UNIVERSIDAD JUAREZ DEL ESTADO DE DURANGO

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA II

ELBORADO POR :

IBQ. SARA ISABEL BANDT FAVELA.

Gómez Palacio, Dgo., Febrero de 2017

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 C O N T E N I D O

PAGINA

I.- PREFACIO ......................................................................................................... 3

II.-MEDIDAS DE SEGURIDAD ............................................................................... 5

III.- PRACTICAS

1.- Determinación de la actividad de la Enzima Sacarasa........................................ 6

2.- Hidrólisis de Polisacáridos………………............................................................... 8

3.- Extracción y Determinación de la Actividad Enzimática Amilasa Pancreática…...10

4.- Fermentación de Carbohidratos.............................................................................12

5.- Colesterol de la mantequilla y pruebas para el mismo...........................................14

6.- Obtención del DNA…………………………………………...................................... 16

2
PREFACIO

El manual de Bioquímica se ha preparado con algunas prácticas representativas, que intentan

explicar algunas de las propiedades de las biomoléculas y técnicas para estudiarlas. Se espera que
el estudiante adquiera los conocimientos necesarios para entender cursos posteriores que pudiera
tomar durante la licenciatura o bien en algún postgrado dentro del área biológica.

Los experimentos presentados en este Manual de Prácticas, han sido seleccionados partiendo de
metodologías utilizadas por diferentes autores, los cuales son citados en la bibliografía que se
acompaña al final de cada ensayo.
Dichos experimentos se han modificado y adaptado al curso de Bioquímica para tratar de
complementar los tópicos que serán cubiertos en la clase teórica.

Las diferentes secciones en que se encuentran divididos los experimentos son:

INTRODUCCION
OBJETIVO
FUNDAMENTO
MATERIAL Y REACTIVOS
PARTE EXPERIMENTAL
RESULTADOS
CONCLUSIONES
SECCION DE PREGUNTAS
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

En la INTRODUCCION se pretende poner en contacto al alumno con el tema a desarrollar,

proporcionándole los antecedentes y la información necesaria para una comprensión amplia de los
OBJETIVOS fijados al realizar el experimento.

EL FUNDAMENTO de cada práctica ayudará a la interpretación correcta de los acontecimientos que

están ocurriendo en cada uno de los pasos mencionados en la PARTE EXPERIMENTAL.

Para facilitar la rápida ejecución del experimento, este laboratorio de bioquímica les proporcionará
todos los REACTIVOS necesarios ya preparados, pero es menester que el alumno conozca los
cálculos y procedimientos indispensables para la preparación de los mismos.

También se proporciona una lista del MATERIAL que se usará en el transcurso del ensayo, tomando
en cuenta que cada equipo de trabajo consistirá de 5 a 6 alumnos.

Parte importante de estos manuales son las CONCLUSIONES a las que se llega al final del
experimento, una vez hecha la discusión de los RESULTADOS ocurridos durante el ensayo.

Se incluye una SECCION DE PREGUNTAS sobre el tema las cuales se referirán al procedimiento
utilizado así como también serán complementarias al tema. Para contestar dichas preguntas, se
podrán contestar diferentes textos, mismos que se deberán citar en la BIBLIOGRAFIA
CONSULTADA.

Al final de cada experimento se encontrará una lista de fichas bibliográficas revisadas para la
elaboración de este manual.

3
Espero que el Manual contribuya al mejor entendimiento de la Bioquímica y estimule a los
estudiantes a interesarse en ella.

A t e n t a m e n t e ,

IBQ SARA ISABEL BANDT FAVELA

Gómez Palacio, Dgo Febrero de 2017

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 REGLAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BIOQUIMICA

1. Portar bata blanca de algodón manga larga abotonada.

2. Cuando se manejen sustancias corrosivas, solventes volátiles, deberá usar la

campana extractora de gases.

3. Para la eliminación de residuos se deberán depositar en los contenedores

señalados para ese efecto.
.
4. No portar cualquier accesorio que lleve puesto (aretes, pulseras, anillos, reloj, etc.)
ya que son piezas metálicas o de material de plástico que podrían provocar algún
accidente.

5. No fumar ni ingerir alimentos en el laboratorio.

6. Debe saberse donde se encuentra y como se utiliza el equipo de seguridad y de

primeros auxilios.

7. A los alumnos no se les permitirá permanecer en el laboratorio si presentan sus

uñas largas y/o pintadas. Esto también aplica a los varones, además de que es
obligatorio presentar el cabello corto. Para las alumnas que usan el cabello largo
deberá permanecer recogido durante el tiempo que se realice la práctica, para evitar
que pueda engancharse en equipos.

8. El calzado adecuado para el laboratorio deberá cumplir con los siguientes requisitos:
a) ser completamente cerrados (hasta el empeine). b) de tacón bajo (No: tenis, zapatillas,
sandalias, zapatos de gamuza, ni zapato de tela).

9. Ninguna persona podrá realizar algún experimento que no esté autorizado previamente
por los docentes.

10. Cualquier conducta impropia o inadecuada dentro del Laboratorio será sancionada.
Estas conductas incluyen desorden, uso de lenguaje ofensivo y otros que puedan
afectar al desempeño adecuado de la práctica en curso.

11. Considérense todas las sustancias químicas peligrosas a menos que esté comprobado
lo contrario.

12. En caso de que sustancias químicas corrosivas se pongan en contacto con piel u ojos,
inmediatamente lavar la zona afectada con agua. Enseguida se informará al profesor del
laboratorio.

13. No se saboree cosa alguna. Nunca se olerá directamente el vapor.

14. No se froten los ojos cuando las manos estén contaminadas por sustancias químicas,
microorganismos, etc.

15. Debe informarse inmediatamente al profesor en caso de accidente.

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 P R A C T I C A No. 1

DETERMINACION DE LA ENZIMA SACARASA

OBJETIVO

Observar la acción catalítica de la enzima sacarasa sobre su sustrato específico que es la sacarosa.

FUNDAMENTO

La sacarasa rompe enlaces ( 1 - 2 ) de la sacarosa dando como productos glucosa más fructosa (azucares
++ +
reductores que al hacer contacto con el reactivo de Benedict reducen el Cu a Cu y ellas se oxidan
produciendo así ácido aldónicos o urónicos.

INTRODUCCION

La Beta fructofuranosidasa (invertasa, sacarasa). Enzima clasificada como EC 3.2.1.26, hidroliza

oligosacáidos, como la sacarosa y la rafinosa, previa identificación del residuo de fructosa que contienen
ambas en su molécula ; se encuentra en el jugo intestinal y sirve para metabolizar la sacarosa.

El déficit de la invertasa, produce en los infantes transtornos de la absorción de los azúcares particularmente la
sacarosa.

Casi todos los casos de la falta de invertasa publicados por (Rosenthal y col. 1962), iban acompañados de
déficit de isomaltasa. Esta invariable asociación entre déficit de invertasa y déficit de isomaltasa dio mucho que
pensar, podría deberse probablemente, a yuxtaposición de los genes reguladores, o a que se compartieran
genes reguladores u operadores.

El producto comercial de esta enzima se obtiene de microorganismos como Sacharomyces cerevisiae,

presenta actividad hasta 60ºC, tiene un pH óptimo de 4.5 a 5.5 y es inhibida por el yodo, el mercurio y el cobre;
se usa para fabricar jarabes de azúcar invertido.

MATERIAL REACTIVOS
1 mortero Levadura
2 pipetas de 5 ml. Arena
1 pizeta Eter
1 filtro Agua destilada
1 embudo de filtración rápida Sacarosa al 1 %
6 tubos de ensayo Almidón al 1 %
1 termómetro Buffer de fosfato pH 5.8
Reactivo de Benedict

PARTE EXPERIMENTAL

Extracción de la sacarasa.- Obténgase a partir de la levadura, moliendo un pedazo de levadura de pan, fresca
y comprimida, en un mortero junto con 5 gr. de arena y 10 ml. de éter; mientras se hace la trituración se le va
añadiendo agua en porciones de 2 ml. hasta completar 30 ml. Esta trituración y adición de éter se hace con el
objeto de destruir las células de levadura para que queden en solución las enzimas que contienen, entre las
que se encuentran la sacarasa.

Déjese reposar hasta que se haya sedimentado bien la arena y fíltrese.

6
Prepárese 6 tubos de ensayo como sigue :

A 2 tubos de ensaye se le agregan 3 mls. de extracto enzimático (sacarasa) más 3 ml. de agua y 1 ml. de
Buffer de fosfatos pH 5.8.

A otros dos tubos se le introduce 3 ml de extracto enzimático más de 3 de sacarosa al 1 % y 1 ml de Buffer de

fosfatos.

Y en 2 tubos se le introducen 3 ml de extracto enzimático más 3 ml de almidón al 1 % Y 1 ml de Buffer fosfatos.

Mezclar los tubos perfectamente y se dejan reposar por 30 minutos a temperatura ambiente y al término de
este periodo se hace la reacción de Benedict al contenido de cada tubo. Los primeros tubos se emplean como
testigo para ver si la levadura o alguno de los reactivos tienen propiedades reductoras que pudieran luego
atribuirse a la sacarosa. Obsérvense los resultados y véase si la levadura tenía sacarasa y amilasa; si las
enzimas son específicas o si carecían de toda actividad.

CUESTIONARIO

1.- Describa la oxidación de los carbohidratos y productos que se forman.

2.- Describrir la enzima sacarasa.

3.- Una lista de azúcares reductores y no reductores.

BIBLIOGRAFIA

1. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones Omega; 2005

2. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a. ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003.

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 P R A C T I C A No. 2

HIDROLISIS DE POLISACARIDOS

OBJETIVO

Observar la hidrólisis del almidón y la celulosa que son 2 polisacáridos que al mezclarse con HCl (hidrólisis
ácida) o con la amilasa salival Hidrólisis enzimática) dan productos finales de monosacáridos, y disacáridos.

FUNDAMENTO

La hidrólisis de una macromolécula puede llevarse a cabo usando diversos procedimientos : catalizando con
ácido o bases fuertes, con catalizadores inorgánicos u orgánicos o mediante enzimas hidrolíticas adecuadas.
En esta práctica se ilustran algunos de estos métodos, verificando la producción de la reacción mediante
reacciones cualitativas.

INTRODUCCION

La saliva tiene como función más importante la de humedecer y lubricar el bolo alimenticio; desde el punto de
vista digestivo es importante por contener la amilasa salival o ptialina, enzima que hidrolisa diversos
polisacáridos, como los almidones, el glucógeno y las dextrinas, hasta formar el disacárido maltosa.

En la degradación de la celulosa los seres humanos carecemos de los sistemas necesarios para atacar la
celulosa. Aunque en algunas ocasiones se ha demostrado que cantidades pequeñas de celulosa llegan a ser
atacadas en el intestino del hombre, su magnitud es realmente despreciable y quizá el efecto que pueda
adscribirse más bien a una discreta actividad de la flora bacteriana intestinal.

MATERIAL REACTIVOS

1 Vaso de ppdo. Almidón al 1 %

1 Baño de María Lugol
1 Agitador HCl concentrado
1 Placa de porcelana Reactivo de Benedict
1 Mortero Reactivo de Lucas
6 tubos de ensayo Papel filtro (celulosa).
NaOH al 20 %

METODOLOGIA

HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON

En un tubo de ensayo ponga 1 ml de saliva y 1 ml de agua destilada y 2 ml. de almidón al 10 %, meterlo en

baño de agua a 40ºC por 30 minutos. Hacer las pruebas de lugol al tiempo cero (es decir inmediatamente de
haber agregado el almidón) y a los 15 y 30 minutos de incubación. Confirmar la hidrólisis con la reacción de
Benedict.

HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDON

En un tubo de ensayo agregar almidón al 1% hasta cerca de la mitad del volumen del tubo.añadir 1 ml. de HCl
concentrado, calentar el tubo en baño de auga caliente y agitar. cada 5 minutos, sacar unas gotas y ponerlas
en una placa de porcelana más lugol. (si hay almidón se produce una coloración negra, azul o violeta). Seguir
sacando muestras hasta que la coloración sea amarilla. Cuando el lugol de amarillo se hace la prueba de
Benedict. A 5 ml. del reactivo de Benedict se le añaden 1 ml. de la solución calentar en baño hirviente por 3
minutos y enfriar. La prueba de Benedict es positiva si se presenta un precipitado rojo.

8
HIDROLISIS DE CELULOSA

Desmenuzar algodón o papel filtro en un mortero y agregar 6 ml. del reactivo de Lucas.
Calentar y agitar por 2 minutos y enfriar neutralizar con NaOH al 20 %. Tomar 2 muestras de la solución y
realizar la prueba de Benedict y Lugol.

RESULTADOS

Realizar cuadros esquemáticos indicando el tipo de Hidrólisis, coloración de las muestras y el nombre del
polisacáridos en cuestión.

CUESTIONARIO

1.- ¿Cuáles son los productos de la hidrólisis parcial y total del almidón y de la celulosa?.

2.- Fundamento de la prueba de Benedict para los azúcares reductores.

3.- ¿Qué son la amilosa y la amilodextrina?.

4.- Cite o ejemplos de Homopolisacáridos.

BIBLIOGRAFIA

1. Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third
edition. Addison Wesley Longman Inc. USA.

2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice.
1st edition. Waveland Press, Inc. USA.

3. Voet, D., and J.G. Voet. 1995. Biochemistry. Second Edition. John Wiley &
Sons, Inc. U.S.A

4. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical

Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.

9
 P R A C T I C A No. 3

EXTRACCION Y DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA AMILASA PANCREATICA

OBJETIVO
Extraer amilopsina a partir del páncreas de cerdo.
Determinar su actividad enzimática.

FUNDAMENTO
La amilasa pancreática actúa en los enlaces alfa 1-4, del almidón dando como productos dextrinas y maltosa.
En esta práctica, el avance de la hidrólisis del almidón se demostrará siguiendo la formación del complejo con
yodo el cual da una coloración violeta con los almidones. A medida que se va efectuado la hidrólisis, el color
azul va desapareciendo y aparece un color rojizo (eritrodextrinas) y posteriormente se observa una coloración
amarilla, debida únicamente a la solución de yodo, lo que demuestra que el almidón ha sido hidrolizado hasta
maltosa.

INTRODUCCION
Es en el intestino donde los carbohidratos, tanto como polisacáridos como desacáridos, sufren los procesos
digestivos de mayor importancia.

En el duodeno se vierte el jugo pancreático que contiene la amilasa pancreática, diastasa o amilopsina, enzima
hidrolítica muy parecida a la salival, es decir, que se trata de una alfa amilasa que ataca a los almidones, las
dextrinas y el glucógeno a nivel de cualquier unión glucisídica alfa 1-4 al azar, de manera que se libera
especialmente la maltosa y además pequeños olisacáridos en los que abundan las uniones alfa 1-6 ya que esta
enzima no puede atacarlas. Para romper las ramificaciones de los polisacáridos se requiere la acción de la
oligo-1-6 glucosidasa.

MATERIAL REACTIVOS
18 tubos de 13 x 100 Extracto pancreático
1 Baño de María a 40ºC (amilasa pancreática)
1 Agitador almidón al 3 %
1 gradilla lugol
1 pipeta de 5 ml.

PARTE EXPERIMENTAL

Preparar 3 soluciones de estracto 1:1, 1:10 y 1:100, acomodar en la gradilla 3 series de 6 tubos.

No. de tubo 1 2 3 4 5 6

Extracto 1:1 2.5 2.0 1.6 1.2 0.8 0.5 ml.

Agua dest. 0 0.5 0.9 1.3 1.7 2.0 ml.

Hacer lo mismo para las soluciones 1:10 y 1:100.

Ponerlas en baño de María a 40ºC y agregar 2 ml. de almidón al 2 %, agitar cada 5 minutos durante media
hora.

Sacar los tubos y acomodarlos en la gradilla y agregar 3 gotas de Lugol a cada uno de los tubos y agitar.
Anotar la coloración de cada tubo.

10
RESULTADOS

Realizar un cuadro esquemático representando cada una de las diluciones de la amilasa pancreática, el
número de tubo y la coloración.

NOTA: Los colores que se obtienen en el Lugol deben interpretarse así:

Color azul: lila o negro: Hidrólisis negativa (almidón).
Color rojizo: Hidrólisis parcial (dextrinas).
Color amarillo: Hidólisis total (glucosa).

Hacer los cálculos correspondientes :

CALCULOS

Una unidad de actividad enzimática de amilasa se define como el número de ml. de solución de almidón al 1 %
que pueden ser hidrolizados en 30 minutos por 1 ml. de extracto puro, en las condiciones de pH y temperatura
a que se haya trabajado.

De acuerdo con esta definición se tomará en cuenta para los cálculos, el tubo que haya presentado hidrólisis
total con la menor cantidad posible de extracto. obviamente, para todas las cantidades mayores de extracto
también es completa la hidrólisis . Si por ejemplo, este tubo fue el 3 de la dilución 1:10, dicho tubo contiene
1.6 ml. de extracto diluido, o sea contiene 0.16 ml. de extracto puro. La cantidad de sustrato es de 2 ml. al 2 %
o sea, el equivalente a 4 ml. al 1 % por lo tanto :

0.16 ml de extracto hidrolizan 4 ml. de almidón al 1 %

1 ml. ----------------------------------------------------X
4
En este caso: X = ------ = 25 unidades de actividad enzimática.
0.16

CUESTIONARIO

1.- Determinar la estructura química de la molécula de almidón.

2.- Propiedades de almidón y derivados.

3.- Explique la reacción del Lugol - almidón.

4.- Estructura de la maltosa.

BIBLIOGRAFIA
1. Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third
edition. Addison Wesley Longman Inc. USA.

2. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical

Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.

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 P R A C T I C A No. 4

FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO

Conocer la diferente capacidad de los azúcares para ser fermentados y los productos finales de la
fermentación.

FUNDAMENTO

La levadura (Sacharomyces cerevisiae), es un microorganismo que utiliza a los carbohidratos como principal
fuente de carbono y energía; en condiciones anaerobias, los carbohidratos con metabolizados a CO2 y etanol.

INTRODUCCION

Hasta el final del siglo XIX se creía, casi universalmente, que una fuerza vital era la responsable de los
procesos de la vida y que estos procesos ocurría en las células vivas. En 1896 esta doctrina llamada
“vitalismo” se descartó por un experimento que marcó el nacimiento de la bioquímica. Un químico alemán M.
Hann, separó proteínas de levadura, un colega de Hahn,
Hans Buchner, sugirió añadir sacarosa a los estractos de levadura.

Cuando se añadía sacarosa a los estractos se producía burbujas en la disolución. Buchner concluyó que
estaba sucediendo una “fermentación”, un proceso descrito por Luis Pasteur como “vida sin aire”. Buchner
planteó la hipótesis de que la fermentación resultaba de la actividad de una enzima a la cual denominó zimasa.
Nosotros llamamos a este proceso,
que en realidad comprende 10 enzimas, Glicólisis (del griego glykos, dulce y lysis, escisión). Buchner ganó por
su trabajo el Premio Nobel.

MATERIAL REACTIVOS

1 gradilla Sacarosa al 1 %
4 tubos de ensayo Lactosa al 1 %
4 tubos de Dunham Maltosa al 1 %
1 pipeta de 1 ml. 1 trozo de levadura fresca

METODOLOGIA

Prepárense 4 tubos de ensaye y llénese el primero con 25 ml de solución al 1 % de sacarosa (sin levadura)
como tubo testigo.

El segundo tubo lleva sacarosa al 1 %, el tercero lactosa al 1 % y el cuarto maltosa al 1 %, a las soluciones
anteriores previamente se les suspendió un trocito de levadura fresca, comprimida, del tamaño de un chícharo.

Colocar en cada uno de los tubos un tubo Dunham.

Déjese reposar los tubos durante 24 horas y observar en que tubos hubo la formación de cámara de gas. esa
es una indicación de que ha habido la producción de gases por fermentación.

Se puede estudiar la naturaleza del gas, introduciendo NaOH al 10 % que al combinarse con el CO 2 forman
carbonatos y bicarbonatos de sodio y la burbuja de gas desaparece.

RESULTADOS

Esquematice en un cuadro donde anote sus observaciones de qué azúcares fueron fermentables por la
levadura.

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CUESTIONARIO

1.- Diferencia entre fermentación y respiración aeróbica.

2.- ¿Cuál es la utilidad de la fermentación para los microorganismos que la realizan?.

3.- Indica como el piruvato es transformado a alcohol etílico en algunos microorganismos.

4.- Explica la conversión de piruvato a Lactato en músculo esquelético.

5.- ¿En qué tejidos del organismo humano se lleva a cabo la conversión de piruvato a
lactato?.

BIBLIOGRAFIA

1. Mathews, C.K., van Holde K.E. and Ahern K.G. 2000. Biochemistry. Third edition. Addison Wesley
Longman Inc. USA.

2. Stryer, L. 1995. Bioquímica. Cuarta edición. Editorial Reverte. Barcelona España.

3. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry. Fifth edition.
Cambridge University Press.

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 P R A C T I C A No. 5

COLESTEROL DE LA MANTEQUILLA Y PRUEBAS PARA EL MISMO

INTRODUCCION:

El colesterol se encuentra en los tejidos y en las lipoproteínas plasmáticas como colesterol libre o como ester
de colesterilo. (Combinado con un ácido graso de cadena larga). Es sintetizado en numerosos tejidos a partir
de acetil Co A y finalmente eliminado por bilis como sales biliares. Es el precusor de todos los demás
esteroides del organismo, como corticosteroides, hormonas sexuales, ácidos biliares y vitamina D; es
típicamente un producto del metabolismo animal y por lo tanto existe en los alimentos de origen animal como la
yema de huevo, mantequilla, carne, hígado y cerebro.

OBJETIVO:

Extraer el colesterol de la mantequilla por medio de un solvente orgánico adecuado, y comprobar su presencia
del mismo, por medio de pruebas coloridas y por la formación de cristales de colesterol.

FUNDAMENTO:

El colesterol forma parte de la porción insaponificable de la mantequilla.

Para extraerlo de la misma hay que saponificar la mantequilla y luego extraer el colesterol con un disolvente
orgánico (cloroformo).

MATERIAL Y EQUIPO R E A C T I V O S.

Balanza 5 grm de mantequilla

1 matraz E. Meyer de 500 ml. 20 ml. de cloroformo
1 Cápsula de porcelana 1 ml. de anhídrido acético
1 Embudo de filtración rápida 12 ml. de ácido sulfúrico
Papel filtro 5 ml. de acetona
tubos de ensayo 5 ml. KOH
Gradilla 1 ml. de alcohol etílico 96º
pipetas (1,5 y 10 ml)
probeta de 50 ml.
microscopio.

PARTE EXPERIMENTAL:

Para saponificar la mantequilla póngase en un matraz E. Meyer de 500 ml., seco. 5 gr. de mantequilla y
fúndase a baño María. Añada 4 ml. de solución acuosa de hidróxido de potasio al 65 % y 5 ml. de alcohol al
95º. Mézclese cuidadosamente y póngase sobre el baño de María hirviente durante media hora o hasta que
desaparezca completamente el olor a alcohol, pruébese si la saponificación fue completa, y cuando ya no se
produzca más sobrenadante de gotas de grasa, transfiérase a una cápsula y evapórese a sequedad a baño
María.
Añadir 15 ml. de cloroformo y agitar suavemente la mezcla, durante aproximadamente de 30 - 35 minutos.
Después fíltrese el cloroformo a través de un papel filtro seco ya que la presencia de agua interfiere con las
pruebas posteriores.

Estudiese la presencia del colesterol en el extracto clorofórmico de la fracción insaponificable de la mantequilla

que se acaba de separar, haciendo las pruebas que siguen :

A).- REACCION DE LIEBERMANN-BURCHARD. Póngase en un tubo de ensayo seco 2 ml. del extracto
clorofórmico, agregue 10 gotas de anhídrido acético y 2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. Mezclar
bien y dejar reposar 15 minutos. Si existe colesterol aparecerá una coloración azul verdosa que pasa por
verde.

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B).- PRUEBA DE SALKOWSKI.- Póngase 3 ml. de extracto clorofórmico en un tubo de ensayo,
viértase por la pared del tubo 2 ml. de ácido sulfúrico concentrado agítelos cuidadosamente, déjelos
reposar 15 minutos. Observar la separación de dos capas, la clorofórmica adquiere una coloración roja
cereza en caso de existir colesterol. La capa sulfúrica toma una coloración amarilla con fluorescencia. La
presencia de humedad dificulta la reacción.

SECCION DE PREGUNTAS :
1.- Escriba la fórmula estuctural química del colesterol
2.- Describa a que grupo de lípidos corresponde el colesterol y sus propiedades.
3.- Indique los niveles normales de colesterol en plasma.
4.- Indique las funciones de colesterol en el organismo.
5.- Explique las causas posibles de elevados niveles del colesterol en plasma.

BIBLIOGRAFIA:

Rendina, G. 1974. Técnicas de Bioquímica Aplicada. 1ª Edición

Editorial Interamericana. México.

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 P R A C T I C A No 6

OBTENCION DEL DNA

OBJETIVO
Aislar el DNA cromosómico a partir de la bacteria Escherichia coli. Y de sangre humana

FUNDAMENTO
Existen métodos epeciales para el aislamiento, purificación y medición cuantitativa de los ácidos nucleícos.
Entre éstos se incluye la extracción selectiva, precipitación, centrifugación (ó filtración) hidrólisis, cromatografía
y técnicas ópticas para establecer la cantidad de ácido nucleíco.

INTRODUCCION
Los ácidos nucleícos son polímeros de elevado peso molecular cuya unidad monomérica, o componente
fundamental es el Mononucleótido, el cual consiste de una base nitrogenada púrica o pirimídica, una pentosa y
ácido fosfórico.

Exsisten dos tipos de ácidos nucleícos que son: el Acido Desoxirribonucleíco (DNA) y el Acido Ribonucleíco
(RNA).

En cuanto a su localización el DNA se encuentra siempre en el núcleo de las células eucarióticas, y en la

región del nucleoide en los organismos procarióticos. En los organelos como las mitocondrias y el cloroplasto,
se ha demostrado, la presencia de ácido desoxirribonucleíco llamado “DNA SATELITE”.

En las células procarióticas además de su genóforo existen pequeñas moléculas de DNA circulares, de doble
cadena y autoreplicables, llamados PLASMIDOS los cuáles pueden contener un mínimo de 3 genes y un
máximo de 100 genes, y frecuentemente confieren a las bacterias la resistencia a antibióticos.

MATERIAL REACTIVOS
2 tubos de ensayo NaoH 0.2 N
2 piperas de 5 ml SDS (Lauril sulfato de sodio) al 1 %
1 pipeta Pasteur Etanol absoluto
1 varilla de vidrio Tritón X-100 al 1 %
1 gradilla NaCl 0.1 M
Centrífuga clínica Bacterias en cultivo (E. Coli)
Microscopio Sangre humana.

METODO

1.- Tomar 5 ml de cultivo de bacterias crecido toda la noche a 37ºC.

2.- Centrifugar a 1500 rpm, 5 min. Descartar el sobrante.

3.- Resuspender perfectamente el precipitado bacteriano en 0.8 ml de agua destilada

4.- Adicionar 1.6 ml de una solución de NaOH 0.2 N y de SDS.

5.- Invertir el tubo suavemente 3 veces.

6.- Agregar 2.4 ml de etanol frío.

7.- Repetir el paso 5. Observar como se precipitan los filametros de DNA.

8.- Colectar el DNA con una varilla de vidrio (girándola suavemente) y resuspender en 0.2 ml de agua
en un tubo pequeño.

9.- Observar el microscopio.

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SECCION DE PREGUNTAS

1.- Mencionar cómo está organizado el genoma en células eucarióticas.

2.- ¿Cuál es la fuente de DNA en la sangre?

3.- ¿Cómo actúa un detergente?

BIBLIOGRAFIA

1. Becker, J.M., G.A. Caldwell, E.A. Zachgo. 1996. Biotechnology. A laboratory

course. Second edition. Academic Press , USA

2. Chernecky CC. Pruebas de laboratorio y procedimientos diagnósticos. 2a. ed.

México: McGraw-Hill Interamericana Editores; 1999.

3. Stryer L. Bioquímica. 5a. ed. Barcelona: Editorial Reverté; 2003.

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