre tan cortas
como las mas largas Nicotianas. La distribución se asemeja a la curva en forma de
campana adoptada en una distribución normal. Este tipo de características se denomina
caracteres continuos y no pueden analizarse de la misma manera que los caracteres
discontinuos. Como los caracteres continuos a menudo se pueden medir y se les da un
valor cuantitativo, se puede referir a ellos como caracteres cuantitativos y al
área de la genética que estudia este modo de herencia como Genética Cuantitativa.

Aquí se muestra una imagen que ejemplifica claramente algunos

caracteres cuantitativos en especies de plantas: Se puede observar la
variación para el diámetro floral, el número de partes florales y el
color de la flor. Cada característica está controlada por un número de
genes y es un carácter cuantitativo. Estas características también se
conocen con el nombre de caracteres complejos o multifactoriales
debido a los múltiples factores genéticos y ambientales implicados en
su expresión y se dice que presentan una herencia compleja.
Un poco de Historia...

En base a los descubrimientos hechos por Darwin (1859) y Mendel (1865-1900):

En 1910 la mayoría de los genetistas pensaban que los caracteres heredables eran
discontinuos y por ende contrastantes (Color pelo, de ojos, liso-crespo, etc.) y que este
tipo de caracteres eran los mas influyentes en términos Evolutivos (caracteres tipo
mendeliano).

En esa época surgen dos corrientes las de los Biometristas y los Mendelianos. Los
primeros estudiaban caracteres continuos tales como la altura, la inteligencia, entre
otros. Por otro lado los mendelianos estudiaban caracteres discontinuos como los ya
descritos. Se creyó por mucho tiempo que ambos tipos de caracteres y sus análisis
obedecían a leyes distintas. Ya en 1918 Ronald Fisher integró ambas corrientes
demostrando que la variación cuantitativa (caracteres continuos) era una consecuencia
natural de la herencia mendeliana (caracteres discontinuos).

Experimento de Johansen (1903)

Parte de una mezcla de semillas de Habichuelas,

separando entre las pequeñas (poco peso) y las
grandes (pesadas). Posteriormente al hacer cruces
entre pequeñas-pequeñas y grandes-grandes observó
que había gran variabilidad en la descendencia pero
que los limites del tamaño se restringían de acuerdo a
los parentales. Con esto la selección entre las líneas
fue ineficaz debido a la poca diversidad genética
presente en cada una.

Luego con un simple experimento de

autofecundación durante 6 generaciones
logró 19 líneas puras, lo que le permitió
demostrar que dentro de las habas
originales había diferentes genotipos, es
decir, había variancia genética. Cuando
autofecundó cada una de las líneas puras,
éstas presentaron una media de peso de las
semillas que fue individualmente distinta,
con una pequeña variación debida a la
variancia ambiental.

Viendo que las líneas puras (homocigotas)

tenían un peso medio constante,
característico de cada línea, Johannsen
dedujo que: 1) existe un valor esperado del
carácter que depende de la constitución genética de la población y 2) las variaciones
individuales deben ser atribuibles al único factor variable posible, que es el ambiente en
el que se desarrollan los individuos.
 Los experimentos de Johannsen permitieron concluir que la variación continua
observada se debe al genotipo y a efectos ambientales. Este concepto se puede describir
con la siguiente ecuación:
Fenotipo = Genotipo + Ambiente + interacción genotipo-ambiente

Experimento de Nilson-Ehle (1909)

Cruzo dos variedades de trigo puras que diferían en el color del

grano Rojo y Blanco. Obteniendo en la F1 un color intermedio
entre los de los dos parentales, posteriormente en la F2 obtuvo
7 variedades distintas de color del grano

¿Cómo explicar esto?

La hipótesis de Nilsson-Ehle fue que los caracteres

cuantitativos estaban determinados por muchos genes
mendelianos, con efectos pequeños y aditivos a los que llamó
factores polímeros o poligenes, y que el valor fenotípico del
individuo resultaba de la suma de los valores de sus genes más
una desviación producida por el ambiente.

Para llegar a esta conclusión realizo lo siguiente:

Suponiendo control
carácter por UN GEN
con 2 aleles SIN
DOMINANCIA

Suponiendo control del

carácter por DOS GENES
con dos alelos y donde la
intensidad del color depende
del numero de alelos

AyB Rojo
Ayb Blanco
De los dos supuestos anteriores se desprende que la variación de color puede ser
explicada por el numero de alelos que intervienen en su producción. En el caso de
donde hay solo 2 alelos las interacciones que estos pueden tener son mas restringidas
que en el caso de que haya un mayor numero de ellos.

Este grafico muestra los posibles

fenotipos a medida que aumenta
el numero de alelos. La
distribución es normal y los
fenotipos extremos cada vez
tienen menor frecuencia.

Además mientras mayor numero

de alelos estén involucrados en la
producción de un carácter la
probabilidad de los genotipos
extremos (similar a los
parentales) se va perdiendo.

2 alelos: 42 dihibridismo mendeliano, 1/16 probabilidad genotipos extremos.

3 alelos : 43 trihibridismo mendeliano, 1/64 probabilidad genotipos extremos.
4 alelos: 44 tetrahibridismo mendeliano, 1/256 probabilidad genotipos extremos.
n alelos: 4n n-hibridismo mendeliano, 1/ 4 n probabilidad genotipos extremos.

Aquí no hay mucho

que explicar..el cuadro
habla por si solo.

Esto es como el
triangulo de pascal en
matemáticas xD.
Ahora la parte estadística del asunto

La distribución de muchos caracteres genéticos se

aproximan a la Normal, esta distribución esta
caracterizada por el promedio y la desviación
estándar, esta ultima corresponde a cuanto se alejan
los valores del valor central (promedio). En nuestro
caso utilizaremos la varianza que se obtiene al
elevar al cuadrado la desviación estándar.

(a) se muestra las distribución genotípica de

una población donde por características
ambientales cada una responde de manera
diferencial teniendo su propia distribución
con un promedio y desviación
característicos
(b) Se observa una distribución normal, que se
obtiene de las contribuciones de las
distribuciones para cada genotipo.
El promedio de la distribución total es el
promedio de las 3 distribuciones ponderado por
las frecuencias genotípicas de cada uno.

Cualquier individuo que se encuentre entre las dos flechas en (b) puede pertenecer a
cualquiera de los 3 genotipos, esto se debe al alto solapamiento de las distribuciones.
Con esto no se puede hacer ningún análisis mendeliano sencillo para descifrar el
fenotipo de los individuos. De esto se desprende que un carácter cuantitativo es aquel
para el cual las diferencias fenotípicas medias entre distintos genotipos son pequeñas
comparadas con las variaciones entre individuos de un mismo genotipo.

Todos los caracteres fenotipitos que tomen distintos valores cuantificables en diferentes
individuos y no siguen un patrón de herencia mendeliana simple caen dentro del
termino de Variación fenotípica cuantitativa

Heredabilidad de un carácter

El nombre tiene una importante desventaja: parece que su significado es evidente; y por
el contrario, se trata de un concepto un tanto abstracto y es con frecuencia mal
interpretado. La idea de Heredabilidad fue concebida en el contexto de la Mejora
Genética Animal; su objeto era determinar hasta qué punto los caracteres observables
constituyen una buena guía para predecir lo que ocurrirá en la descendencia. Así,
Heredabilidad se define como el porcentaje de la variación observada que es atribuible
a los genes. Veamos un ejemplo. La estatura es un carácter sujeto a una fuerte
determinación genética, tanto en animales como en el humano. No obstante, el ambiente
tiene influencia.

Debe tenerse en cuenta que la heredabilidad es una media de la población. No tiene

ningún sentido decir que el 90% de los centímetros de estatura de Juan se debe a los
genes y el resto al ambiente. Lo que tiene sentido es decir que las variaciones de
estatura observadas en una población se explican, en un 90% por los genes, y el resto
por el ambiente. Consecuencia importante de esto es que si cambiamos el ambiente
donde se realizan las observaciones, la heredabilidad del carácter puede cambiar.

Una paradoja de este concepto es que

sólo tiene sentido hablar de
heredabilidad en aquellos caracteres
para los que existe cierta variabilidad y
no para aquellos que se encuentran
‘fijados’. Un ejemplo: la inmensa
mayoría de los humanos nacemos con
dos piernas y no hay duda de que esto
se debe a la información contenida en
el DNA. Por tanto, el carácter ‘tener
dos piernas’ se hereda por vía genética
y sin embargo la heredabilidad del
carácter es cero.

Así si en una población se presentan distintas distribuciones para un carácter, se

dice que el carácter es heredable.

Este es el método de selección artificial

para la determinación de la heredabilidad
de un carácter. Se parte con parentales
tomados de los extremos de la distribución
y los descendientes se crían en condiciones
ambientales controladas y comunes. Si se
observa una diferencia en la el promedio
de los grupos de descendientes, el carácter
es heredable.
Componente genético y ambiental de la heredabilidad de un carácter

Si se demuestra que un rasgo es parcialmente heredable en una población, es posible

cuantificar su grado de heredabilidad El valor fenotípico de un carácter en un individuo
de una población depende del genotipo y del ambiente.

F = valor fenotípico del individuo

F = G+E G = efecto medio del genotipo
E = efecto del medio ambiente

Si a este supuesto se le aplica el concepto estadístico de varianza:

Var(F)= Var(G) + Var(E) + 2Cov(G,E) ec.1

La covarainza se debe a una relación lineal entre las dos variables estudiadas, en este
caso la genética y la ambiental.

si la covarianza genotipo-ambiente es cero, es decir no hay relación lineal entre las

variables se tiene:
Var(F)= Var(G) + Var(E) ec.2

Heredabilidad de un carácter cuantitativo

La heredabilidad es la proporción de la varianza fenotípica total que es debida a causas

genéticas; en otras palabras, la heredabilidad mide la importancia relativa de la varianza
genética como determinante de la varianza fenotípica. Se pueden distinguir dos tipos de
heredabilidad: la heredabilidad en sentido amplio y la heredabilidad en sentido estricto.

la heredabilidad en sentido amplio (esta dijo que nos aprendamos)

se basa en la varianza genotípica (Vg) y fenotípica (VF)

H 2 = VG / VF 0< H 2 >1 ec.3

la heredabilidad en sentido estricto

g: efecto medio del genotipo

a: efecto aditivo de los alelos que forman el genotipo
d: efecto no aditivo (o dominante) de los alelos que forman el genotipo
g=a+d

mide la proporción de la varianza fenotípica total que está determinada por la varianza
genética aditiva (Va) y, por tanto, excluye la contribución debida a la varianza
dominante y epistática. La heredabilidad en sentido estricto es la causa principal del
parecido fenotípico entre parientes, es el determinante principal de las propiedades
genéticas de una población y determina la tasa de cambio evolutivo del carácter en la
población; es decir, la respuesta a la selección.

h2 = Va / VF 0< h 2 >1 ec.4

Métodos de estimación de la heredabilidad en poblaciones experimentales

Experimento de selección artificial para aumentar o

disminuir la longitud del ala en diversas poblaciones
de Drosophila subobscura. Se van cruzando las de
alas grandes con las de alas chicas, así se obtendrán
individuos con alas cada vez mas grandes o
pequeñas dependiendo el sesgo de la selección, es
decir si se van seleccionando alas mas grandes o
mas pequeñas.

Esto produce infertilidad y se tiene que partir desde

un nuevo cruce para lograr la selección, la
infertilidad se debe a que los genes están ligados y
la selección de uno puede afectar la de otro.

EJEMPO

Los progenitores tienen tiempos distintos en llegar a la madurez, la F1 tiene un tiempo

intermedio y la F2 un tiempo intermedio en un rango mas amplio.

 Para el caso de PA, PB y F1 la varianza se debe a factores ambiental ya que

son genéticamente homogéneos los individuos de cada muestra.
 Para el caso de F2 la varianza se debe a factores genéticos y ambientales, por
eso su valor se aleja tanto de la de los parentales y F1, aunque el promedio siga
siendo similar.
Ocupando la ec.1 se puede determinar la varianza genotípica

14,26 = Var(G) + 2,88 Var(G) = 11,38

Ocupando la ec.3 se puede determinar la heredabilidad en sentido amplio

H 2 = 11,38/14,26 H 2 = 0,79 el 79% de la heredabilidad se debe al factor

genético
 Esta grafica representa la heredabilidad, la
línea punteada donde h 2 =1 representa la
condición donde la descendencia hereda la
totalidad de los caracteres de sus
progenitores (x = y), en el caso de la línea
roja donde h 2 =0.5 la heredabilidad no es
total.

Un ejemplo que puede ser representado por

esta curva es la altura, donde padres mas
altos como promedio tienen hijos mas altos,
por otro lado padres mas bajos tienen hijos
de menor estatura.

Norma de Reacción

Corresponde al rango de expresión de un determinado genotipo, el cual esta

influenciado por factores ambientales. Este genotipo tendrá una expresión distinta
dependiendo del tipo de ambiente.
El genotipo tiene un rango de expresión máxima, y dentro de ese intervalo existen
diferentes grados de expresión dependiendo de las condiciones ambientales.
En consecuencia una distribución de características ambientales particulares se
refleja en una distribución fenotípica.

Por ejemplo el color de la esta flor depende del pH

de suelo, presentando color azul si el pH es bajo y
Rosado si el pH es alto, aquí se muestra como el
genotipo se ve influenciado por el ambiente, en
este caso por la acidez del suelo.

En los gatos siameses las partes del cuerpo mas expuestas

al frió son de un color negro mientras que las partes que
están a una mayor temperatura son de color blanco, aquí
la temperatura afecta la expresión de un gen involucrado
en la pigmentación (acuérdense eso de las enzimas termo
sensibles).
 En el caso de la mosca Drosophila vestigial el tamaño
alar es mayor a mayor temperatura, durante su
desarrollo.

En el eje x se encuentra el factor ambiental

(temperatura) y en el eje y el numero de
individuos con un determinado fenotipo
(supongamos altura), se observa como el numero
de individuos con una altura mayor aumenta desde
18ºC hasta 20ºC, esta ultima temperatura
correspondería al optimo ya que se encuentra el
mayor numero de individuos con ese fenotipo. A
partir de los 20ºC el numero de individuos con
mayor altura va disminuyendo como consecuencia
de un aumento en la temperatura.

Se muestra como una población compuesta

por dos genotipos diferentes con diferentes
normas de reacción tiene una distribución
fenotípica que depende de la distribución de
ambientes. Si el ambiente se reparte como la
curva de la izquierda (eje x), la población
tendrá una distribución fenotípica unimodal,
ya que ambos genotipos tienen normas de
reacción muy similares. En el caso de la
distribución ambiental de la derecha, las
normas de reacción de ambos genotipos están
diferenciadas, es decir, responden de manera
diferente a esas condiciones ambientales
produciendo fenotipos marcadamente
distintos.
PENETRANCIA = En algunos casos no todos los individuos que poseen un genotipo
conocido muestran el fenotipo especificado. La frecuencia con que un alelo dominante o
un homocigoto recesivo se manifiesta dentro de una población se llama penetrancia del
gen. La penetrancia depende del genotipo y del ambiente.
La penetrancia es completa (100%) cuando todos los homocigotos recesivos
muestran un fenotipo y los homocigotos dominantes junto con los heterocigotos
muestran otro.

EXPRESIVIDAD = grado de influencia de un gen sobre un fenotipo. Expresividad se

refiere al grado con que un gen penetrante o un genotipo es fenotípicamente expresado.
Muchos caracteres del desarrollo no solamente no consiguen penetrar a veces, sino que
cuando penetran, muestran también un patrón variable de expresión, desde muy tenue a
muy extremo.
Clase de regulación en procariontes, por Marcelo Baeza

E.coli tiene alrededor de 4279 genes, de estos genes, 2600 (60%) se expresan en
condiciones de laboratorio(condiciones optimas de nutrientes pH, temperatura etc.), de
los cuales 350 codifican para el 90% de las proteínas con funciones vitales, el resto de
estos genes se expresan solo en condiciones especiales, condiciones de stress o
condiciones especiales del ambiente. El hecho que existan genes que se expresen
solamente en ciertas condiciones habla de algún mecanismo de regulación. De este
modo logramos mantener una eficiencia metabólica al máximo posible, esto quiere
decir, que ciertas proteínas no se expresaran siempre, si tenemos suficiente carbono y
necesitamos crecer, la bacteria no se preocupara en adquirir fuentes de carbono y solo
crecerá, solo cuando se acabe el carbono volverá a expresar proteínas para la captación
de este, otros aspectos que se mantendrán controlados con la regulación de la expresión
génica, es el mantenimiento del balance metabólico, y la adaptación a diferentes
ambientes.
Hablando de la regulación propiamente tal, esta puede llevarse a cabo en
diferentes lugares de la célula, puede realizarse a nivel del Dna y su compactación
(histonas y cromatina), una determinada compactación del Dna ya puede ser síntoma de
que un dna debe o no transcribirse. La temperatura es fundamental en este aspecto, ya
que a temperaturas muy bajas el Dna se ve mas compactado, en cambio a temperaturas
mas elevadas el dna puede descompactarse y los promotores quedar más expuesto.
También puede haber regulación a nivel de la transcripción, este tipo d e regulación
es el mas común y el mas utilizado por la célula, también existe la regulación a nivel
del Rna, mas común en eucariontes, tiene que ver en como se procese este y
dependiendo de eso que tipo de información entregara. Otro tipo es la regulación a
nivel de la traducción, ya que existen variadas MODIFICACIONES (NUNCA
MUTACIONES) post transcripcionales, que van a ser los indicadores finales del
producto génico (atenuación). Finalmente tenemos regulaciones a nivel de la proteína ya
que esta puede activarse o inactivarse dependiendo de las interacciones que esta
presente.
 Al hablar de regulación, nosotros nos enfocaremos a la cantidad de producto
génico que va a haber en la célula en algún momento determinado. Por esto es que nos
centraremos en dos pasos, el paso de dna a rna, la trascripción, y el paso de rna a
proteína, traducción. Esto dos pasos son los mas determinantes a la ora de la regulación.

Algunos conceptos:
- Genes constitutivos: genes que se expresan todo el tiempo y no son regulados.
Genes que se necesitan para que la célula sea célula, sin ellos no viven: Rnapol,
proteínas estructurales, etc.
- Genes regulados: Genes que se encuentran en ciertas condiciones específicas, a
menudo controlados a nivel de la trascripción.
- Genes estructurales: Codifican para proteínas usadas en biosíntesis, metabolismo
o rol estructural.
- Genes regulatorios: Genes que regulan la expresión de otros genes. A partir de la
interacción de sus productos génicos con secuencias especificas.

Repitiendo lo mismo, nosotros tenemos un gen que es una secuencia de dna que es
transcrita a una molécula de rna, y puede encontrarse transcribiéndose o no, las zonas no
transcritas son regiones en donde existen elementos regulatorios, estos elementos
afectan la expresión de la secuencia a la cual están unidos físicamente.

La regulación puede ser positiva o negativa, cuando hablamos de regulación negativa

nos referimos a una proteína que se une al dna y apaga la expresión del gen, esta
proteína toma en nombre de represor, en el caso contrario de regulación positiva
hablamos de una proteína que se une al dna activando o “prendiendo” un gen, en este
caso la proteína se llama activador.( es obvio que esto vale solo para genes regulados y
no constitutivos).

Esta regulación se lleva a cabo en un elemento regulatorio que se encuentra en el dna,

rió arriba del promotor, es en esta zona donde se une el represor o activador. La unión
se lleva a cabo por algunos modelos comunes, existen 6 modelos, solo vemos los 3 mas
importantes. El primero es un modelo en el cual la proteína tiene 2 dominios de alfa
hélice y una zona no estructurada entremedio, esta se intercala en el surco mayor
permitiendo al unión. El segundo, es similar, solo varia la forma en como se unen los
dominios proteicos entre si, en este caso la unión esta mediada por zinc, en el tercero se
cumple la misma base pero la unión de dominios es a partir de cierres de leucina, zonas
de la proteína con repeticiones de leucina que permiten la unión de entre ellas.
Definiendo otros conceptos tenemos el elemento cis y el producto trans, el elemento cis
es una zona de dna que afecta la transcripción de solo la región contigua a el,
generalmente no codifica para ninguna proteína y solo cumple función regulatoria. El
producto trans es una proteína que puede actuar sobre cualquier copia de dna blanco con
el fin de regular su transcripción, este producto regula no necesariamente la región de
dna en donde fue codificado, puede ir a lugares de dna alejados a su transcripción, es un
elemento difusible y puede ser un rna también.

Los elementos trans o reguladores, no siempre se transcriben en su forma activa, estos

pueden estar inactivos o todo lo contrario que están siempre activos y se pueden
inactivar, es por esto que tenemos otros actores en la regulación, que tienen la función
modificar el regulador con el fin de activarlo o inactivarlo. Estas modificaciones pueden
ser alostericas, un ejemplo es la proteína cAmp, que se une al regulador, permitiendo
que este sufra cierta modificación conformacional y exponga su sitio de unión al dna
uniéndose a el. Estas moléculas pequeñas orgánicas que se unen a las proteínas
regulatorias, se denominan efectores o ligandos.
Los efectores pueden ser de 4 tipos,
-Inductor: inactivan a represores.
-Corepresores: activan a los represores.
-Coactivador: Activan a activadores.
-Inhibidores: inactivan a activadores.

Por ejemplo, un gen requiere de una proteína reguladora de tipo activadora, solo así se
une la polimeraza y transcribe, sin embargo esta proteína reguladora no puede unirse sin
su efector, si el efector se une, la proteína cambia conformacionalmente y logra unirse al
dna y así la polimeraza también lo hace, el efector en este caso es un coactivador, ya
que activa al activador. En un caso contrario existe un regulador que esta unido al Dna
bloqueando el ingreso de la polimeraza, para ellos en necesario que un efector se una a
ese regulador, para que este salga del Dna, dejando el promotor descubierto y asi la
polimeraza podrá unirse. Este ligando es un inductor, inactiva al represor.

Ahora veremos específicamente, los dos tipos de regulación negativa y los dos tipos de
regulación positiva.
Con respecto a los dos tipos de regulación negativa tenemos, la negativa inducible y la
negativa reprimible.
- regulación negativa inducible: el regulador se encuentra activo unido al Dna , lo
que no permite que se una la polimeraza (negativo), es decir la transcripción esta
apagada, cuando llega el ligando que es el inductor este se une al regulador,
inhibiendo su acción, lo cual genera que este se libere del DNA y así la
polimeraza pueda transcribir. Ej: operon lactosa

- Regulación negativa reprimible: En este caso la transcripción esta activa, al igual

que el regulador, cuando hay señal de que no se necesita mas producto, un
ligando se une al represor activándolo, y permitiendo que este se una al dna y
reprima la transcripción. El efector en este caso es un correpresor, ayuda al
represor a apagar el gen.
 - Regularon positiva inducible: El activador puede unirse al dna y prender el gen
solo cuando esté el ligando unido, generalmente la transcripción se encuentra
apagada, hasta que se envía señal de que se necesita producto, esa señal es el
ligando que es un coactivador.

- Regulación positiva reprimible: el activador se encuentra unido sin ligando al

Dna permitiendo la transcripción activa, sin embargo cuando ya no se necesita
mas del gen, se envía señal que es el ligando, en este caso inhibidor, para que
este se una al activador y lo reprima, de ese modo ya no se puede continuar la
transcripción ya que la polimeraza no se puede unir en ausencia de proteína
activadora. Ej: operon triptofano.

Cuando se dice inducible o reprimible, se refiere a que la transcripción puede inducirse

o reprimirse, ya sea de manera negativa o positiva.

Genes anabólicos v/s genes catabólicos

Saber esto sirve para entender el motivo de todas estas regulaciones, sabemos que el
catabolismo, es la degradación de alguna fuente de carbono, para producir energía y
algún desecho u otro compuesto. El anabolismo de manera diferente es utilizar esa
energía y algunas moléculas pequeñas orgánicas o inorgánicas, para sintetizar productos
utilizables.
Desde el punto de vista del catabolismo, los genes implicados en su acción se
encuentran generalmente inactivos, hasta que aparezca un sustrato (célula muerta de
hambre que se come lo que aparece), operones reprimidos hasta que se necesiten. En el
anabolismo ocurre lo contrario ya que la célula se encuentra generalmente sintetizando
productos, es por eso que los operones del anabolismo se encuentran generalmente
activos, hasta que ya no se necesite mas de algún producto o se agote la energía.

¿Como actúan los represores y activadores?

Lo que hace el represor es impedir que la polimeraza se una o pase por el promotor,
llega antes y se une al sitio donde debería unirse la polimeraza, el activador hace lo
contrario, este se une a regiones cercanas del sitio de unión a polimeraza, e interactúa
con las proteínas de ella, de este modo la fuerza de unión de la polimeraza será mucho
mayor (aumenta el KB= constante de unión) y el complejo Dna polimeraza será mas
estable. Esto generalmente funciona en promotores débiles, los cuales unen una
cantidad de polimeraza específica y pequeña.

Proteína CAP (proteína activadora catabólica)

Fue el primer regulador descrito (45kda), en los años 70, es dependiente de

cAmp y actúa activando la transcripción de más de 100 promotores los cuales se
denominan promotores dependientes de CAP. Un promotor dependiente de CAP solo
requiere de la polimeraza, la proteína CAP y obviamente el mismo dna. La mayoría de
los otros promotores sean eucarióticos o procarióticos, son mas complicados de regular.
Lo que hace CAP es unirse a una región cercana al promotor y permite que la
polimeraza se una mas establemente, la gracia de este regulador es que tiene tres tipos
de formas de activar a la transcripción dependiendo a la zona donde se una. Entonces
esta proteína CAP se une como dímero a distintas zonas rió arriba del promotor, estas
zonas están establecidas ya que tienen que ser múltiplos de las vueltas del Dna, o sea de
la cantidad de nucleótidos necesarios para que se cumpla una vuelta en el dna (alrededor
de 10 nucleótidos) (-41,-61,-92). Cabe destacar que los promotores CAP dependientes
no poseen buenos sitios de unión a factor sigma (-10 -35), por lo tanto la acción de CAP
aumentara la formación del complejo cerrado y complejo abierto.
Entonces tenemos la polimeraza con todas sus subunidades, entre ellas la alfa(2
de ellas por polimeraza), esta se divide en tres dominios, un dominio carboxilo y uno
amino, unidos por una zona poco estructurada muy flexible de alrededor de 13
aminoácidos, el dominio amino(NTD) se encuentra unido a las otras subunidades del
complejo, en cambio el dominio carboxilo(CTD) se encuentra como suelto e
interacciona con el dna y proteínas reguladoras, en este caso la proteina CAP, dicha
soltura se da gracias a la estructura central flexible.
 Conociendo todo esto, y teniendo en cuenta el sitio de unión de CAP y como
interacciona con la subunidad alfa, y los otros componentes de la polimeraza,
establecemos 3 tipos de activaciones CAP dependientes.
- Cap dependiente de clase 1: se une en su región del Dna en la posición -61.5, e
interacciona con uno de los 2 dominios carboxilos de la subunidad alfa, esto
ayuda que la polimeraza se encuentre estable en el promotor y no se desarme.
Acción de simple reclutamiento, formación del complejo cerrado. Interactúa
solo en un punto con la polimeraza.

- Cap dependiente de clase 2: Se une en sitio -41.5 y queda entre la polimeraza.

Esta el factor sigma, luego esta la proteína CAP y luego el dominio carboxilo de
la subunidad alfa, aquí CAP interacciona en 3 puntos con la polimeraza, se dice
que esta clase permite la formación del complejo cerrado y abierto.
 - Cap dependiente de clase 3: Se requieren dos dimeros de Cap y por ende los dos
dominios carboxilos de las subunidades alfa, existe un caso en el que cada
dimero se une con la subunidad alfa como fue descrito para la clase 1(al igual
que antes solo participan en la estabilidad del complejo cerrado), y otro caso en
el que un dominio carboxilo se une mediante mecanismo de clase 1 y otro
mediante mecanismo de clase 2(participa en la formación del complejo abierto y
cerrado). El dimero de Cap que se une en ambos casos a el dominio carboxilo
según el mecanismo clase 1, se une al dna en la región -93,-103, en cambio el
otro dimero que se une al otro carboxilo de la subunidad alfa, puede unirse a la
región -62 si es de la clase 1, o a la región -42 si es de la clase 2. Este complejo
genera mucha mas estabilidad y es empleado específicamente en promotores que
son muy muy débiles, el complejo se llama complejo cuaternario (dos dimeros
de Cap- Rnapol – Dna.

Ambos dimeros unidos con dominios alfa según mecanismo clase 1

Un dimero unido según clase 1 y otro según clase 2

Los puntos de interacción y las regiones en donde se une cada dimero Cap quedan bien
ilustrados en las imágenes.

Tarea para la casa es predecir que promotor es más débil y cual es menos débil.
Par finalizar existe un mecanismo de antiactivacion, en el cual una proteína se une al
sitio del dominio carboxilo de la subunidad alfa, por lo tanto impide el reclutamiento de
la polimeraza y así la transcripción no es activada de manera correcta. La proteína que
se intercala es la CytR fundamental en el metabolismo de purinas.
Regulación de la expresión génica en procariontes
Clase 2 Marcelo Baeza

Dentro de la regulación génica existe una regulación fina, que esta definida por la
cantidad de sustrato necesaria. Este es el caso de los operón lactosa (catabólico) y
triptófano (anabólico).

Pero primero, que es un operón? Es un

grupo de genes regulados coordinadamente
por un promotor. Los genes se transcriben
en un solo RNA, llamado RNA
policistronico. Dentro de los genes que son
regulados por el mismo promotor (sitio
regulador), podemos encontrar genes
estructurales y otros reguladores. Los
genes estructurales son los que van a dar
origen a la enzima o grupo de enzimas
encargadas de la función metabólica. En
cambio los genes reguladores codificar
para una enzima o regulador que van a
estar a cargo de si está prendido o apagado
el operón.

Arriba se puede ver el esquema de un operón, se tiene la secuencia de DNA promotora,

que generalmente representa a un promotor débil, y el sitio activador donde se une la
proteína activadora como la proteína cap. También se puede ver la secuencia de DNA
llamada regulador, es el gen que va a dar origen al regulador (producto génico) y este se
va a unir al operador o sitito de unión del represor, ya que la regulación del operon es
por represión de esta zona. En el caso del operon se tiene que el operador es cis y el
regulador es trans, porque este va a producir el regulador que se va a unir al operador.
A pesar de que los genes se transcriben todos como un solo RNA, cada uno de ellos
presenta su sitio de inicio y término de la traducción por lo cual son enzimas
independientes. El sitio regulador se transcribe constitutivamente y va a depender si el
producto génico se une al sitio operador o no para tener prendido o apagado el operon.
Operon Lactosa:

Como se descubrió el operon lac?

Se puede ver una curva de crecimiento diauxico, en donde se utiliza como primera
fuente de carbono la glucosa y luego se ocupa la lactosa. Se puede ver en el grafico que
ahí una fase exponencial de crecimiento, después hay una pequeña fase estacionaria y
luego, en vez de mantenerse la fase y proceder a la muerte se produce una nueva fase
exponencial. Esto se puede explicar por las fuentes de carbono que utiliza la bacteria,
para la primera cuerva exponencial se pudo apreciar que la cantidad de glucosa iba
disminuyendo pero que la lactosa se mantenía constante. Cuando la glucosa ya se acaba,
comienza a ocuparse la lactosa. Conclusión: E.coli utiliza dos fuentes de carbono,
pero no las ocupa las dos a la vez, primero glucosa y luego lactosa.

Se hicieron posteriormente una serie de experimentos para probar esto, y se llego a la

conclusión que para que la bacteria use lactosa no debe haber glucosa disponible.
Cuando llega glucosa a la célula, esta se fosforila para entrar y luego hace glicólisis. En
cambio la lactosa entra en la célula y luego tiene que ser descompuesta en los dos
azucares que la componen
galactosa y glucosa. La molécula
de glucosa que se origina de la
partición de lactosa se va
directamente a glicólisis, pero la
galactosa debe ser fosforilada y
transformada posteriormente en
glucosa para pasar a la glicólisis.
De una molécula de lactosa se
pueden generar dos moléculas de
glucosa y esto se puede pensar
que aporta mayor poder
energético que una glucosa, pero
la cantidad de enzimas que se
necesitan para convertir lactosa en dos glucosa es muy grande, por lo que es mucho mas
caro que usar glucosa, ya que la idea es que con poco esfuerzo obtener la mayor
cantidad de energía posible, por lo que primero usa glucosa.

Como hace todo esto la célula?

Normalmente la glucosa es transportada al interior de la célula por transportadores de

glucosa que se encuentran en la membrana y acoplado a este hay una serie de proteínas
que realizan una serie de fosforilaciones partiendo por fosfoenolpiruvato, traspasando el
grupo fosfato hasta llegar a la glucosa. Luego que la glucosa ya esta fosforilada puede
entrar y realizar glicólisis. Que pasa si no hay glucosa? No hay nada que fosforilar, pero
la cadena sigue funcionando y el fosfato se transfiere a otra proteína llamada adenilato
ciclasa, la cual se activa y comienza a generar cAMP, que va a unirse a la proteína CAP
o CRP (proteína receptora de cAMP), cambia su conformación dejándola activa y se va
poder unir a una región del DNA ayudando con esto a la transcripción de los genes
hasta que la célula diga que no es necesario seguir produciendo cAMP y eso pasa
cuando llega nuevamente glucosa, ya que se restaura la cadena de fosforilaciones. Como
la cantidad de cAMP no va a ser suficiente en presencia de glucosa, la proteína CAP va
a estar inactiva y el operon por lo tanto apagado.
Aquí se puede ver el sitio
donde se une CAP y por
consiguiente la activación del
operón lac. Como se puede
ver el operon consta de 3
genes, lacZ, lacY y lacA.
LacY es una lactosa
permeasa, que permite la
entrada de más lactosa. LacZ
y lacA son las encargadas de
romper lactosa y pasar a
glucosa + galactosa.
No siempre que este unido
CAP asegura que el operon este prendido, por eso esta el sitio operador que detecta
aparte de la presencia de cAMP, la ausencia de glucosa y la presencia de lactosa. Para
que el operon este prendido debe haber una forma en el que la célula detecta la
presencia de lactosa en el medio y la ausencia de glucosa y regule así la transcripción
del operon.

Otro gen involucrado es lacI, es el regulador que va a producir un represor que se une al
operador y bloquea la transcripción. El represor se une al operador que se encuentra al
lado del promotor y con esto entorpecer un poco al promotor, apantallando la región
promotora por lo que la polimerasa no se puede unir y no se inicie con esto la
transcripción.

Este paso es
independiente si el
operon esta
activado o
desactivado por la
proteína CAP, que
por mucho que se
una CAP al sitio
activador si el
represor esta unido
al operador, no
habrá transcripción
Se puede ver en el esquema a lacI con su promotor constitutivo, la producción de
represor por parte de lacI y la unión del represor al sitio operador (lacO) con lo que no
se puede producir la transcripción del operon. Este es el caso para la ausencia de
lactosa. Por mucho que haya cAMP y CAP unido al sitio activador, no se va a producir
transcripción si el represor esta unido al operador.

Si hay lactosa y no hay glucosa en el medio, se tiene que prender el operon. El represor
se inactiva porque la lactosa es capaz de unirse a el y con esto el represor no se puede
unir al sitio operador y se produce la transcripción de los genes estructurales. LacZ, lac
Y y lac A. Para que se produzca esto el sitio activador tiene que estar unido a la proteína
CAP, ya que esto demuestra que hay cAMP y por lo tanto, no hay glucosa.

Se muestra el resumen para lo dicho anteriormente

Operon triptófano:

- Responsable de la síntesis de triptófano

- Reprimido por la presencia de triptófano (apagado)
- Cuando triptófano disminuye el operón es expresado, generalmente el operon esta
prendido porque sintetiza triptófano
- Triptófano actúa como CO-REPRESOR, y a diferencia del operón lac no induce la
expresión.
- No necesita el sistema regulatorio CAP-cAMP
- Tiene un promotor fuerte, por lo que no necesita ser activado por CAP
- El regulador se transcribe constitutivamente pero de forma inactiva
En el caso de los operones anabólicos, la célula tiene que tener una vía que le diga que
la cantidad de triptófano es la suficiente para la cantidad de proteínas que esta
sintetizando. No puede tenerlo muy encendido ya que se gasta mucha energía
innecesaria y tampoco puede dejar que los niveles de triptófano sean muy bajos porque
todas las proteínas que lo necesiten no se podrán sintetizar de la manera correcta. Y el
método que tiene para regular el operon es detectando las concentraciones de triptófano.

- Una regulación de la expresión del tipo “encendido-apagado” no es óptima para vías

biosintéticas. La necesidad de triptófano difiere bajo distintas condiciones de
crecimiento.
- La expresión está relacionada con la [triptófano] por un mecanismo de control fino
denominado ATENUACION
- Este control fino sobrepasa al control de la transcripción. De hecho, la transcripción
termina en forma prematura si la [triptófano] es limitante.
- La atenuación es una característica de la mayoría de los operones biosintéticos.
- Tiene una regulación a nivel de la traducción

Atenuación en el operón trp

Adiciona control fino a la regulación del operón trp.

Varios puntos claves:
1. Transcripción y traducción están acoplados en bacteria (atenuación requiere esto).
2. La síntesis de una secuencia líder rica en Trp (2 de 14 aa) influye si se completa la
transcripción del operón.
3. Si la [Trp] es adecuada, la transcripción termina antes del operón trp.
4. Si [Trp] es inadecuada, la transcripción es completada.
5. Término de la transcripción es determinado por la secuencia líder mRNA.
Aquí se puede ver el RNA producido y la región que se va a traducir. Tenemos el sitio
de inicio de la traducción y una secuencia que tiene varios invertidos repetidos (1, 2, 3
y 4). Dentro de la secuencia líder hay dos codones contiguos que codifican para
triptófano, después de la región 1 y antes que comience la región 2. Entre los invertidos
repetidos pueden hibridar y formar tallos y loops, típicas estructuras secundarias de los
RNA. Puede formar estructuras hibridando:
- 1+ 2 y 3+4
- 2+3

En concentraciones adecuadas de trp (alta), el ribosoma no tiene problema para

sintetizar los péptidos, ya que tiene trp disponible y pasa sin problema por la zona en
que se encuentran los 2 codones para triptófano. Cuando se produce esto la hebra 1 y 2
no pueden hibridarse pero se hibridan las regiones 3 con la 4, teniéndose finalmente un
tallo – loop- tallo – loop – cadena de uracilos, lo que hace referencia al término
independiente de Rho de la traducción. O sea cuando hay una alta cantidad de trp se
produce esta estructura y se para la traducción.

Ahora cuando hay una baja concentración de trp, el ribosoma empieza a traducir pero
cuando llega a la zona de los 2 codones para trp, va a tener un pequeño retraso o pausa
en la traducción ya que ahora no hay trp disponible y va a dejar libre las zonas 2 y 3 que
se van a aparear y se llama esto secuencia de anti-terminación, esto quiere decir que
genera una estructura que no es de terminación de la traducción, ya que la zona 4 queda
apartando la cadena de U. El tallo que se forma queda fuera de la polimerasa por lo
tanto no es impedimento para ella y puede seguir normalmente para traducir el operon.
Este péptido líder se encuentra antes de los genes estructurales del operon, por lo cual
en el caso de alta [trp] no va a haber mensajero para traducir ya que la polimerasa fue
interrumpida y se “soltó”. En el caso de baja [trp] la polimerasa no se ve impedida y se
traducen sin dificultad los genes del operon. Este hecho es independiente si el operon
esta activo o inactivo porque es una regulación que viene después que se comenzó
la transcripción, se censa con respecto a la [ ] si se sigue o no.

Dependiendo de la [trp] el ribosoma va a apantallar o no la región 1, para que la región

1 pueda ver a la 2 y se formen las distintas estructuras.
[] minima que entorpece la traducción es menor para trp y mayor para his, ya que para
inhibir la traducción tiene que haber mucho mas his para que el ribosoma pueda unir a
todos los codones e interferir la región 1 con la 2, en cambio para trp es mucho menor
ya que son solo 2 codones los involucrados. Esto se relaciona con el hecho de que las
proteínas tengan menos trp que his.

Atenuación v/s Represión

Represión  responsable de una regulación de 80 veces. (Activación o no)
Atenuación  6‐8 veces.
Regulación combinada  500 veces
 Regulación de la expresión génica en Eucariontes
Víctor Cifuentes

El genoma de los organismos es relativamente grande; un organismo relativamente

pequeño como lo es E. coli tiene un genoma de 4,5 a 4,6 x 106 pares de bases. Un
organismo eucarionte superior tiene una mayor cantidad de DNA y si nosotros
asumimos que la mayor parte de ese material esta codificando para proteínas o mRNA y
todos están expresándose a la vez, deberíamos pensar que la célula es un caos. Existen
mecanismos que permiten organizar esto y hacen que los genes se expresen de manera
controlada, haciendo que haya una expresión basal de los genes necesarios.

Los organismos eucariontes se caracterizan por tener estructuras membranosas dentro

de la célula, como el núcleo, que separa el material genético del citoplasma donde va a
ser traducido a proteína. Para que este DNA pueda traducirse normalmente, debe pasar
por una serie de controles que veremos a continuación y que llamaremos “Controles de
regulación de la expresión del material genético”:

1-. Control transcripcional: Ocurre antes de que se genere RNA y funciona en base a
mecanismos que provocan o inhiben la transcripción.
2-. Control del procesamiento del RNA: En eucariontes la región codificante esta
interrumpida por intrones. De esta manera, se controla que se produzca el splicing (corte
y empalme) para que el mRNA esté listo para salir al citoplasma. En otras palabras, se
controla la generación de RNA maduro.
3-. Control del transporte y localización de RNA: Como el mRNA debe salir del
núcleo al citoplasma cuando esta maduro, existe un control del transporte de la molécula
y su ubicación.
4-. Control de la traducción: una vez que el mRNA logró pasar y está en óptimas
condiciones para traducirse, aparece este control que da la aprobación para que se
produzca la traducción.
6-. Control de la actividad proteica: regula la inhibición de la traducción de una
proteína o permite su control.
5-. Control de la degradación del mRNA: Este mecanismo controla la cantidad de
mRNA que ha sido transcrito. Para la célula sale muy caro llevar a la traducción un
mRNA que no conduce; por ejemplo un mRNA que contiene codones de término de la
traducción prematuros (veremos mas adelante).
Degradación del mRNA con codones de término prematuros (PTC)

Describiré el proceso paso a paso como se observa en la imagen:

1-. Las levaduras presentan mRNA con baja cantidad de intrones y en su secuencia, se
destaca en particular la secuencia DSE. Observen que a diferencia del mRNA de
mamífero, el de levadura se encuentra íntegro. En el paso 1 en mamíferos, vemos trozos
de exones que darán origen a un mRNA maduro. El término PTC señala un codón de
término prematuro en ambos mRNA.
2-. En levaduras, el codón DSE será al cual se una la proteína llamada DCF, que
corresponde aun factor de unión. Cuando no está actuando la veremos de un color
anaranjado y cuando está actuando la veremos de color verde. En mamíferos sin
embargo, no existe esa secuencia, por lo que las DCF van a reconocer el sitio de unión
de los exones y es ahí donde se unirán al mRNA.
3-. Se observan el mRNA de levadura y el mRNA de mamíferos juntos, no es una doble
hebra. Ambos mRNAs se observan en orden 5’ a 3’. Esto se hace para simplificar la
observación pues los pasos a seguir son similares. Los sitios correspondientes a AUG,
PTC y Ter están a la misma distancia de los extremos en ambos mRNA.
4-. Una vez que DCF se une al mRNA, pueden ocurrir tres cosas:
a) Proceso natural: no hay PTC por lo tanto el ribosoma reconoce al factor de unión, el
cual permite que el ribosoma se ensamble y comience la traducción hasta el factor de
término Ter. No hay degradación del mRNA.
Si hay PTC pueden ocurrir dos cosas:
b) El mRNA no es reconocido por ningún ribosoma. Este permaneces en la célula y no
se degrada hasta que un ribosoma lo reconozca.
c) Un ribosoma reconoce a la DCF, la cual va a permitir el se ensamble y comience la
traducción. Esta sin embargo, llegará hasta el codón de término prematuro lo que va a
producir que queden codones sin traducir.
5-. Como se terminó la traducción antes quedaron DCF que no fueron reconocidos. En
este paso, el complejo upf va a reconocer DCF que no fueron traducidas producto de un
PTC, generando una señal.
6-. Comienza la degradación del mRNA al eliminar la cola de poli A de a través de
exonucleasas. Tras la eliminación de la cola de poli A se produce la eliminación del
CAP por la Dcp1.
7-. Inmediatamente aparece la exonucleasa Xrn1 que va degradar el mRNA desde el
extremo 5’ al 3’. Así, este mRNA no será traducido y no habrá gasto de energía.

Por ejemplo, tomando como modelo la levadura Saccharomyces, tenemos DNA que se
transcribe en un pre-mRNA que contiene intrones. Una vez que estos son removidos, va
a haber una serie de factores que se van a unir a este mRNA maduro (conformando el
DCF) y se muestran a continuación:
-Aly - Tap -DEK
-SRm160 -RNPS1
-hUpf3 -Y14

Estas proteínas van a formar un complejo proteico en la vecindad exón-exón (como en

los mamíferos) de los mensajeros. Cuando el mRNA tiene unido el complejo, sale del
núcleo hacia el citoplasma, algunas de las proteínas del complejo se liberan.
Específicamente hablamos de Aly y Tap. A su vez, se incorpora al complejo una nueva
proteína llamada hUpf2. Aquí pueden ocurrir dos casos; el mRNA es normal y presenta
el codón de término normal o el mRNA presenta un codón de término prematuro.
Si el mRNA es normal, el ribosoma se va a unir a éste y va a iniciar la traducción
liberando las proteínas que conforman el complejo siendo la última la Y14. Finalmente,
cuando llega al codón de término los factores de término de la traducción eRFs y hUpf1
se unen al mRNA, liberando el ribosoma. Este mRNA puede traducido nuevamente.
Cuando el mensajero tiene un codón de término prematuro, el ribosoma se une e inicia
la traducción de este hasta el primer codón de término (PTC). Se unen los factores de
liberación de ribosoma y este se libera. Cuando este ocurre, uno de estos factores el
hUpf1 va a detectar la presencia del complejo DCF que no ha sido traducido. La
detección va a ser una señal para que vengan las enzimas que degradan los Cap y
posteriormente las exonucleasas para que degraden a este mensajero.

Pregunta: ¿Por qué se produce un PTC?

Respuesta: Puede ocurrir por; una mutación en el DNA o puede que no se haya
eliminado algún intron que tenga una secuencia de término. Además, los mecanismos
de regulación génica alternativos pueden producir codones de término prematuros.
Pregunta: ¿Que es NMD? Es Decaimiento mediado por codones sin sentido.
Modificación de proteínas que forman parte de histonas

El nucleosoma que forma parte de los cromosomas esta conformado por un octámero de
proteínas histonas asociadas a una histona que los une que es la H1. Estas histonas
presentan dominios que son unas especies de colas cargadas positivamente y se
encargan de unir el DNA que está representado con un color verdoso. Estas colas
pueden ser modificadas agregando grupo metilos o bien acetilando. La inhibición de la
expresión o que se gatille esta, depende del grupo que agregue a estas colas.
Una de las modificaciones de estas proteínas histonas es la acetilación; la enzima acetil
transferasa cambia un grupo metilo por una grupo acilo, provocando un cambio en la
carga de estas colas, liberando el DNA y permitiendo la transcripción de los genes. Por
lo tanto, este proceso es un activador de la transcripción.

Un ejemplo de regulación de la expresión génica por acetilación es la floración de

Arabidopsis thaliana. El gen que determina la floración es el FLC, el cual estando la
cromatina acetilada, puede transcribirse en un mensajero. Este por su parte se traduce en
una proteína que es una proteína activadora de la transcripción. Pero esta activa la
transcripción de genes que son represores de la floración. Esta represión de la floración
ocurre porque la planta para crear flores necesita de condiciones ambientales
determinadas para su reproducción.
Existe otro gen, el FLD, que en condiciones normales de floración se transcribe en un
mensajero, que por traducción genera una proteína con actividad Deacetylasa. Esta le
quita los grupos acetilos a las histonas, volviendo a cambiar la conformación
reestableciéndola e impidiendo la transcripción del gen FLC. Por lo tanto no se van a
producir las proteínas activadoras de la transcripción de genes represores de la floración
y la planta va a dar flores.

Metilación del DNA

La metilación del DNA es un mecanismo de regulación génica que generalmente apaga

la expresión de un gen. En general, es la citosina la que se metila y lo hace en su
carbono 5. Hay una serie de secuencias que se metilan fuertemente y otras que no.

¿Cómo podemos determinar si un DNA está metilado o son solo secuencias las que se
metilan? Si observamos en la figura, hay una secuencia CCGG que cumple con la
condición 5’ CG 3’. Normalmente la metilación ocurre en la citosina que tiene cumple
con este requisito y en particular la podemos denominar Cp (citosina fosfato).
En un DNA independiente de la distancia, existen múltiples sitios CCGG susceptibles
de ser metilados y que además pueden ser reconocidos por enzimas de restricción. La
enzima Hpa II, por ejemplo, corta la secuencia en CC y GG solo cuando no está
metilada. Por otro lado, la enzima Msp I reconoce y corta todas las secuencias en CC y
GG, aun cuando estas se encuentren metiladas. De esta manera, al hacer una digestión
con Hpa II y luego con Msp I, nos permitirá determinar que tan metilado se encuentra el
DNA
Si tenemos una secuencia que esta metilada en sus dos hebras y se replica, se va a
generar una hebra complementaria con una secuencia que va a ser reconocidas por
enzimas que metilan, provocando posteriormente, dos secuencias de doble hebra con
cada una de ellas metiladas. La metilación del DNA es conocido también como la
memoria celular.

Se ha observado que cuando un DNA no tiene metilado su sitio promotor, se pueden

unir las proteínas regulatorias y los factores de transcripción, haciendo que el gen de
exprese normalmente. Cuando no están disponibles las proteínas reguladoras, el gen
esta apagado, pero sin embargo gotea; esto significa que está transcribiéndose en una
cantidad muy baja (lo que puede ser caro para la célula). Para evitar este gasto
injustificado de energía, se metila el sitio promotor. Los metilos unidos al DNA van a
ser reconocidos por una proteínas que van a unirse a ellos fuertemente, provocando un
cambio en la cromatina. Esto será una señal para que otros factores se unan a este
complejo apagando finalmente el sistema. Se ha observado esto en genes que se
expresan en las primeras etapas del crecimiento embrionario y luego se apagan producto
de metilaciones.
Se estudio el efecto del la metilación en la expresión del gen E2A en adenovirus y
puede verse más o menos así:
En rojo se observa la región promotora y como una línea recta se observa el resto del
gen. Los puntos azules son puntos de metilación; ojo que pueden ser once en la región
codificante del gen y tres en la región promotora.
Cuando se tomaba el DNA completamente metilado (A) y se introducía en la célula, no
se producía mRNA, por lo que no había transcripción. Por otro lado cuando se hacía
DNA híbrido con la región codificante metilada y el promotor no metilado (B), se
observaba presencia de mRNA, lo que indicaba que había transcripción. Sin embargo, si
se introducía DNA con el promotor metilado y la región codificante sin metilar (C), no
había expresión. Se concluye por tanto que el efecto de metilar el promotor del gen es la
inhibición de la expresión del gen.

Regulación por hormonas Esteroidales

Este es el clásico modelo donde las hormonas son reconocidas por un receptor con el
cual pasan a formar el par hormona-receptor. Este viaja por la célula, entra al núcleo y
se une al DNA en la región GRE que son elementos de respuesta a hormonas
glucocorticoides. Esto gatilla la transcripción del gen.
¿Como actúa el receptor de hormonas esteroidales? Todos los receptores tienen un
dominio común que es el dominio de unión al DNA. Normalmente estos receptores
actúan como homodímero o heterodímero. Aquí vamos a poner solo un monómero
como ejemplo.

Cuando el receptor no está unido a la hormona se encuentra inactivo y:

- El dominio de unión al ligando (hormona) normalmente actúa con otras
proteínas inhibitorias cambiando la conformación de esta.
- Cambia la conformación del dominio de la activación de la transcripción.
- Como el receptor tiene otra conformación, el receptor no puede unirse al DNA.
Cuando hay presencia de hormona, esta es reconocida y:
- Hay cambio en la conformación del receptor y se unen las proteínas activantes
(coactivadores) volviendo a una conformación activa.
- Cambia el dominio de la activación de la transcripción uniéndose también a las
proteínas activadoras.
- El sitio de unión al DNA queda disponible y se une activando la expresión de los
genes.

Existen dos respuestas a la presencia de hormonas esteroidales y las veremos a

continuación:

a) Respuesta primaria temprana: Cuando el par hormona-receptor se une al DNA

gatillan la expresión de genes tempranos. Estos genes afectan la expresión
inhibiéndola o activándola.
b) Respuesta secundaria tardía: los genes activadores van a hacer que se expresen
otros genes que son de respuesta tardía, mientras que los genes inhibidores van,
por retroalimentación negativa, la inhibición de los genes de respuesta temprana,
lo que genera a su vez la inhibición de respuesta tardía.

El siguiente es un experimento clásico:

En el gráfico se muestra la región promotora del gen β-tubulina y gracias a su estudio se
pudo determinar que habían regiones importantes para la transcripción del gen. Cada
una de las barras es una base y el alto de las barras indica la probabilidad de una
mutación. Observar que una mutación en cualquiera de las bases de color negro no
afecta en la transcripción. Sin embargo, mutaciones en las bases coloridas si la afectan.,
estas bases coloridas se encuentran en regiones que son de gran importancia para la
transcripción como lo es la tata box y sitios intensificadores; sitios que se encargan de
aumentar la expresión del gen. Estos intensificadores puede estar a mucha distancia del
gen al cual le esta modulando su expresión y pueden actuar ya sea estando río arriba
como río abajo del gen.
La diapositiva 16 solo nos representa la variedad de elementos que puede tener una
región promotora; sitios ricos en CG, la caja tata, uno o varios intensificadores, pero
más que eso no tiene mayor relevancia.

A continuación se presenta la región promotora de la proteína Gal4. Esta proteína es la

inductora de la expresión de los genes Gal 1y Gal 10, en la vía de síntesis de la
galactosa.

Como se puede ver, presenta varios elementos que son los moduladores de la expresión
en sus dos dominios, donde del 1-98 pb observamos un dominio de unión y del 768 al
881 encontramos un dominio de activación. Se ha observado que diversas mutaciones
en distintas zonas de Gal 4 pueden producir la inactivación de la transcripción o la
activación parcial dependiendo de que tan despejado esta el sitio de unión al DNA.
Procesamiento alternativo

Un ejemplo de esto son los genes que codifican para la preprotaquiquinina (PPT):

El gen de la PPT produce dos tipos de neuropéptidos y tiene una serie de intrones
(representados por I) que al ser procesados, permiten que la información quede
expresada en dos tipos de mRNA distintos. Hay dos exones, P y K, que van a
determinar el tipo de neuropéptido. Si en el mensajero solo encontramos el exón P,
entonces ese mRNA va a codificar para un neuropéptido del tipo P y se llamará mRNA
α-PPT. Por el contrario si en el mensajero encontramos tanto el exón P como el K, al
traducirse este mRNA dará origen al neuropéptido de tipo K y el mensajero se llamara
mRNA β-PPT. Notar que el primer mensajero es de menor tamaño que el segundo y el
tipo de mRNA que se va a formar depende del sistema que lo produzca y sus
necesidades.

Otro de los casos que se conoce bastante y que debemos haber visto en la determinación
genética del sexo es la determinación del sexo en Drosophila melanogaster (Figura en
la página siguiente). Esta determinación esta muy relacionada con la relación
autosoma/cromosoma sexual. Se supone que esta relación es uno; por dos autosomas,
debe haber dos cromosomas X. Cuando se da esta relación en la hembra, se activa la
transcripción del gen conocido como SxL. Este gen produce la proteína SxL que dirige
el procesamiento del gen tra el cual se traduce en una proteína Tra activa que ha
eliminado el exón 2. Esta última junto con la proteína Tra 2, van a encargarse de
procesar el mRNA proveniente de la transcripción del gen dsx (doble sexo), dejando
una secuencia que es específica para hembras. Esta secuencia se va a traducir y va a
generar una proteína que va a inhibir el desarrollo de los genes específicos del macho y
conduce a que el huevo se desarrolle como hembra.
Cuando la relación autosoma/cromosoma sexual es 0,5, no hay expresión del gen SxL y
por lo tanto no se produce la proteína SxL. Esta proteína por lo tanto no puede afectar el
procesamiento del gen Tra y al no ser afectado el gen Tra se procesa normalmente con
el exón dos, el cual tiene un PTC (codón prematuro de término), lo que genera una
proteína tra inactiva. De esta manera solo Tra 2 va a procesar el gen dsx generando un
mRNA específico de macho que al traducirse va a generar una proteína de macho,
gatillando que el huevo se desarrolle como macho.
A continuación se muestra el gen tra que marca la diferencia de sexo:

El exón numero dos lleva un codón de término prematuro. En machos, el gen tra se
transcribe en un mRNA que lleva el exón 2 y por lo tanto genera una proteína tra
inactiva. En hembras, el gen tra se transcribe en un mRNA que no contiene este exón
generando una proteína tra activa. Este procesamiento alternativo se debe a la presencia
de la proteína SxL.
Regulación por represores y activadores

En el caso de los genes Gal de Saccharomyces, cuando hay ausencia de galactosa en las
levaduras Gal actúa como Enhancer; activa la transcripción. Reconoce las secuencias
UAS que son intensificadores que están a mucha distancia del inicio de la transcripción
de los genes. El dominio de unión va a unirse a esta secuencia del DNA mientras que el
dominio de activación se unirá a la proteína GAL 80 que es un represor. De esta manera
Gal no puede unirse con las proteínas que van a unirse a la caja tata y no se puede
transcribir los genes regulados por Gal (Gal 1 y Gal 10). Cuando en el medio hay
Galactosa y el sistema está inducido, la galactosa (o inductor) va a unirse a la proteína
GAL 80, liberando el dominio de activación de Gal4. Este a su vez, se une a la proteína
de unión a la caja tata TBF, activando la maquinaria de transcripción.
Este sistema de expresión de genes también está regulado por glucosa a través de lo que
se conoce como represión catabólica. En este caso, hay un complejo llamado CRP que
impide que Gal 4 pueda unirse a UAS y por lo tanto, a pesar de que haya galactosa, no
se va a producir la expresión de los genes.

También existen otras secuencias u otros elementos que se les conoce como aisladores;
estos se encargan de inhibir el efecto de los enhancer al permitir que se les unan
proteínas que disminuyen el efecto. Recordemos que los enhancer pueden actuar en
ambas direcciones dependiendo de donde esta el gen que debe ser expresado. Muchos
genes tienen secuencias aisladoras que permiten disminuir la expresión de un gen.
¿Cómo se regula la actividad de los enhancer?
 Una forma puede deberse a que el activador y el represor comparten parte de la
secuencia del DNA y por lo tanto compiten para unirse con el. Al ganar el lugar el
represor inhibe la acción del enhancer y por tanto no hay un excesivo aumento de la
expresión del gen.

Otra forma puede deberse a que tanto represor como activador tienen secuencias de
unión al DNA muy cercanas al enhancer. El represor puede presentar un dominio de
unión de la proteína activadora inactivándola y provocando así la inhibición de la
actividad del enhancer.

Finalmente, puede ocurrir que el represor se una tanto al sitio de unión del DNA como a
las proteínas de la maquinaria de transcripción, impidiendo que el activador pueda
unirse y se reprima la expresión de los genes.

El siguiente, es el típico ejemplo de un gen, de un eucarionte superior, que en este caso

codifica para una metalotioneina:

La metalotioneina es una proteína que le permite a las células sobrevivir aún cuando hay
altas concentraciones de metales pesados. Este gen esta regulado por varios elementos.
En condiciones normales; es decir con pocos metales pesados, la RNA II transcribe el
gen en bajas cantidades. Sin embargo, en la región promotora existen elementos por
activación de metales que se encuentran en muchas copias; por ejemplo, hay 4 copias de
MRE (elemento de reconocimiento de metales). Estos elementos unen a unas proteínas
activadoras del MRE y aumentan la transcripción del gen. Existen además otros
elementos como el TRE que pueden ser reconocidos por la proteína AP1 aumentando
aún más la expresión del gen. Finalmente observamos un elemento GRE llamado
elemento de reconocimiento de hormonas glucocorticoides lo cuales unen al receptor de
la hormona, aumentando nuevamente la expresión. De esta manera, a altas
concentraciones de metales pesados hay muchos elementos que permiten la
sobreexpresión del gen.

RNA de interferencia

a) En general se general moléculas de RNA de doble hebra que son reconocidos por
Dicer, una proteína que lo procesa generando pequeños fragmentos de RNA se unen a
un complejo proteico llamado Risc. Este complejo junto al RNA se van a unir a un
mensajero y servirá como mensaje para que este mRNA se degrade. Este complejo
Risc- RNA de interferencia aparea de forma exacta pequeñas zonas del RNA con el
mensajero. Luego Risc se encarga de cortar en la mitad el DNA apareado con el RNA
lo que produce que los trozos de mRNA que queden sean degradados.

b) Una sola hebra de RNA puede doblarse y aparearse en si misma formando una doble
hebra y un loops. Los fragmentos de doble hebra van a ser reconocidos por Dicer quien
va a procesar esto generando RNAs de hebra simple que van, junto con risc a unirse al
mRNA. Como este fragmento de RNA de interferencia no aparea completamente al
DNA, no se va a producir degradación pero si va a haber inhibición de la transcripción.

Pregunta: ¿Cuál es la diferencia entre siRNAs y miRNAs?

Respuesta: El primero se origina a partir de dos RNAs apareados mientras que el
segundo se origina a partir de un solo RNA que se dobla. Además, el primero es de
mayor tamaño que el segundo.

¡Fin!
 GENETICA DE POBLACIONES

Estudia las proporciones entre los diversos genotipos posibles, lo que se ha denominado, la
frecuencia relativa de los genes dentro de una población, de generación en generación.

Para predecir el destino de los genes, en las poblaciones, se debe tener conocimiento acerca de las
poblaciones y de los individuos como organismos aislados. El destino de muchos genes (las formas
alélicas de los genes) se define en las poblaciones de individuos.

Por ejemplo, la capacidad reproductora de los organismos portadores de un gen específico, puede
depender de la frecuencia de dicho gen. Un gen va a tener un efecto en la capacidad reproductora
de los individuos que lo llevan. También, va a depender del tamaño de la población, del genotipo
de los demás individuos de la población, y de otros factores que forman parte de la genética de
poblaciones.

Si bien los genes tienen eficiencia en la célula, obviamente que el destino de esos genes está en las
poblaciones de individuos (Cifuentes lo que quiere decir con esto, es que, por ejemplo, por mucho
que exista un gen, si la mayoría de la población no lo porta, a la hora de la reproducción este gen
podría ir desapareciendo con el paso del tiempo)

Población: Conjunto de individuos de una misma especie. Comunidad de individuos que se

reproduce sexualmente entre sí, o que son capaces de hacerlo. Obviamente, para que esto ocurra
deben de ser de la misma especie.

¿Qué el curso que está en la sala de clase?.. ¿Una población o un deme?.. Cifuentes dice que
somos más un deme que una población. Un deme es una parte de una población. Según internet
deme se define como Población natural definida genética y ecológicamente.

El tamaño de una población puede variar, pero generalmente se considera que corresponde a un
grupo total, por ejemplo, la población de Santiago, la población de Juan Gómez Millas, o la
población de la sala de clases. Ahora, en esta población, cada individuo tiene la misma
probabilidad de aparearse con cualquier otro individuo. Se define además, que esta población es
mendeliana, ya que la transmisión de los genes que hay en esta población entre los individuos, se
rige por las leyes de Mendel.

Las poblaciones tienen dos características importantes, sobre las cuales se ha desarrollado la
genética de poblaciones:

- Frecuencia génica: frecuencia con que se observa cada gen o alelo en esta población.
- El conjunto común de genes de esta población.

¿Qué son las frecuencias génicas?

Las frecuencias génicas corresponden a la presencia de distintos genes en relación a la población.
Esta proporción se mide contando el número de organismos y los fenotipos observados. De
acuerdo a esto de determina la frecuencia relativa de un gen.

Por ejemplo se puede determinar en la población de la sala, una característica que se hereda. Por
ejemplo, se puede ver cuántos pueden poner la lengua como un canal. Existen dos alelos, uno que
permite poner la lengua así y otro que no. En esta población si quisiéramos ver la frecuencia
génica o alélica del gen que permite poner la lengua como canal, debemos determinar el número
total de individuos de la población, viendo cuántos de ellos pueden poner la lengua como canal.

Otro ejemplo es ver cuántos pueden mover las orejas, o cuantos tienen los lóbulos de la oreja
pegados. Para estos caracteres, se asume que es un solo gen el que afecta al carácter. Otro
ejemplo es la capacidad de degustar fenil-carbamida. La cual presenta un sabor amargo para
algunos y es insípida para otros. Otro carácter que involucra al sabor, es el benzoato, el cual se
relaciona con las coles.

Ejercicio
Tomemos un ejemplo, una población de 100 individuos, de los cuales 50 son AA, 20 Aa y 30 aa.
¿Cuántos genes tiene esta población?
AA=50
Aa=20
aa=30
La población tiene 200 genes, pues cada alelo es un gen, y como hay dos alelos por individuo,
existen 200 genes.
¿Cuál es la frecuencia (f) del alelo A?

f (A) 
 alelos A

 50  2   (20 1)  0.6
Alelos Totales 200

f (a) 
 alelos a

 30  2   (20 1)  0.4
Alelos Totales 200

f (A)  f (a)  1

NOTACIÓN: Frecuencia génica = frecuencia alélica. Existen tantas frecuencias génicas o alélicas,
como alelos para un mismo carácter existan.

Se puede calcular la frecuencia genotípica, que en este caso serían 3 frecuencias distintas (AA-Aa-
aa). Por lo tanto existen tantas frecuencias genotípicas, como combinaciones de alelos existan.

AA 50
f (AA)=   0.5 , AA+Aa+aa  Genotipos Totales
AA+Aa+aa 100

20
f (Aa)   0.2
100

30
f (aa)= =0.3
100
Inferencia de la frecuencia génica a partir de la frecuencia genotípica.

1
f (A)  f (AA)  f (Aa)=0.5+0.1=0.6
2

1
f (a)  f (aa)  f (Aa)=0.3+0.1=0.4
2

Recapitulando conceptos:
-Frecuencia genotípica: frecuencia con que se observa un genotipo en la población.
-Frecuencia génica o alélica: frecuencia de los alelos en la población.
-Frecuencia fenotípica: Observación de un fenotipo en una población. El número de fenotipos
dependerá del grado de dominancia de los alelos. Así para una dominancia completa, sólo se
esperan dos fenotipos: el dominante y el recesivo.

Las propiedades genéticas de una población están influenciadas, por varios factores, en la
transmisión de los genes, de una generación a otra. Estos factores pueden cambiar la estructura
genética de una población. Con estructura genética de una población, se refiere a la frecuencia de
los alelos en dicha población, de cómo está estructurada esa frecuencia alélica en la población.

Los factores son:

- Tamaño población.
- Migración y mutación.
- Selección
- Sistemas de reproducción o apareamiento.

Tamaño población:
Los genes que pasan de una generación a la siguiente son una muestra de los genes de la
generación parental. Por lo tanto la frecuencia génica está sujeta a la variación debida al
muestreo, o sea a los individuos que se van a reproducir, siendo mayor esta variación mientras
menor es el tamaño de la población. Si aumento la población, menor es la variación de los genes
que van a pasar de los parentales a la descendencia. O sea si la población es muy pequeña, y
presentan una acumulación del 0,6 (A) y 0,4 (a), Si esta población es de 10 individuos y tienen esta
estructura genética. A la hora de reproducirse si sólo se reproducen (A), a la siguiente generación
ya desaparece el otro alelo (a). Pero si esa población es mucho más grande, tal que la probabilidad
de que el genotipo sea AA, Aa , aa, es mayor, por lo que la probabilidad de que los alelos se
mantengan en las generaciones aumenta, y la probabilidad de que se mantengan las frecuencias
génicas también es mayor.

A este cambio, causado por el número de individuos de la población se conoce como la deriva
génica. Esto se puede ver en los problemas de conservación de especies. Si existe una población
pequeña de individuos, el hecho de sacar animalitos de esa población, genera una variación muy
grande, pues el número se ve afectado mucho más…. (No es lo mismo sacar 10 si tienes 200, a
sacar 10 si tienes 20… se entiede jijij) Luego los poquitos animales que queden van a cambiar la
frecuencia génica.
Migración y Mutación:
La introducción de individuos, o el cambio de individuos de una población a otra y la mutación
génica, influyen obviamente en alterar la frecuencia génica.
Si tenemos la población Z y la W:

Se observa que en Z predominan los alelos A y que en W predominan los recesivos a. Por lo que la
migración de individuos desde Z a W va a cambiar la estructura genética de la población W y
viceversa. Por lo que las migraciones se dice que cambian la demografía de la población.

En tanto, suponga que en la población W un alelo a, muta a A1 y luego en otra generación otro
alelo muta a A2, esto también irá cambiando la estructura genética de la población. Esto porque
inicialmente, W tenía una frecuencia de A igual a uno. Pero después de esas dos mutaciones
tendrá una frecuencia de A igual a tres, y por tratarse de una mutación (o sea a se transformó en
A)la población W perdió alelos a, por lo que no sólo la frecuencia de A aumenta, sino que también
lo hace su frecuencia relativa..en relación al total.. no sé cómo explicarlo mejor =(

Selección:
La selección es la fuerza que hace que se afecte la eficacia biológica o adecuación de un individuo.
La selección es lo que hace que la eficacia biológica se vea disminuida. Es la capacidad que pueda
tener un individuo para perpetuar su especie, o es la viabilidad que tenga éste.

Si bien cuando estudiamos la estructura genética de una población, nos metemos a nivel de
genotipo, pues se estudia la frecuencia de los genes, sin embargo, no hay que olvidar el fenotipo
pues es donde actúa la selección. Si bien está codificado en el genotipo, la selección actúa en el
fenotipo, influenciando en dos características: La fertilidad y la viabilidad, de los individuos que se
están generando.

La fertilidad de los genotipos de la generación parental, y la viabilidad de los nuevos genotipos

formados en la generación siguiente, pueden cambiar la frecuencia génica de la población.

Por ejemplo en los individuos de una población donde hay ‘A’ y ‘a’ y los ‘a’ tienen una mayor
capacidad de reproducción, y además tiene una mayor viabilidad, su descendientes van a cambiar
la estructura de esta población, ya que los ‘a’ dejarán más descendencia que ‘A’.

Los gametos también pueden estar sujetos a selección, con una mayor o menor viabilidad o
capacidad de fecundarse.

Sistemas de apareamiento o reproducción:

Cuando todos los individuos de una población tienen la misma capacidad de aparearse para
originar la siguiente generación, se dice que el apareamiento es al azar o panmíctica.
En relación a la estructura de la población, en 1908 se instauró la ley de equilibrio de Harvey. En
una población panmictica de tamaño infinito, la cual no está sujeta a migración, mutación y
selección, las frecuencias génicas y genotípicas se mantienen constantes de generación en
generación.

Consideremos una población con un gen con dos alelos A, a, se tiene que:

f(A)=p
f(a)=q , tal que p+q=1

f(AA)=D
f(Aa)=H
f(aa)=R tal que D+H+R=1

La generación siguiente formará:

Gametos
A a
(p) (q)
A AA Aa
Gametos

(p) P2 pq
a Aa Aa
(q) pq q2

Donde,
f(AA)=p2
f(Aa)=2pq
f(aa)= q2

Luego, la frecuencia de cada alelo será igual a:

f(A) = p2+ ½(2pq)= p2+pq =p(p+q)* = p

f(a) = q2+ ½(2pq)= q2+pq =q(p+q)* = q

*recuerden que p+q=1

Por lo tanto, la frecuencia génica se mantiene constante.

Como consecuencia de la ley de Harvey, se afirma el equilibrio de la ley mendeliana.

La frecuencias génicas pueden variar si se sale del equilibrio. Pero si se restablece el equilibrio,
este se alcanza en una generación.

¿Qué pasa con la población humana? En este sentido, hay que tener cuidado, pues si bien es una
población grande, muchas veces existe un predominio de con quién aparearse y con quién no.
También la población humana sufre mutaciones a lo largo de las generaciones. Hay que recordar
que para aplicar la ley, la población debe ser ideal.
Un ejemplo es un estudio en genética realizado por un médico chileno. Estudió las variaciones en
los grupos sanguíneos comparando el hospital san José y la clínica alemana, y vio que en Santiago,
existían dos poblaciones que no se mezclaban, sólo viendo las frecuencias génicas de los
individuos.

Sea
f(AA)=D p= D+ ½ H
f(Aa)=H q= R + ½ H
f(aa)=R

Gametos
AA Aa aa
(D) (H) (R)
AA D2 DH DR
(D)
Aa DH H2 HR
Gametos

(H)
aa DR HR R2
(R)

Genotipo y frecuencia
Cruce tipo f total AA Aa aa
AA x AA D2 D2 - -
AA x Aa 2DH DH DH -
AA x aa 2DR 2DR -
Aa x Aa H2 ¼ H2 ½ H2 ¼ H2
Aa x aa 2HR - HR HR
aa x aa R2 - - R2
Total 1**

Al sumar las frecuencias totales de cada cruce tipo, vemos que se comporta como el cuadrado de
un trinomio:

D2 +2DH+2DR + H2 +2HR + R2 = (D+H+R)2= 1**

Talque
AA = D2 + DH + ¼ H2 = (D + ½ H)2 = P2
Aa = DH + 2DR + ½ H2 + HR = 2(D+ ½ H)(R + ½ H) = 2pq
aa = ¼ H2 + HR+ R2 = q2

f(TT) =0,4 f(T)=(0,4 + ½ 0,4º)= 0,6

f(Tt) =0,4º f(t)=0,4=(0,2 + ½ 0,4º) = 0,4
f(tt) =0,2
 Gametos
TT Tt tt
(0,4) (0,4) (0,2)
TT 0,16 0,16 0,08
(0,4)
Tt 0,16 0,16 0,08
Gametos

(0,4)
tt 0,08 0,08 0,04
(0,2)
Si se especifican los tipos de cruzamientos, tenemos que:

Genotipo y frecuencia
Cruce tipo f total AA Aa aa
TT x TT 0.16 0.16 - -
TT x Tt 0.32 0.16 0.16 -
TT x tt 0.16 - 0.16 -
Tt x Tt 0.16 - 0.08 0.08
Tt x tt 0.16 0.04 0.08 0.04
tt x tt 0.04 - - 0.04
Total 1

f(T)= 0.36+ ½ 0.48 =0.6

f(t)= 0,16 + ½ 0.48 =0.4

Note que la frecuencia génica no se altera, a pesar que la genotípica sí lo hace.

Pero en la próxima generación cuando éstos invividuos se reproduzcan, van a generar individuos
con una frecuencia genotípica de 0.36 AA, 0.48 Aa y 0,16 aa, por lo tanto se mantendrán las
frecuencias genotípicas en la segunda generación.

Si la población fundadora fuera TT (0,25); Tt (0,7); tt(0,05) ,tenemos que

f(T)= 0,25 + ½ 0,7 = 0,6
f(t)= 0,05 + ½ 0,7 = 0,4

Esto apunta a que si cambiamos las condiciones de equilibrio, y cambiamos a una frecuencia
genotípica distinta, cuando vuelvan las condiciones se va a restablecer el equilibrio. Más aun, si
nosotros cambiamos las condiciones y en realidad cambian las frecuencias génicas, se va a formar
una nueva generación cuando se establezca las condiciones de equilibrio, en la cual la
descendencia va a tener p2+ 2pq+ q2, el cual va a depender de la frecuencia alélica que estaba
justo antes de que cambiaran las condiciones. Por lo tanto va a corresponder a una frecuencia
génica determinada, que a la siguiente generación se va a mantener.

Dejó una tarea.. jijij .. que yo tb se las dejo de tarea ijijij =)

En genes con más alelos A1, A2, A3…An

- Si únicamente interesa la frecuencia genotípica de A1 f(A1) = p , y se reúne la frecuencia de los

demás alelos y se considera como q, entonces:

p2(A1A1) + 2pq(A1A2 …An) + q2(A2…An) = 1

- Si se considera A1 y A2, con frecuencias respectivas de q1 y q2, se tiene que en equilibrio:

q12(A1A1) + 2q1 q2 (A1A2) + q2 2(A2A2)= 1

Talque q1 + q2 es distinto de 1, pues no se considera al resto de los alelos (recuerden que la suma
de todas las frecuencias es igual a 1, por lo que q1 + q2 + q3 +….+ qn =1

-Serie A1 A2 A3, con frecuencias p, q y r respectivamente se tiene que, la estructura de la población

será como el cuadrado de un trinomio:

(p+q+r)2 = 1

A1 A2 A3
A1 p2 pq pr
A2 pq q2 qr
A3 pr qr r2

f(A1A1)= p2
f(A1A2)=2pq
f(A1A3)=2pr
f(A2A2)= q2
f(A2A3)=2qr
f(A3A3)= r2
Total = p2 + q2+ r2 + 2pq + 2pr + 2qr = (p+q+r)2 = 1

Ejercicio prueba:

Sean los grupos sanguíneos ABO

p= f(A), q=f(B), r=f(O) , y estas son las frecuencias alélicas… se tiene que (p+q+r)2 = 1 (pues son tres
alelos)

p2(AA) + 2pq (AB) + 2pr(AO) + q2(BB) + 2qr (BO) + r2(OO) = 1

La frecuencia fenotípica (ff) de individuos es:

ffA= 0.53 (AA +AO)
ffB= 0.13 (BB+BO)
ffAB= 0.08 (AB)
ffO = 0,26 (OO)

Luego, dado que tenemos las frecuencias alélicas, reemplazamos estas de la siguiente forma:
ffA= p2 + 2pr = 0.53
ffB= q2 + 2qr = 0.13
ffAB = 2pq = 0.08
ffO = r2 =0.26  r = 0.26 =0.51

luego, para calcular p, utilizamos el truco matemático de que al sumar ffA + ffO, nos resulta un
cuadrado de binomio, donde p se hace muy fácil de despejar:

ffA + ffO = 0.53 + 0.26 = 0.79 = p2 + 2pr + r2 = (p+r)2

 p+r = 0.79 , pero r = 0.26 , luego

 p = 0.79 - 0.26
 p=0.38

Como (p+q+r)2 = 1, lo que es equivalente a p+q+r = 1  q= 1-(p+r) = 1- 0.79 = 0.11 = q

…Si bien hemos visto la ley de Harvey, en la realidad la frecuencia génica de la población puede
cambiar.. para que cambie es necesario las mutaciones, es decir serán las mutaciones quienes
generen un cambio en la frecuencia génica de un apoblación…

Cuando un gen muta en una población, tiene poca capacidad de sobrevivir en dicha población. Por
ejemplo: si AA  Aa , Aa debe dejar descendencia para que la mutación persista.
Supongamos que el individuo Aa, deja un descendiente, existe ½ de probabilidad que su hijo deje
descendencia y ½ de que no lo haga. Por lo tanto, luego de una generación, la probabilidad de
permanencia de la mutación es ½. Consecuentemente, a la segunda generación la probabilidad
será de ¼.

Sea n el número promedio de hijos por familia, talque en este caso n=2, se tiene que, por una
distribución de piosson,
n 0 1 2 3 4 5
f Familias
e 2 2 e 2 22/2! e 2 23/3! e 2 24/4! e 2 25/5! e 2
Probabilidad
de eliminación 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32
del alelo
f familias x
Probabilidad
de eliminación e 2 e 2 1/2! e 2 1/3! e 2 1/4! e 2 1/5! e 2

Probabilidad total
de eliminación del = e 2 (1+1+ 1/2! +1/3! + 1/4! + 1/5! )= e 1 =0.3679
alelo nuevo

Probabilidad de
eliminación en la = e  (1 0.3679) =0.5313
2ª generación
Probabilidad de
eliminación en la = e  (1 0.5313) =0.6259
3ª generación.

Por lo que a media que pasan las generaciones aumenta la probabilidad de eliminar la mutación,
llegando a un 95% de probabilidad cuando han transcurrido 30 generaciones.
Note que después de n generaciones, la probabilidad de que sobrevida el alelo es de 2/n (en
verdad... no sé porqué)

Cuando ‘A’ vuelva a mutar a ‘a’ (A  a) y la mutación no revierte, entonces a través de

generaciones el alelo ‘a’ va aumentando tal que en un momento dado ‘A’ desaparece.

Si p0= f(A) frecuencia población, y  la tasa de mutación, tendremos que en la 1ª generación:

Lo que va apareciendo de ‘a’ es

fa=  x p0
Consecuentemente, lo que va desapareciendo de A es lo mismo que lo que aparece en ‘a’, por lo
que si vemos cuánto ‘A’ nos queda después de la primera generación vemos que es, lo que se
tenía inicialmente, menos lo que mutó:
fA = p0-  x p0= p0(1-  )

Y a la segunda generación, lo que mute a ‘a’ será, una parte de lo que quedó de ‘A’ luego de la
primera generación, o sea:

fa=  x( p0(1-  ))= p0(  -  2 )

Luego de esta segunda generación, el remanente de ‘A’ será, lo que había antes de la segunda
generación, menos lo que mutó al pasar la segunda generación.

fA= (p0(1-  )) - p0(  -  2 )=p0(1-  )2

Si se dan cuenta y comparan fA después de la primera generación, es igual al de después de la
segunda generación, pero elevado al cuadrado,
Por lo tanto, podemos dejar expresado fA como:

fA = p0(1-  )n, tal que n es el número de generaciones.

Como el término 1-  < 1 , entonces a mayor número de generaciones, éste término disminuye,
por lo que también lo hace fA.

Veamos cómo se comporta si ‘A’ puede mutar a ‘a’ y viceversa,


A



v

a
Luego, inicialmente se tiene que:
fA= p0
fa = q0
Luego de la primera generación:

fA= p0 + ( v x q0), Talque v x q0 es lo que pasó de ‘a’ a ‘A’ (aA)

fa= q0 + (  x p0), Tal que  x p0 es lo que pasó de ‘A’ a ‘a’ (Aa)

Debido a que ‘a’ se crea y se destruye (en términos simples), podemos decir que:

 fa=  x p0 - v x q0=  q
Si lo que se crea de ‘a’ es lo mismo que lo que se destruye de ‘a’ (o se forma de ‘A’), entonces en
un equilibrio:

 q= 0 =  p0 - v q0
  p0 = v q0 , recordando que p + q=1,
 (1-q) = v q0
 -  q = v q0
 =q0(  + v )

 v
q̂= p̂= , en equilibrio mutacional.
 v v

Si  =0.00005
v =0.00003

 q̂ =5/8 =0.625
 p̂ =3/8 = 0.375

Para que por mutación cambie la frecuencia génica de q de la forma; f =1/8 cambie a una
frecuencia de f =3/8, necesito 8664 generaciones.
Si el organismo tiene un periodo de reproducción de 10 años 86540 años, para que cambie la
frecuencia de la población.
Un ejemplo concreto de esto es que en drosophila se observa una predominancia de las moscas a
pasar de fenotipo silvestre a mutantes, pero aun así, la población de silvestres supera con creces a
la mutante.

Éxito reproductivo relativo.

Si los individuos portadores de ‘A’ tienen éxito superior en la reproducción que ‘a’, la frecuencia de
‘A’ será mayor que la de ‘a’.

- Eficacia Biológica: Éxito reproductivo relativo.

  1 s

Donde  es el valor adaptativo y s es el coeficiente de selección (para un gen letal s =1).

La selección se puede realizar a nivel de los gametos (Haploide) o del cigoto (diploide).

Selección gamética
Genotipos Total
A a
Frec. Inicial p0 q0
Eficacia Biológica 1 1-s
Frec. Después de selección. p q(1-s) (1-s)q

A = p/(1-sq)
a= q(1-s)/(1-sq)

 q= q1-q0= q(1-s) – q
(1-sq)

 q = -sq (1-q) =-sq (1-q)

1-sq

Si s es muy pequeño, toma alrededor de 110 generaciones.

Cuando el gen es letal en homocigosis:

Genotipos
AA Aa aa Total f(a)
2 2
Frecuencia inicial p 2pq q 1 q
Valor adaptativo 1 1 (1- s)ª
2 2
Frecuencia post p 2pq 0 p + 2pq
selección
ª s =1 .

Frecuencia relativa fr. = f(genotipo)/f(total)

f(total)= f(AA) + f(Aa) + f(aa) = p2+ 2pq + 0= p(1+q)

2
fr(AA) = p = p/(1+q)
p(1+q)

fr(Aa) = 2pq = 2q/(1+q)

p(1+q)

fr(aa) = 0 (letal en homocigosis recesivo)

 q= q -q = - q2 ?
1+q 1+q
¿Qué pasa cuando s no es letal?

AA Aa aa Total f(a)
2 2
f inicial p 2pq q 1 q
Valor 1 1 (1- s)
adaptativo
2 2 2
f post selección p 2pq q (1-s) 1-sq f(1-sq)
2
(1-sq )

 q = -sq2(1-q)
2
(1-sq )

Si A es letal Si A no es letal
AA Aa aa AA Aa aa
Valor o o 1 1 1 (1-s)
Adapt.