Resumen

La boca humana alberga uno de los microbiomas más diversos del cuerpo
humano, incluyendo virus, hongos, protozoos, arqueas y bacterias. Las bacterias
son responsables de las dos enfermedades bacterianas más comunes del
hombre: la caries dental (caries dental) y las enfermedades periodontales (de las
encías). Las arqueas se limitan a un pequeño número de especies de
metanógenos, mientras que se han encontrado alrededor de 1000 especies
bacterianas, con representantes de los phyla Actinobacteria, Bacteroidetes,
Firmicutes, Proteobacteria, Spirochaetes, Synergistetes y Tenericutes y las
divisiones incultas GN02, SR1 y TM7. Alrededor de la mitad de las bacterias
orales están todavía sin cultivar y métodos independientes de la cultura se han
utilizado con éxito para describir de manera exhaustiva la comunidad de
bacterias orales. La base de datos de microbiomas orales humanos (HOMD,
www.homd.org) proporciona un recurso completo que consiste en descripciones
de taxones bacterianos orales, una herramienta de identificación de ARNr 16S y
un repositorio de secuencias de genomas bacterianos orales. Los microbiomas
orales de los individuos son muy específicos a nivel de especie, aunque en
general el microbioma oral humano muestra pocas diferencias geográficas.
Aunque las caries y la periodontitis son claramente enfermedades bacterianas,
no son enfermedades infecciosas en el sentido clásico porque resultan de una
compleja interacción entre la microbiota comensal, la susceptibilidad del
huésped y factores ambientales como la dieta y el tabaquismo. La periodontitis,
en particular, parece resultar de una reacción inflamatoria inapropiada a la
microbiota normal, exacerbada por la presencia de algunas especies bacterianas
asociadas a la enfermedad. En términos funcionales, parece haber una
redundancia considerable entre la microbiota oral y puede ser necesario
enfocarse en la diversidad funcional más que en la filogenética para comprender
completamente las interacciones entre el huésped y el microbioma.
 Introducción
La boca humana está fuertemente colonizada por microorganismos, incluyendo
virus, protozoos, hongos, arqueas y bacterias. En contraste con la microbiota
comensal encontrada en otros sitios del cuerpo, que típicamente viven en
armonía con el huésped, la microbiota normal de la boca es responsable de las
dos enfermedades más comunes del hombre: la caries dental y las
enfermedades periodontales. Debido a esto, los seres humanos, particularmente
en los países desarrollados, se involucran en prácticas regulares de higiene
bucal, típicamente cepillándose con cremas dentales y / o enjuagando con
enjuagues bucales. ¿Por qué esto debe ser necesario sigue siendo desconocido,
aunque es probable que las dietas ricas en azúcares y blandas son en gran parte
responsable. Las comunidades bacterianas encontradas en la boca son
altamente complejas, con alrededor de 1000 especies presentes y se ha
demostrado que es la segunda más compleja en el cuerpo, después del colon.
El uso de métodos independientes del cultivo para determinar la composición del
microbioma oral, aliado con los métodos de secuenciación de ADN de la
siguiente generación, está proporcionando un análisis mucho más profundo que
hasta ahora posible. Sin embargo, la identificación del nivel de la especie puede
no ser suficiente debido a la heterogeneidad genética de las especies
bacterianas ya la fuerte influencia del ambiente en el fenotipo. Puede ser
necesaria una combinación de enfoques filogenéticos, metagenómicos,
transcriptómicos, proteómicos y metabolómicos para diseccionar completamente
las interacciones orales entre huésped y microbioma relevantes para la salud y
la enfermedad. En esta revisión, los progresos realizados hacia este objetivo
serán descritos y discutidos.
 Composición del microbioma oral
Virus
Una serie de virus se pueden encontrar en la boca, que son principalmente
asociados a la enfermedad. Por ejemplo, las paperas y los virus de la rabia
infectan las glándulas salivales y, por lo tanto, los virus se encuentran en la saliva
en los individuos afectados. De forma similar, los virus transmitidos por la sangre,
como los virus de la hepatitis y el VIH, pueden entrar en la boca a través del
líquido crevicular gingival y los virus que causan infecciones del tracto
respiratorio superior estarán claramente presentes en la boca durante la fase
aguda. El herpes simple causa gingivostomatitis o una infección subclínica en la
mayoría de los recién nacidos y el virus puede posteriormente entrar en un
estado latente en el ganglio trigeminal. El virus puede reactivarse en respuesta
a factores externos como el estrés, el frío u otras infecciones virales, y causar
herpes labial (herpes labial). Virus del papiloma humano El VPH es responsable
de una serie de condiciones orales, incluyendo papilomas, condilomas e
hiperplasia epitelial focal y también ha sido implicado en el carcinoma de células
escamosas de cabeza y cuello.
Un estudio del virome oral en cinco sujetos reveló que la mayoría de las
secuencias de virus detectadas tenían homología con bacteriófagos lo que
quizás no es sorprendente, dada la densa y diversa comunidad de bacterias
encontradas en la boca.
Protozoarios
Dos especies de protozoos se encuentran como parte del microbioma normal:
una ameba, Entamoeba gingivalis, y la más estructurada Trichomonas tenax. El
número de estos organismos se plantea en sujetos con mala higiene bucal y
enfermedad gingival y fueron considerados como patógenos potenciales. En la
actualidad se consideran como saprófitos inofensivos y el vínculo aparente con
la enfermedad es nutricional, ya que la mala higiene oral conduce a una mayor
cantidad de residuos de alimentos y bacterias, ambas fuentes de alimentos para
los protozoos.
Hongos
Las especies de Candida son transportadas asintomáticamente por alrededor de
la mitad de los individuos con la prevalencia aumentando con la edad, y también
causan una amplia gama de infecciones agudas y crónicas. Una encuesta
independiente de la cultura del micobioma oral en individuos sanos encontró 85
géneros fúngicos en la boca de 20 individuos sanos. Los géneros predominantes
fueron Candida, Cladosporium, Aureobasidium, Saccharomycetales,
Aspergillus, Fusarium y Cryptococcus. No está claro si la detección de estos, y
los géneros más raramente encontrados, representa la colonización por las
formas vegetativas de los hongos. Es posible que el método utilizado detectara
esporas aerotransportadas o colonización transitoria de los alimentos.
Arqueas
Las arqueas constituyen sólo un componente menor del microbioma oral y la
comunidad arcaica está restringida a un pequeño número de especies / filotipos,
todos ellos metanógenos. Pueden detectarse en la salud, pero su prevalencia y
el número se plantean en los sujetos con periodontitis. Las especies encontradas
son Methanobrevibacter oralis y dos filotipos no identificados de
Methanobrevibacter, Methanobacterium curvum / congolense y Methanosarcina
mazeii.
Bacterias
El conocimiento inicial de la composición del bioma bacteriano oral vino de la
microscopía con las observaciones bien conocidas de Leeuwenhoek, que
demostró una colección diversa de morfotipos bacterianos en la placa dental.
Tras el desarrollo de medios de cultivo bacterianos por Koch, Pasteur y otros, se
realizó la caracterización del componente cultivable de la microbiota bucal y se
encontró que comprendía una diversa colección de organismos, incluyendo
aerobios obligatorios y anaerobios facultativos y obligatorios y una amplia gama
de metabolismo potencial incluyendo la capacidad de degradar azúcares y
proteínas, y sustratos complejos derivados de ellos. Este trabajo basado en la
cultura llevó a la identificación de organismos específicos que se cree que
desempeñan un papel causal en la caries y la periodontitis y que podrían tratarse
con antimicrobianos. Sin embargo, la cultura por sí sola da una visión altamente
distorsionada de la composición del microbioma oral.
Desde hace tiempo se sabe que una proporción sustancial de la vida bacteriana
en la tierra no puede cultivarse en el laboratorio. En la boca, aproximadamente
la mitad de las bacterias presentes todavía no han sido cultivadas. Las
comunidades bacterianas complejas, como la microbiota oral, se han
caracterizado por métodos independientes de la cultura, basados en el análisis
de las secuencias de genes de conservación conservados directamente aislados
de muestras de saliva o biofilms orales. El gen más comúnmente utilizado para
este propósito ha sido que la codificación de la 16S rRNA. El ARN 16S mismo
puede aislarse directamente y secuenciarse, pero más típicamente el gen que
codifica el ARNr 16S se amplifica por PCR utilizando cebadores "universales"
dirigidos a las regiones ultraconservadas del gen y luego clonados por
incorporación en un vector plasmídico. El uso de este método ha permitido la
descripción completa de la biota bacteriana oral. El método consume mucho
tiempo y es relativamente costoso, sin embargo, y típicamente sólo alrededor de
100 genes clonados son secuenciados por muestra, un análisis relativamente
superficial de una comunidad altamente compleja.
Un avance importante en esta técnica ha sido la adopción de métodos de
secuenciación de próxima generación de alto rendimiento tales como la
pirosequenciación. En el sistema 454 (Roche), los genes rRNA 16S se amplifican
por PCR a partir de muestras con cebadores universales y luego se mezclan en
proporciones iguales. La mezcla se amplifica entonces en una emulsión y se
distribuye entre los pocillos de una placa a la que se añaden perlas que contienen
los reactivos de secuenciación. La incorporación de nucleótidos se detecta
mediante un sistema de formación de imágenes por cámaras CCD y se pueden
obtener alrededor de 0,8 millones de secuencias de hasta 750 pares de bases
de longitud en una única operación. Para permitir secuenciar múltiples muestras
en la misma ejecución, se utilizan cebadores con códigos de barras únicos,
típicamente 8-12 nucleótidos, incorporados en el cebador de PCR inicial. Estos
códigos de barras se incorporan entonces en las secuencias finales obtenidas y
pueden clasificarse fácilmente y asignarse a las muestras de fuente después de
la secuenciación.
El uso de la pirosequencia y métodos alternativos de alto rendimiento, como el
sistema Illumina, que proporciona un número aún mayor de secuencias, aunque
de longitud más corta, ha revolucionado los análisis independientes de la cultura
y ha sido la piedra angular de la parte del Human Microbiome Project dedicada
a determinar la composición de los microbiomas en diferentes sitios del cuerpo
humano. Estos estudios han demostrado que cada sitio del cuerpo estudiado fue
colonizado por un microbioma característico de ese sitio, pero que el individuo
fue el factor principal que influyó en la composición del microbioma, es decir,
cada individuo es colonizado por un microbioma único. En la boca se encontraron
muestras de siete superficies diferentes colonizadas por tres comunidades
bacterianas distintas: la mucosa bucal, las encías y el paladar duro tenían
microbiota similar, mientras que la saliva, la lengua, las amígdalas y la garganta,
y la placa supra y subgengival tenían comunidades distintivas. Se encontró que
la microbiota oral era sólo secundaria a la del colon en términos de riqueza de
especies y, si bien hay similitudes entre los microbiomas orales de individuos en
el nivel de género, a nivel de especie, la composición de la microbiota es más
variable en diferentes individuos con, en un estudio, el 47% de OTUs a nivel de
especie compartido entre tres individuos. Parece haber alguna evidencia,
entonces, de un núcleo de microbioma oral común a la mayoría de los individuos.
Curiosamente, un estudio de 120 individuos de 12 locaciones en todo el mundo
no encontró diferencias geográficas significativas entre su microbiota salival.
Esto sugiere que la dieta y el medio ambiente no influyen significativamente en
la composición del microbioma oral y que la especie huésped es el determinante
primario. Sin embargo, se encontraron algunos taxa nuevos en un estudio de la
microbiota oral en amerindios sudamericanos que viven en una aldea remota,
aunque la falta de un grupo de control dificulta la interpretación de estos datos.
La fuente primaria de nutrientes para las bacterias orales es endógena en forma
de saliva y fluido gingival crevicular. Cuando la comida se coloca en la boca y se
mastica, la producción de saliva se incrementa y la comida es rápidamente
tragada, lo que puede explicar por qué, en general, la dieta tiene poco efecto
sobre la composición de la microbiota oral. Una excepción es el carbohidrato
fermentable; algunas bacterias orales son expertos en tomar los azúcares y
fermentarlos para producir el ácido, dando por resultado la caries dental, según
lo descrito abajo. La ingesta elevada sostenida de carbohidratos en la dieta
puede resultar en una microbiota alterada, dominada por especies aciduricas, y
el microbioma salival en sujetos con caries-activa difiere de la encontrada en
sujetos sin caries.
Los métodos de secuenciación de próxima generación sin duda tienen el
potencial de revolucionar nuestra visión de la composición de los microbiomas,
pero sufren de algunas desventajas en comparación con la secuenciación
convencional de Sanger. Los primeros datos sufrieron una alta tasa de error
debido a la formación de heterodúplex y tramos homopoliméricos durante la
secuenciación que condujo a la detección de diversidad espúrea y estimaciones
excesivamente altas de la riqueza de especies en la saliva y la placa. Este
problema se ha abordado con éxito bioinformática y las estimaciones de la
riqueza de especies de los estudios recientes son ahora del mismo orden que
hasta ahora, con la ventaja de que la profundidad de cobertura que se puede
lograr para cada muestra individual se ha incrementado considerablemente.
Otra cuestión importante es que, en la actualidad, sólo se pueden obtener
secuencias relativamente cortas que impiden la identificación de especies a nivel
de miembros de muchos géneros. De hecho, es lamentable que incluso las
secuencias de rRNA 16S de longitud completa tengan una resolución insuficiente
para la identificación segura de especies que comprenden algunos de los
géneros orales importantes y predominantes tales como Actinomyces,
Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Porphyromonas y Selenomonas. En parte,
esto se debe al intercambio genético entre miembros de estos géneros que han
llevado a la recombinación dentro del gen del ARNr 16S, haciendo difícil la
interpretación de las relaciones filogenéticas derivadas de este gen.
Debido a estas limitaciones, el RDPC (Ribosomal Database Project Classifier),
una de las de análisis más utilizadas, sólo permite la identificación de secuencias
a nivel de género. Esto puede ser informativo cuando se aplica a comunidades
bacterianas muy diversas, pero para un microbioma bien estudiado, como el
microbioma oral, es una limitación severa. Por lo tanto, géneros como
Porphyromonas, Aggregatibacter y Tannerella incluyen algunas especies que
están fuertemente asociadas con la enfermedad y otras que están asociadas a
la salud. Los datos de los estudios de secuenciación de próxima generación
dirigidos al gen 16S rRNA deben ser interpretados con precaución para evitar
inferencias erróneas debido a las deficiencias de las tuberías de análisis
actuales. Para la microbiota oral, es posible utilizar la suite de análisis mothur
junto con el conjunto de referencia HOMD para obtener identificaciones a nivel
de especie para la mayoría de los géneros bacterianos orales. Un enfoque
alternativo se utiliza en el programa SpeciateIT, basado en la construcción de
modelos ocultos de Markov, y se ha demostrado que mejora la identificación a
nivel de especie de la microbiota endodóntica y vaginal.
La comunidad bacteriana de la boca está dominada por Firmicutes,
Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, Spirochaetes y Fusobacteria, que
representan el 96% de las especies detectadas. Las características clave de los
taxones bacterianos predominantes se han descrito previamente [1] y están
disponibles en el sitio web de la base de datos de microbiomas orales humanos
en www.homd.org.
Definir la composición exacta del microbioma oral es difícil debido a que la boca
es un sistema abierto y frecuentemente expuesto a bacterias exógenas en los
alimentos, en el agua, en el aire y en la microbiota normal de otros mamíferos,
incluidos los humanos, mediante el contacto social y el beso. A menudo es difícil
determinar si ocurre colonización a largo plazo con una especie particular. Sin
embargo, la mayoría de las bacterias no orales no se aislan rutinariamente de la
boca. ¿Por qué esto debería ser así es poco claro, pero las bacterias exógenas
pueden carecer de adhesinas y receptores que les permitan unirse a las
superficies orales o co-agregado con otras bacterias. También puede haber
exclusión inmune. La observación de que los coliformes intestinales se
encuentran raramente en la salud, pero a menudo se encuentran en los
individuos inmunocomprometidos y aquellos con flujo salival reducido. Otro
grupo de organismos que entran en esta categoría son los metilotróficos que
pueden usar sustratos de 1 carbono para el crecimiento. Al realizar el cultivo de
enriquecimiento de muestras orales usando una gama de sustratos de 1
carbono, se aislaron representantes de varios géneros incluyendo metilotrofos
conocidos tales como Methylobacterium e Hyphomicrobium y otros organismos
incluyendo Brachybacterium, Gordonia, Leifsonia, Microbacterium y Micrococcus
no se ha demostrado previamente. La mayoría de estos organismos no habían
sido previamente aislados de la boca y no estaban entre los detectados en 16S
rRNA gen clone bibliotecas. Se encuentran con frecuencia en el agua del grifo y
el medio ambiente, por lo que es posible que al aplicar la poderosa selección de
la cultura de enriquecimiento, se aislen organismos que sólo estaban presentes
en la boca transitoriamente, pero no eran colonos permanentes. Estas especies
también son principalmente aerobios obligados. Estos son un grupo raro en la
boca debido a la naturaleza altamente anaeróbica de las biopelículas
bacterianas orales después de un corto período de desarrollo. Es posible que las
bacterias metilotróficas puedan colonizar transitoriamente pero repetidamente
las superficies aeróbicas expuestas de la boca y utilizar sustratos de carbono 1
mientras estén allí. Sin embargo, se necesita más trabajo para confirmar esto.
Un problema adicional en la interpretación de los datos de estudios
independientes de la cultura es que los reactivos de PCR están frecuentemente
contaminados con ADN de bacterias ambientales que luego pueden amplificarse
mediante los insumos utilizados universalmente. Se ha descubierto que el
pretratamiento con luz ultravioleta es eficaz en la reducción de dicha
contaminación.
Conclusión
El uso de métodos moleculares recientemente desarrollados ha ampliado
enormemente nuestro conocimiento de la composición y función del microbioma
oral en salud y enfermedad. Sin embargo, aún queda mucho por hacer. Las
especies bacterianas están lejos de ser homogéneas y las comparaciones de
genomas de cepas de la misma especie han revelado la alta diversidad genética
de la mayoría de las especies estudiadas, particularmente en relación con la
presencia o ausencia de factores de virulencia. Como se discutió anteriormente,
las enfermedades asociadas con la microbiota comensal no son causadas por
un único patógeno, sino que resultan, en parte, de las acciones concertadas de
varias especies. Investigar y comprender las interacciones entre organismos
será una tarea muy compleja. Finalmente, estas enfermedades resultan
principalmente de una interacción entre el huésped humano y el microbioma. Las
variaciones en las respuestas humanas al microbioma rara vez han sido
estudiadas y la influencia de factores ambientales introduce una capa adicional
de complejidad. Los avances técnicos en la secuenciación de ADN y ARN
proporcionarán grandes cantidades de nuevos datos, pero el análisis y la
interpretación de los datos será extremadamente difícil.