UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FUNDACION CENTRO DE ESTUDIO DE MEDICINA ESTETICA

CURSO AVANZADO DE MEDICINA ESTETICA Y CORPORAL

ESTUDIOS DE TRATAMIENTOS BASADO EN EL CULTIVO DE

QUERATINOCITOS EN PACIENTES CON INJURIAS DE LA PIEL.

AUTORES:
Rangel, Lucila
Vásquez, Elvia
Vázquez, Zulimer
TUTORA:
Zambrano, Eduvigis

Caracas, abril 2016

ACTA DE APROBACIÓN

ii
 DEDICATORIA

A la memoria de mis ángeles celestiales: mi padre Ramón Vázquez; mi abuela Adela y

mi amore Hermes.

A mis grandes amores terrenales: mi hijo Jesús David; mi madre Aura y mi compañero
de vida Alejandro.

Zulimer Vázquez

A la memoria de mis padres; a mis hijos Martha Elena y Oswaldo y a mi nieta Andrea.

Elvia Vásquez

iii
 AGRADECIMIENTOS

A Dios por encima de todo lo creado, nuestro propósito y razón de vivir.

A nuestros familiares por el apoyo y paciencia.

A FUCEME, todos sus docentes, en especial al Dr. Victor García, gran maestro.

A la profesora Alida Rangel, quién nos brindó gran ayuda y consejos en la metodología
correspondiente.

A la Dra. Eduvigis Zambrano, quien a pesar de la distancia, se mantuvo atenta a

nuestras inquietudes.

RESUMEN

iv
En los actuales momentos, las injurias de la piel: quemaduras, úlceras crónicas varicosas
o por diabetes, constituyen un importante problema de salud pública que causa un alto
índice de mortalidad y con graves secuelas derivadas de la cicatrización. En las últimas
décadas se han desarrollado diversos métodos que permiten reemplazar los principales
componentes de la piel perdida (epidermis y dermis). En este sentido, la bioingeniería
ha revolucionado la investigación en el área de curación, permitiendo el establecimiento
de modelos in vitro y sistemas de cultivo de células; dentro de estos, el cultivo de
queratinocitos se ha convertido en una técnica cada vez más popular entre los
profesionales que a diario se enfrentan a la difícil tarea de tratar lesiones ocasionadas
por quemaduras, úlceras crónicas. y defectos de la mucosa bucal; también su aplicación
relevante en la cirugía reconstructiva y estética (úlceras) y en algunas enfermedades
como la epidermólisis bullosa, la schistosomiasis. El presente trabajo tiene como
objetivo conocer los avances en el cultivo de queratinocitos como sustituto de la piel
perdida, mediante la revisión sistemática de la información obtenida en los estudios
realizados en centros de investigación e instituciones clínicas de otras áreas
geográficas. Fuentes de información: la base de datos utilizada para la búsqueda de
información fue la siguientes: Medline (vía PubMed), Elsevier (vía ScienceDirect),
Lilacs (vía Bireme), Scielo y Google Académico. Los análisis retrospectivos sobre los
queratinocitos autólogos mostraron que, cultivados pueden acelerar la cicatrización de
heridas o diferentes injurias en la piel. En su conjunto, el impacto futuro de las opciones
de cobertura celular de queratinocitos mediada es prometedor, pero se necesita más
investigación. Los tratamientos a base de queratinocitos deben llevarse a cabo con
cuidado, porque la sobre activación de estas células puede contribuir en el desarrollo de
cicatrices hipertróficas.

Descriptores: Injurias de piel, cultivo de queratinocitos

Abstract

In these days, skin injuries like skin burns, diabetes or chronic varicose ulcers are a
major public health problem that causes a high rate of mortality and serious
consequences resulting from healing and cicatrizing. During the last decades different
methods have been developed to replace the main components (epidermis and dermis)
of the lost skin. In this regard, bioengineering has revolutionized research in the area of
healing, allowing the establishment of in vitro models and systems cell culture. Within

v
these, the keratinocyte culture has become an increasingly popular technique for healing
burns, chronic ulcers, and oral mucosa defects. It is also an important application in
ulcer reconstructive surgery and cosmetic surgery. Furthermore, it is also used to treat
some diseases such as epidermolysis bullosa and schistosomiasis. This paper aims to
determine progress in keratinocyte culture as a substitute for the lost skin, by the
systematic review of information obtained from studies conducted in research centers
and clinics institutions in other geographical areas. Sources of information: Medline (via
PubMed), Elsevier (via ScienceDirect), Lilacs (via Bireme), Scielo and Google Scholar.
Retrospective analysis of autologous keratinocytes showed that cultured can accelerate
wound healing and various skin injuries. All in all, the future of keratinocyte-mediated
cellular coverage is promising, but more research is needed. Treatments based
keratinocytes should be carried out carefully, because the over activation of these cells
may contribute to the development of hypertrophic scars.

Descriptors: skin injurie, keratinocyte culture

INDICE

Pág

Dedicatoria............................................................................................... II
vi
Agradecimiento........................................................................................ III
Resumen................................................................................................... IV
Indice general.......................................................................................... VI
Indice de figuras........................................................................................ VIII
Indice de esquemas.................................................................................................. IX
Introducción………………………………………………………………………. X
CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
I.-Planteamiento del problema.................................................................. 14
1.1.- Objetivos 16
1.2.1.-Objetivo General
1.2.2.- Objetivos Específicos
1.2.-Justificación................................................................................... 16
CAPÍTULO II
MARCO TEORICO
2.1.- Antecedentes de la Investigación………………………………….. 18
2.2.- Bases Teóricas……………………………………………………… 22
2.2.1.- Piel…………………………………………………………. 22
2.2.2.- Histología de la piel………………………………………… 22
2.2.3.- Morfología de los queratinocitos………………………….. 26
2.2.4.- Funciones de los queratinocitos……………………………. 30
2.2.5.- Técnicas de cultivo de queratinocitos……………………… 32

CAPÍTULO III
MARCO METODOLOGICO
3.1.- Tipo y Diseño de la Investigación…………………………………… 42
3.2.- Criterios de Búsqueda………………………………………………. 42
3.3.- Selección de los estudios……………………………………………. 43
3.4.- Criterios de Exclusión………………………………………………. 44
3.5.- Procedimientos de la investigación………………………………… 44
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
4.1.- Injurias de la piel y enfermedades que han sido sometidas a 46
estudio de tratamiento a través del cultivo de queratinocitos…..
4.1.1.- Tratamiento de quemados con cultivos de 46
queratinocitos……………………………………………………………..
4.1.2.- Tratamiento de úlceras 52
4.1.3.- Cultivos de queratinocitos como tratamiento de enfermedades de la 56
piel……………………………...................................................................
4.1.3 1.- Epidermólisis Bullosa…………………………………………. 56
4.1.3.2.- Esquistosimiasis………………………………………………. 59
4.2.- Factores biológicos, económicos y técnicos que inciden en 60
la elaboración de la aplicación de técnicas mediante el
cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias de piel…
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS………………………………... 62
vii
CAPÍTULO IV
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES………………………… 65
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 66

INDICE DE FIGURAS

Pág

Figura 1.- .- Epidermis de distinto grosor de piel de rata 24

Figura 2.- Esquema donde se muestra el proceso de maduración de los 30

queratinocitos, desde el estrato germinativo hasta el estrato corneo………

Figura 3.- Preparación de piel artificial para trasplante…………………… 40

Figura 4.- Mujer de 20 años de edad, con quemaduras del 97% SCT……. 48

Figura 5.- Utilización de Tissocol como hemostático……………………… 48

Figura 6.- Imagen desbridamiento y cobertura con hemoinjertos………….. 49

Figura 7.- Suspensión con estribo de la extremidad inferior………………. 49

Figura 8.- Láminas de queratinocitos en su medio de transporte………….. 50

Figura 9.- Láminas bicapa del equivalente cutáneo autólogo……………… 50

Figura 10.- Primera cura. Se puede observar islotes de epitelización 51

que con el tiempo van confluyendo…………………………

Figura 11.- Detalle de figura 10……………………………………………. 51

Figura 12.- Resultado a los 4 años………………………………………….. 52

Figura 13.- Equivalente epidérmico humano obtenido “in vitro” …………. 53

viii
Figura 14.- Ulcera vascular. Evolución………………………………………… 55

Figura 15.- Cara anterior y lateral de la pierna derecha al momento del 57

Diagnóstico………………………………………………………………….

Figura 16.- Cara anterior y lateral de la pierna derecha al finalizar 58

la quinta semana de tratamiento………………………………………….

INDICE DE ESQUEMAS

Pág
Esquema 1.- Cultivo de epitelio aislado…………………………………… 34

Esquema 2.- Cultivo primario…………………………………………….. 38

Esquema 3.- Cultivo secundario……………………………………………. 39

ix
x
 INTRODUCCION

La piel constituye el órgano más grande del cuerpo humano, protegiéndolo del medio
ambiente (contra fuerzas mecánicas, factores químicos, radiaciones, cambios de
temperatura, microorganismos y manifiesta signos y síntomas de enfermedades
sistémicas) y jugando además un papel importante en otras funciones vitales tales como
metabólicas (síntesis de vitamina D, reserva de grasas, eliminación de desechos,
equilibrio hidroelectrolítico, secuestro de tóxicos), nervioso (asiento de receptores
nerviosos: tacto, temperatura, presión, dolor) y psicológica (expresión de emociones,
contacto afectivo, autoimagen, cosmética).1

El daño tisular induce una secuencia de reacciones bioquímicas y celulares que están
destinados a reparar la integridad de los tejidos. El proceso de cicatrización implica una
sincronía orquestada de las células, en el que cada participante interactúa con otros
factores. Muchos aspectos de esta comunicación intercelular siguen sin estar claros, a
pesar del hecho indiscutible de que las células son responsables de la liberación del
factor de crecimiento y otras moléculas de señalización que participan activamente en el
proceso de cicatrización de la herida, que modulan el microambiente y la respuesta
celular.2

Entre los componentes de esta orquesta, los fibroblastos desempeñan muchas funciones
en la cicatrización de heridas. En primer lugar, los fibroblastos proliferan en el sitio de
la herida y secretan colágeno en la matriz extracelular, llenando el vacío y la creación de
un nuevo soporte estructural para que la epidermis pueda proliferar. En segundo lugar,
los fibroblastos contraen el lecho de la herida, una acción que comienza 4 a 5 días
después de la lesión y alcanza su pico 12 a 15 días después de la lesión. Esta
característica puede persistir durante períodos más largos, especialmente si la herida
está todavía abierta.2

11
Esto ha hecho que se haya generado la necesidad de crear un sustituto para la piel ante
las lesiones y daños que pueden producírsele por enfermedades, accidentes,
traumatismos o cirugías extensas. Por ello, a lo largo de la historia, se hicieron múltiples
intentos de obtener un medio natural o artificial capaz de sustituir la piel dañada o
perdida, pero solo los grandes avances hechos en biología celular en el siglo XX
permitieron, a partir de la década de los años 50, que se iniciaran y se desarrollaran
diversas técnicas que permitieran alcanzar ese objetivo. Dentro de todas las técnicas
ensayadas destacan las desarrolladas a partir de cultivo de células in vitro, haciendo
posible que las células aisladas de un organismo puedan sobrevivir y multiplicarse por
largo tiempo o por tiempo indefinido. 1,3

La bioingeniería ha revolucionado la investigación en el área de curación, permitiendo

el establecimiento de modelos in vitro y sistemas de cultivo de células que imitan
diferentes etapas de la cicatrización de heridas. En particular, los cultivos de
queratinocitos sobre sustitutos dérmicos proporcionan un entorno mejorado para la
observación de estas células con la matriz subyacente.1

Desde su primera aplicación, hace más de 30 años, el cultivo de queratinocitos se ha

convertido en una técnica cada vez más popular entre los profesionales que a diario se
enfrentan a la difícil tarea de cubrir las pérdidas de sustancia en diferentes injurias de la
piel, destacándose por su incidencia y extensión las lesiones ocasionadas por
quemaduras, epidermólisis, úlceras crónicas y defectos de la mucosa oral; también su
aplicación relevante en la cirugía reconstructiva y estética.3, 4, 5, 6,7

Los recientes avances alcanzados, tanto en el conocimiento de la biología de las heridas

crónicas como en las nuevas técnicas para el cultivo de las células “in vitro” mediante la
Ingeniería de Tejidos, han permitido el desarrollo de nuevos procedimientos
terapéuticos con los cuales se han logrado avances muy significativos. Las nuevas
técnicas permiten el aislamiento y el cultivo de las células de la piel a partir de pequeños
fragmentos de este órgano. Las muestras son procesadas para seleccionar y amplificar
los queratinocitos “in vitro”, lo cual permite producir láminas de células sobre una
matriz; se crean así los equivalentes cutáneos que son trasplantados en las lesiones de la
piel.1,3
12
Los queratinocitos son de particular interés ya que constituyen la mayoría de las células
en la barrera primaria de la piel contra los patógenos invasores, la epidermis, y es el
primer tipo de célula expuesta a daños químicos, físicos e infecciosos. Además de
proporcionar una barrera física a la infección, los queratinocitos median la homeostasis
de la piel y responden rápidamente a injuria mecánica a través de la secreción de
factores solubles (por ejemplo, citocinas y quimiocinas) y el aumento de sus respuestas
proliferativas a fin de restaurar el tejido dañado. 8

Rheinwald& Green, en la década de los 70, aplicaron la técnica del cultivo de

queratinocitos a la producción de equivalentes cutáneos para la cobertura de lesiones
extensas, estos procedimientos fueron entusiásticamente recibidos por los médicos
dedicados a pacientes quemados. Su aplicación se popularizó durante la década de los
80, y la primera publicación científica de aplicación y resultados se presentó en 1990. 9

En este sentido, el presente trabajo tiene como objetivo fundamental conocer estudios
de tratamiento basado en el cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias de la piel,
bajo un enfoque de investigación cualitativa- interpretativa, sobre la base de la
información en los últimos diez años (2006- 2016), revelada por otros investigadores
de centros de investigación e instituciones clínicas de otras áreas geográficas, en este
campo del conocimiento.

La estructura de la investigación, se desarrolló de la siguiente manera: capítulo I hace

referencia a la formulación del problema, objetivos y justificación; capítulo II contiene
el marco teórico, en el cual se aborda los antecedentes de la investigación y las bases
teóricas, referentes a la conceptualización de la piel, histología de la piel, morfología de
los queratinocitos, funciones de los queratinocitos y tipos de técnicas de cultivo de
queratinocitos; capítulo III incluye el marco metodológico, estrategia que permitió
alcanzar los propósitos del estudio, por lo tanto, se determinó el diseño de investigación,
fuentes de información, criterios de búsqueda, proceso de selección, criterios de
exclusión, procedimiento de la investigación y análisis de los datos; capítulo IV hace
referencia en los resultados y discusión de la investigación sobre tratamientos basado en
el cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias de la piel y los factores

13
biológicos, económicos y técnicos que inciden en la aplicación de estos estudios de
tratamiento a partir de los hallazgos obtenidos en publicaciones y revisiones científicas
de otros autores; Capítulo V: expone claramente las conclusiones de este trabajo de
investigación.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los actuales momentos, las quemaduras y las úlceras crónicas varicosas o por
diabetes, más enfermedades que afecten grandes extensiones de la piel, constituyen un
importante problema de salud pública que causa severa discapacidad física, psicológica,
social y laboral con repercusión económica, ya que los gastos tanto de atención, como
de rehabilitación, son costosos.

Ante este panorama, las instituciones de salud pública y privada, se ven en la necesidad
de ampliar sus acciones en manejo de estas patologías, para que estos modelos de
terapia sirvan de base y ejemplo con el aprovechamiento de los recursos ya existentes de
diagnóstico y tratamiento, así como del desarrollo importante de la indagación
científica en este campo, optimizando entre sus funciones la investigación
epidemiológica, básica, clínica y tecnológica para el mejor conocimiento, prevención,
tratamiento y rehabilitación de las injurias mencionadas.

Desde esta perspectiva, el tratamiento de las quemaduras, ha tenido grandes avances en

los últimos años, al reducir gran porcentaje de mortalidad, restauración funcional y
cosmética, así como la rehabilitación integral con incorporación a la vida social, escolar
y laboral, lo que ha servido de base y ejemplo para terapias enfocadas en la
recuperación de la piel en otras patologías. Y es así como la técnica del cultivo de
queratinocitos, constituye en la actualidad una alternativa avanzada para brindar la
mejor atención a esta problemática en las diferentes instituciones de salud en las
distintas áreas geográficas.9

14
En particular, los cultivos de queratinocitos sobre sustitutos dérmicos proporcionan un
entorno mejorado para la observación de estas células con la matriz subyacente. Estas
nuevas técnicas permiten el aislamiento y el cultivo de las células de la piel a partir de
pequeños fragmentos de este órgano. Las muestras son procesadas para seleccionar y
amplificar los queratinocitos “in vitro”, lo cual permite producir láminas de células
sobre una matriz; se crean así los equivalentes cutáneos que son trasplantados en las
lesiones de la piel.1,3

Aunque existe un creciente esfuerzo dedicado a la investigación en la producción de

queratinocitos como medio de cultivo para la recuperación del tejido cutáneo por
injurias de piel, existen pocos investigadores y profesionales del área de la salud
limitados a enfrentar cantidades inmanejables de información relativa a este tipo de
investigación científica y por lo tanto, evaluar e identificar esta alternativa técnica e
incorporarla a las decisiones clínicas.

De allí que en este estudio se plantea realizar una revisión sistemática de la literatura,
que recopile de forma actualizada, la información específica y relevante sobre la
estudios de tratamiento basado en el cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias
de la piel y que permita, al mismo tiempo, agilizar su aplicación en la terapia clínica
con la finalidad de tener diagnósticos más precisos y ofrecer un tratamiento más eficaz.
En este sentido, cabe formularse las siguientes interrogantes: ¿Cuáles son los estudios
de tratamiento basado en el cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias de la
piel? ¿Cuales injurias de la piel y enfermedades han sido sometidas a estudios de
tratamiento a través del cultivo de queratinocitos. ¿Qué factores biológicos,
económicos y técnicos inciden en la elaboración de la aplicación de técnicas mediante el
cultivo de queratinocitos en pacientes con quemaduras, úlceras y otras enfermedades de
la piel?

15
 OBJETIVOS

General

Conocer estudios de tratamiento basado en el cultivo de queratinocitos en pacientes con

injurias de la piel.

Específicos:

 Identificar injurias de la piel y enfermedades que han sido sometidas a estudios

de tratamiento a través del cultivo de queratinocitos.

 Conocer los factores biológicos, económicos y técnicos que inciden en la

aplicación del cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias de la piel.

Justificación de la investigación

En los actuales momentos, las injurias de la piel, tales como las quemaduras, las ulceras
crónicas varicosas o por diabetes, enfermedades cutáneas, constituyen un importante
problema de salud pública. Las quemaduras de gran extensión en particular, causan un
alto índice de mortalidad y con graves secuelas derivadas de la cicatrización que
produce desfiguramiento facial y corporal, con contracturas y deformidades de las
extremidades que ocasionan limitación funcional con marcada repercusión psicológica,
social y económica, ya que los gastos tanto de atención y como de rehabilitación son
económicamente costosos.

La realización del presente trabajo, se justifica en el sentido de que las patologías más
frecuentes de ingreso por emergencia (quemaduras, ulceras crónicas varicosas o por
diabétes) en los diferentes centros de atención médica, han sido tratados con diversas
alternativas terapéuticas que no arrojan resultados favorables esperados, como lo
demuestran los pocos estudios plasmados en trabajos de investigación, por lo que la
producción de queratinocitos para la recuperación de la piel, se convierte en una técnica

16
alternativa a los otros tratamientos de cuadros patológicos mencionados y demás
lesiones de piel. En este sentido, representa una nueva alternativa favorable y
satisfactoria con mejoría total de las lesiones en los pacientes y en consecuencia,
contribuye a mejorar en la efectividad, seguridad y calidad de la atención médica que
constituye el objetivo central y la razón de ser de los servicios de salud.

Por lo tanto, la motivación de este trabajo de investigación, se centra en conocer

estudios de tratamiento basado en el cultivo de queratinocitos en pacientes con injurias
de la piel, a partir de los hallazgos obtenidos en publicaciones y revisiones científicas de
otros autores, pues se parte de la experiencia en las terapias clínicas, previamente
desarrolladas y que han demostrado grandes ventajas sobre otros modelos de piel
artificial previamente descritos por otros investigadores.

Teóricamente, constituye un aporte en suministrar información sistematizada, con la

optimización en el manejo del gran quemado, mediante las recomendaciones basadas en
la mejor evidencia científica disponible que puede ser utilizada, como antecedentes o
referentes en investigaciones posteriores y también, en los profesionales en el campo de
la medicina para intervenir oportunamente y mitigar las complicaciones asociadas a
estos eventos, de manera eficaz, previniendo complicaciones y garantizando que el
cuidado sea acorde a lo establecido por los expertos en el tema de injurias de piel.

Metodológicamente, se expone la estrategia que permite llevar a cabo el estudio

propuesto, dado que en él se describe el tipo, diseño de investigación, criterios de
búsqueda, las fuentes de información, criterios de inclusión y el procedimiento de datos,
bajo un enfoque cualitativo, aspectos que pueden servir de base para estudios similares
al presente.

17
 CAPITULO II

MARCO TEORICO

En este capítulo del trabajo se consideró los diversos elementos que conforman el
fundamento teórico del mismo. En primer lugar se describen los antecedentes de la
investigación, organizados retrospectivamente de acuerdo con el año de publicación y la
relación con el tema en cuestión, y en segundo lugar se exponen las bases teóricas
establecidas por definiciones específicas que nutren el presente trabajo.

2.1.- Antecedentes de la Investigación

Mark A. Seeger and Amy S. Paller en el 2015, realizaron en el Departamento de

Dermatología de la Escuela de Medicina de la Northwestern University en Chicago
Illinois, el estudio denominado: El Rol de los Factores de Crecimiento en la Migracion
de los Queratinocitos, que consistió en revisar la literatura que ha sido publicada en
relación al papel de los factores de crecimiento en la motilidad de los queratinocitos
tanto in vivo como in vitro, en donde se afirma sobre los múltiples efectos que los
factores de crecimiento ejercen sobre los queratinocitos (KC), especialmente en la
proliferación y migración de estos en el medio complejo de moléculas que se
encuentran en el sitio de la lesión. Asimismo hablan de terapias con factores de
crecimiento que estimulan la migración de KC., como: factor de crecimiento epidérmico
(EGF), factor estimulante de colonias de macrófagos, y factor de crecimiento de
fibroblastos 2 (FGF-2), que se han desarrollado para el tratamiento de heridas agudas y
crónicas, sin que ninguna esté actualmente en uso en clínica. Por otra parte es
importante subrayar que los autores en la revisión sistemática, encontraron que el
proceso de migración de KC., es coordinado por la integración de un conjunto diverso
de señales de crecimiento, que son: autocrina, paracrina o hematológica de origen
(TGF-a, HB-EGF, IGF-1, FGF-7, FGF-10, y HGF), factores de crecimiento que parecen
tener el efecto motogénica directa más fuerte en KC., en los sistemas experimentales.10

18
González Alaña, I., Aguilar Barrón, P., Torrero López J.V., Ferreiro González, I. y
Gabilondo Zubizarreta, F.J. realizaron un estudio en el año 2012, titulado: Cobertura de
Grandes Quemados con Cultivo de Queratinocitos: casuística de nuestra unidad y
Protocolo de Tratamiento, en el Servicio de Cirugía Plástica del Hospital Universitario
de Cruces, Baracaldo, Vizcaya, España, cuyo objetivo principal consistió en mostrar el
protocolo de aplicación del procedimiento para la cobertura de quemados extensos, los
criterios de inclusión y la terapéutica pre y post aplicación de las láminas de
queratinocitos en esta unidad de servicio. Así como también, las características de los
pacientes tratados y la experiencia acumulada en 14 pacientes en la aplicación de esta
técnica. Los autores, concluyeron que, el cultivo de los queratinocitos, a pesar de todos
sus inconvenientes (complejidad y precio), se ha convertido en una poderosa arma en el
tratamiento del paciente extensamente quemado, compensando la carestía del producto
con la supervivencia del paciente. 9

Otro estudio en este campo del conocimiento que es importante citar corresponde al
realizado en el año 2012 por Isaac Cesar; Francinni M. P. Regov; Pedro Ribeiro Soares
Ladeir ; Silvana C. Altram ; Renata C. Oliveira ; Johnny C. L. B. Aldunate V. et al., en
el Laboratorio de Investigación de Células y Cultura de la herida Curación (LIM 04) del
Departamento de Hospital Clínico de Cirugía Plástica de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Sao Paulo, denominado: Construção de substituto da pele composto
por matriz de colágeno porcino povoada por fibroblastos dérmicos e queratinócitos
humanos: avaliação histológica. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el
comportamiento histológico de los queratinocitos y fibroblastos humanos cultivados en
una matriz de colágeno derivado de porcino submucosa del intestino delgado. El
método empleado se basó en la utilización de células de la epidermis y dermis humana
que cultivaron por separado y sembradas en la matriz de colágeno porcino en un
ambiente controlado durante 21 días antes de ser sometido a análisis histológico. Con
base en los resultados, los autores exponen que los fibroblastos invaden y colonizan la
matriz de colágeno, mientras que los queratinocitos se organizan de forma laminar y
laminada sobre la superficie en la que fueron sembrados y concluyen que es posible la
utilización de la matriz de colágeno de porcino, como transportador de células de la piel
humana y la organización de esas células se asemeja a la arquitectura de la piel
humana.11

19
César isaaci; André Oliveira Paggiaro; Johnny Leandro Conduta Borda Aldunate;
Marisa Roma Herson; Silvana Cereijido Altran; Mónica Beatriz Mathor et al. realizaron
un estudio en el año 2011, en el Departamento de Cirugía Plástica del Hospital de
Clínicas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Sao Paulo (HCFMUSP)
Brasil, titulado: Papel hacer queratinócito na contração da ferida: avaliação de
Impacto Usando um Modelo de Matriz de Colágeno por Fibroblastos Povoada, para
evaluar el impacto de los queratinocitos en la contracción de la herida, cuyo método
consistió en emplear como grupo de estudio, geles de colágeno de ratón por los
fibroblastos humanos sembrados con queratinocitos humanos en la superficie para
formar un equivalente dermo-epidérmico y, como grupo de control, geles de colágeno
sembrados sólo por fibroblastos. Los criterios para la preparación y almacenamiento de
geles fueron similares para ambos grupos y los resultados demostraron un aumento
evidente y estadísticamente significativo en la contracción de la herida en muestras de
población por los queratinocitos en comparación con el grupo control. Según las
conclusiones, los autores afirman que los queratinocitos no sólo modulan la
proliferación de fibroblastos, pero también juegan un papel activo en la contracción de
la herida en sí. 2

En Venezuela, en el Centro de Biociencias, Fundación Instituto de Estudios Avanzados,

Hoyo de la Puerta. Valle de Sartenejas. Baruta, Miranda y en
el Instituto de Biología Experimental, Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de
Tumores, Caracas, se realizó el trabajo: Estudio Preliminar del Tratamiento de Ulceras
Crónicas con Equivalentes Cutáneos Obtenidos por Ingeniería de Tejidos, por
Francisco Antonio Arvelo Álvarez, Carlos Cotte , Pedro Pérez , Felipe Sojo, cuyo
objetivo fue obtener un sustituto de piel para su aplicación en la clínica. El método
empleado consistió en aislar y cultivar queratinocitos, sembrados a una alta densidad, en
un sustrato optimizado de fibrina con fibroblastos. Se seleccionaron seis (6) pacientes
con ulceras crónicas, sin curación mediante tratamiento previo, a quienes se les
aplicaron los nuevos equivalentes. Los resultados de la terapia demostraron que el uso
de los equivalentes fue viable, efectivo, de fácil manipulación y de rápida acción sobre
los tejidos afectados y además el nuevo equivalente cutáneo probó ser más práctico y
de bajo costo, trasplante directo y de fácil aplicación. 3

La Unidad de Quemados del Hospital Universitario de Cruces en Baracaldo (Vizcaya),

España, inició la aplicación del cultivo de queratinocitos en el año 2001, con un primer
20
caso de cobertura de una gran pérdida de sustancia cutánea tras la resección de un nevus
congénito gigante en un niño. En aquella ocasión, los queratinocitos fueron
suministrados por un banco de tejidos extranjero y el prendimiento fue prácticamente
nulo. Analizando posteriormente el método utilizado, dedujimos que se había debido a
un fallo en el transporte del equivalente cutáneo ya que éste llegó desprendido de los
tules.9

En aquella ocasión, los queratinocitos fueron suministrados por un banco de tejidos

extranjero y la captación fue prácticamente nula. Analizando posteriormente el método
utilizado, dedujeron que se había debido a un fallo en el transporte del equivalente
cutáneo ya que éste llegó desprendido de los tules. A partir de ese momento, se pusieron
en contacto con el Centro Comunitario de Sangre y Tejidos de Asturias, en Oviedo,
España, geográficamente más cercano a su hospital, e iniciaron un protocolo que
mantienen en la actualidad con buenos resultados.9

En 1983, Karasek MA, mejoró el cultivo de queratinocitos aislados mediante tripsina y

se llevó a cabo cuando pudieron cultivar estas células sobre geles de colágeno. Este
hecho aumentó considerablemente el pool de queratinocitos con capacidad proliferativa,
los cuales fueron entonces capaces de alcanzar la confluencia y pudieron ser
subcultivados entre dos y tres veces. Estos resultados fueron modestos, pero dieron
lugar a la idea de que son necesarios determinados elementos dérmicos para el
desarrollo de los cultivos epiteliales.12

Freeman AE at al en 1976, utilizaron piel de cerdo como soporte para obtener epidermis
transplantable, bajo la asunción de que la matriz dérmica es la responsable del
prendimiento permanente de la lámina epitelial. 12

Rheinwald y col. en 1975, trabajando con una línea celular epitelial cutánea de
queratinocitos originada de un teratoma de ratón, establecieron las condiciones
necesarias y fundamentales para cultivar, de forma indefinida, este tipo de células. En el
mismo año, estos autores aplicaron sus técnicas a los queratinocitos humanos normales,
obteniéndose cultivos que podían ser transferidos seriadamente. Ellos demostraron que
las deficiencias encontradas para el cultivo de las células epiteliales no se debían a
limitaciones intrínsecas de ellas, sino a las complejas relaciones con las células del
parénquima. Por tanto, fue posible obtener en cultivo, un tejido epitelial diferenciado, si
se empleaba la técnica apropiada que no obviara tal relación.1
21
En 1952 Billinghan y Reynolds fueron capaces de demostrar que los queratinocitos
aislados con tripsina, mantenían su viabilidad y podían ser utilizados para cultivo
celular. La diferenciación de los queratinocitos, la cual puede verse por la
poliestratificación de los mismos y mediante de la aparición de marcadores de
diferenciación epidérmica, hace que sea imposible multiplicar la población celular
mediante sucesivos pases. 12

2.2.- BASES TEÓRICAS

En la construcción de las bases teóricas se tomó en consideración los conceptos

relacionados directamente con el estudio en cuestión, por lo que se consideró en primer
lugar los conceptos básicos histológicos de la piel, haciendo énfasis en los
queratinocitos como células importantes en la construcción de los cultivos, destacando
sus funciones y las diferentes técnicas de producción de queratinocitos.

2.2.1.- HISTOLOGÍA DE LA PIEL

La piel normal está constituida por tres zonas: epidermis, dermis e hipodermis

Epidermis

Es la parte más superficial y se encuentra constituida por dos grupos de células:

queratinocitos o células no dendríticas y células dendríticas. Se hará una descripción
exhaustiva de esta capa, haciendo énfasis en los queratinocitos, los cuales constituyen
la mayor parte de las células que forman la epidermis y en humanos representan del 95
% de las células epidérmicas, de origen ectodérmico, formando un epitelio estratificado
plano queratinizado. Son células que prácticamente no liberan matriz extracelular por lo
que las membranas celulares de queratinocitos adyacentes suelen estar muy próximas.
13,14

Este acercamiento se ve favorecido por los numerosos complejos de unión tipo

desmosoma que existen entre queratinocitos, lo que permite mantener la cohesión y la
integridad de la epidermis. La principal familia de proteínas que sintetizan los
queratinocitos son las queratinas, un tipo de filamento intermedio del citoesqueleto. Esta
familia está formada por al menos 20 genes que se expresan según el estado de
diferenciación del queratinocito. 13,14

22
Los queratinocitos a su vez se organizan en capas o estratos, que de la más superficial
hacia adentro son: capa córnea, capa lúcida, capa granulosa, capa espinosa y capa
basal13,14

La capa córnea está formada por células que no tienen núcleo, por lo que con los
colorantes de rutina (hematoxilina y eosina) se tiñe únicamente por la eosina. Su grosor
varía de acuerdo al sitio anatómico, en las zonas como palmas y plantas es mayor.13,14

El estrato lúcido es una línea intensamente eosinófila ubicadapor debajo de la capa

córnea y se le identifica en los sitios donde ésta es gruesa (palmas y plantas).13,14

La capa o estrato granuloso está formado por células romboidales que tienen gránulos
de queratohialina, mismos que le dan su nombre y que se tiñen intensamente con la
hematoxilina. Su grosor depende del de la capa córnea.13,14

El estrato espinoso, escamoso o Malpighiano, lo constituyen células poligonales que

poseen puentes intercelulares, estructuras que sirven como medio de unión entre ellas y
a la vez con las capas adyacentes. El número de estas células también varía dependiendo
de la región corporal de que se trate, en general es de cinco a siete hileras. Se tiñen
pálidamente con la hematoxilina.13,14

La capa basal, germinal o germinativa, está formada por células cilíndricas que se
disponen generalmente en una hilera, se tiñen intensamente con la hematoxilina, tienen
puentes intercelulares que son menos evidentes que los de la capa espinosa. En el
estrato basal se encuentra la melanina, pigmento normal de la piel, cuya cantidad varía
de acuerdo al tipo de piel de cada individuo.13,14 (Ver figura 1.)

23
 Figura 1.- Epidermis de distinto grosor de piel de rata. A) piel gruesa de planta del
pie, B) piel grueso de palma de mano, D) piel del grosor medio de la mano, C y E)
piel fina del labio. Tomado de Atlas de histología vegetal y animal. Tipos
celulares. Queratinocito. 2015.

Los queratinocitos tienen estructuras de unión denominadas puentes intercelulares, que

a la microscopía electrónica corresponden al llamado complejo desmosoma-
tonofilamento. Por otro lado, la cohesión de las células epidérmicas se debe a la
presencia de una sustancia de cemento intercelular (glucocalix) constituida por
glucoproteínas.13,14

El segundo tipo celular de la epidermis, no menos importante son las células

dendríticas, tales como: meloncitos, células de langerhans y células indeterminadas.13,14

Los melanocitos, llamados también células claras o células de Masson, son las únicas
que se pueden distinguir fácilmente en la microscopía de luz y con tinciones de rutina, a
diferencia de las células de Langerhans y células indeterminadas que requieren de
histoquímica y microscopía electrónica. Se observan a nivel de la capa basal como
células de citoplasma claro y núcleo pequeño y oscuro. Se encuentran intercalados entre
las células basales en una relación aproximada de un melanocito a diez células basales.
Las proyecciones dendríticas de los melanocitos permiten el paso de melanina a los
queratinocitos basales. La tinción especial con nitrato de plata (Fontana-Masson)
permite observar más fácilmente a los melanocitos con sus proyecciones dendríticas ya
que la melanina es argirófila y argentafin.13,14

Las células de Langerhans se originan en la médula ósea y se localizan en la piel y otros

sitios como la mucosa oral, vagina, ganglios linfáticos y timo. En la piel, se ubican en
las zonas suprabasales de la epidermis y ocasionalmente en la dermis. Se observan con
técnicas de histoquímica a base de adenosintrifosfatasao aminopeptidasa. También con
el anticuerpo monoclonal OKT6 marcado con peroxidasa o fluoresceína. Al
microscopio electrónico, las células de Langerhans presentan un núcleo plegado y un
citoplasma donde destaca un organoide llamado gránulo de Langerhans o de Birbeck,
que representa invaginación de la membrana celular. La concentración de las células de
Langerhans en la epidermis es semejante a la de los melanocitos: entre 460 y
1000/mm2, lo que constituye del 2 al 4% de la población epidérmica total. Una de las
funciones principales de las células de Langerhans es la presentación de antígenos,
24
expresan inmunoglobulina A (IgA) y antígeno leucocitario humano DR (HLADR)
asociados a respuestas inmunes, receptores FC y C3, antígenoT6, antígeno leucocitario
común, proteína S-100 y filamentos de tipo actina y vimentina.13,14

La zona de la unión dermoepidérmica comprende: membrana plasmática de las células

basales, lámina lúcida y lámina densa, que se describen a continuación:

• Membrana plasmática de las células basales, donde se encuentran hemidesmosomas

con placas de anclaje para fijar tonofilamentos
• Lámina lúcida, la cual es una zona transparente constituida por filamentos de anclaje,
mide de 20-40 nm de espesor, contiene laminina, fibronectina y antígeno del penfigoide
ampollar
• Lámina densa, mide de 30 a 60 nm y contiene colágeno de tipo IV y antígeno KF-1,
no colágeno
• Zona densa sublaminar, formada por microfibrillas elásticas, fibrillas de anclaje y
antígeno de la epidermólisis bullosa adquirida.
• Zona basal subepidérmica, mide 0.5-1 micra de espesor y es rica en
mucopolisacáridos neutros.13,14

2.2.2.- MORFOLOGIA DE LOS QUERATINOCITOS

La morfología de los queratinocitos no es constante a lo largo de su vida, que en

humanos es de aproximadamente un mes. Esto es debido a que desde que nacen hasta
que mueren siguen un viaje durante el cual se diferencian y cambian sus características
moleculares y su función. Ese proceso ocurre progresivamente desde la parte basal de la
epidermis, donde nacen, hasta la parte más superficial, donde mueren y terminan por
desprenderse. Las diferencias morfológicas que ocurren en este proceso se manifiestan
en forma de capas o estratos, los cuales agrupan a los queratinocitos que se encuentran
en estado de diferenciación similar. Los estratos, desde la parte más interna a la más
superficial, son: basal, espinoso, granuloso y córneo. El grosor de estos estratos, excepto
el basal que es constante, depende de la región del cuerpo y puede variar desde unos 50
µm de grosor en las zonas de poco rozamiento hasta más de 1 mm en las zonas como la
planta de los pies o palma de las manos, donde el rozamiento es alto.15

25
Estrato basal o germinativo

El estrato basal o germinativo es una capa que se encuentra en la parte más interna de la
epidermis, la que está en contacto con la lámina basal. La lámina basal es una capa de
matriz extracelular que separa los epitelios del tejido conectivo subyacente. Los
queratinocitos se unen a la lámina basal mediante hemidesmosomas, lo que permite la
estabilidad del epitelio. Entre los queratinocitos del estrato basal hay otra célula de la
epidermis como son las células de Merkel y los melanocitos.15

En el estrato basal se encuentran las células troncales de tejido (células madre adultas),
las cuales son células indiferenciadas que pueden dividirse por mitosis para a) dar dos
células troncales, b) diferenciarse y dar una célula progenitora de queratinocitos y una
célula troncal, c) producir dos células progenitoras de queratinocitos. Las células
troncales tienen una forma de redondeada a cilíndrica con un tamaño de unos 6 a 10 µm.
Son más basófilas que el resto de las células epidérmicas debido a su alto contenido en
ribosomas. Poseen numerosos filamentos intermedios y melanosomas, orgánulos con
melanina, en torno al núcleo.15

Las células progenitoras recién generadas podrán aún dividirse algunas veces más y
luego diferenciarse todas a queratinocitos, por lo que surgen numerosas células
epidérmicas a partir de una sola célula troncal. También hay células troncales en el
folículo piloso que pueden dar, además de queratinocitos, células del folículo piloso o
células sebáceas, mientras que las que se encuentran en el estrato basal de la epidermis,
sólo darán queratinocitos.15

La tasa de proliferación y diferenciación de las células troncales varía en función de las

necesidades de reemplazo de la epidermis y depende de otras circunstancias como
heridas, rozamientos, entre otras. Suele haber una célula troncal por cada 35000
queratinocitos. Las figuras mitóticas que se observan en el estrato basal de la epidermis
son mayormente debidas a la actividad de las células progenitoras, puesto que las
células troncales se dividen poco en condiciones normales.15

Estrato espinoso

Inmediatamente superficial al estrato basal está el estrato espinoso. Este estrato está
formado por queratinocitos con aspecto más o menos poliédrico y de unos 10 a 15 µm,

26
más grandes que los del estrato basal, con un citoplasma más eosinófilo y con uno o dos
nucléolos muy patentes. En el citoplasma se pueden observar numerosos haces de
filamentos de queratina, denominados tonofilamentos que se ensamblan en filamentos
visibles al microscopio óptico denominados tonofibrillas, los cuales ayudan a la
eosinofilia del citoplasma.15

En este estrato las células se llaman espinosas porque poseen desmosomas que se
disponen de manera radial, estableciendo contactos entre células contiguas. Estos
contactos se asemejan a espinas cuando se observan al microscopio y los diferentes
desmosomas de una célula están conectados mediante las tonofibrillas. Después de que
una célula del estrato basal pierde el contacto con la membrana basal comienza el
proceso de diferenciación y migración hacia la superficie de la epidermis.15

El estrato espinoso es el más ancho en las zonas sometidas a rozamientos, lo que

favorece la resistencia de la epidermis puesto que los queratinocitos de este estrato están
fuertemente cohesionados mediante complejos de unión.15

Estrato granuloso

En las capas más superficiales del estrato espinoso los queratinocitos cambian su
expresión génica y empiezan a sintetizar gránulos de queratohialina. Éste es un estrato
relativamente delgado, de unos 15 µm, y con queratinocitos muy aplanados con
numerosos gránulos de queratohialina. Estos gránulos tienen forma poligonal, no están
rodeados de membrana, son altamente basófilos y están constituidos por proteínas como
la filagrina y tricohialina, las cuales estimulan la aglomeración de los tonofilamentos.
Esta agrupación de los filamentos intermedios va aumentando y marca el inicio de la
cornificación o queratinización.15

También en el estrato granuloso se observan los cuerpos lamelares (cuerpos de Odlan,

queratinosomas o gránulos rodeados de membrana). Estos cuerpos no están en la capa
germinal y empiezan a aparecer en el estrato espinoso de forma progresiva, alcanzando
su máximo desarrollo en el estrato granuloso. Son orgánulos formados por pilas de
láminas de lípidos, de 100 a 300 nm con una estructura interna lamelar. Estos orgánulos
se fusionan con la membrana plasmática y su contenido se libera al espacio extracelular.
Su función la realizan en el estrato córneo y están relacionados con los procesos de
descamación y con la formación de la capa de impermeabilidad.15

27
Otra estructura típica de estos queratinocitos es la envuelta. Estas células sufren la
degradación de su núcleo y orgánulos, mientras su citoplasma está prácticamente lleno
de queratina. Durante las últimas etapas de la diferenciación celular se produce un
aumento de la permeabilidad al calcio y a otros iones, el cual dispara la activación de las
transglutaminasas, ayudadas por la proteína involucrina y loricrina, que provocan la
formación de una estructura proteica bajo la membrana plasmática denominada
envuelta. Esta estructura va creciendo en grosor a medida que el queratinocito degenera
y es importante para organizar los filamentos de queratina paralelos a la superficie de la
epidermis, que se van produciendo en el interior del queratinocito, y para enlazar dichos
filamentos a los acúmulos lipídicos extracelulares de los cuerpos lamelares. Los
queratinocitos de la capa granular mueren finalmente por apoptosis y se convierten en la
célula cornificada anuclear.15

Estrato lúcido

Es una capa de transición entre el estrato granuloso y el córneo. Se encuentra en las

zonas donde hay un mayor rozamiento, como la planta de los pies.15

Estrato córneo

Está formado por los queratinocitos degenerados que algunos autores los denominan
corneocitos. Su grosor depende del espesor general de la epidermis, cuantos más
queratinocitos se produzcan, más grueso será el estrato córneo. La muerte de las células
del estrato granuloso provoca la pérdida progresiva de desmosomas, lo que provoca
descamación. Los lípidos de los cuerpos lamelares liberados en el estrato granuloso van
modificándose extracelularmente y en el estrato córneo están formados por un 50% de
ceramidas, el 25 % son colesterol y el resto ácidos grasos libres y algunas enzimas
antimicrobianas. Hay muy pocos fosfolípidos, en comparación con otros tejidos.15

Es esta capa la que protege frente a la desecación, patógenos y daños físicos y químicos.
En el procesamiento extracelular de lípidos, los cuerpos lamelares son importantes para
la epidermis. Por ejemplo, el glicerol que se forma a partir de los lípidos es un agente
hidratante. Los ácidos grasos libres contribuyen a la acidificación de este estrato, en
humanos es próximo a 5. Este valor es importante porque regula la actividad de diversas
enzimas que se localizan en este estrato. Por último, la conversión de colesterol sulfato a

28
colesterol es importante para regular el proceso de descamación. Estos lípidos
secretados se organizan formando una serie de estratos continuos que hacen posible la
impermeabilidad.15 (Ver figura 2)

Figura 2.- Esquema donde se muestra el proceso de maduración de los queratinocitos,

desde el estrato germinativo hasta el estrato corneo. Tomado de Atlas de histología vegetal y
animal. Tipos celulares. Queratinocito. 2015.

2.2.3.- FUNCIONES DE LOS QUERATINOCITOS

Los queratinocitos cumplen con varias funciones, la más conocida es producir

queratina, pero además sintetizan otras sustancias químicas, como: alfa interferón,
prostaglandinas, factores estimulantes de colonias granulocíticas-monocíticas, factor
activador de los timocitos derivado de las células epidérmicas (ETAF). 15,16

Otra función importante de los queratinocitos está determinada por la reparación de

heridas, en las cuales los queratinocitos pasan de un estado sedentario a uno donde se
desplazan. Esto parece estar mediado por su desconexión de la membrana basal y por la
29
recepción de citoquinas liberadas por otras células, mediado por los hemidesmosomas,
por los cambios en la expresión de integrinas. Esto permite a los queratinocitos
desplazarse por la superficie de la zona dañada y sellarla. La activación de citoquinas
provoca la migración de queratinocitos en la fase proliferativa, que lleva al cierre y la
restauración de una red vascular. Los queratinocitos también pueden ser activados por
agonistas opioides muscarínicos del receptor, pero el papel de estos agonistas en la
inflamación y el cierre de la herida sigue siendo poco clara.4,16

También es importante resaltar que los queratinocitos cumplen con la función de barrera
entre el medio externo y el interno del organismo. Protege al organismo frente a daños
mecánicos, luz ultravioleta, sustancias químicas y abrasiones. Es muy importante el
papel de la epidermis a la hora de evitar la desecación y frente a patógenos. Entre las
barreras se puede citar:

a).- Barrera frente a desecación

Esta función reside sobre todo en el estrato córneo. Se hace la similitud de que al igual
que una pared hecha de ladrillos y mortero protege, también lo hace este estrato hecho
de queratinocitos (ladrillos) y lípidos extracelulares (mortero).15

b).- Barrera frente a patógenos

La epidermis es la primera barrera que los patógenos tienen que salvar antes de poder
entrar en el organismo. Pero además los queratinocitos liberan citocinas inhibidoras que
neutralizan patógenos y, cuando hay daños, favorecen la inflamación y activan las
células de Langerhans, las cuales son células de la epidermis presentadoras de
antígenos.13,15

c).- Función en la pigmentación de la piel.

Los queratinocitos cumplen un papel importante en la pigmentación de la piel, ya que

tiene como misión proteger frente a los rayos ultravioleta. La pigmentación depende de
la producción de melanina por parte de los melanocitos. Estos se distribuyen de manera
dispersa por la epidermis y la melanina que producen, la incluyen en unos orgánulos
denominados melanosomas. Estos orgánulos se distribuyen por su citoplasma y por las
30
prolongaciones citoplasmáticas que emiten entre los queratinocitos. El color final de la
piel depende sobre todo de la producción de melanosomas y de su distribución. Un
color homogéneo y más oscuro se debe a que los melanosomas son exocitados y
captados por los queranitocitos próximos a los melanosomas. Se estima que cada
melanocito surte de melanosomas a un promedio de unos 45 queratinocitos. Una vez
capatados los melanosomas, los queratinocitos se desplazan hacia las capas superiores
donde la melanina se irá acumulando, incluso en la capa del estrato córneo. Así, la
pigmentación de la piel depende de la cantidad de melanosomas que contengan los
melanocitos y también los queratinocitos.15

2.2.4.- TECNICAS DE CULTIVO DE QUERATINOCITOS)

La técnica de Rheinwald y col., ha sido modificada por los investigadores en este campo
del conocimiento a lo largo de la historia, ya que la experiencia en la utilización clínica
de las láminas de queratinocitos humanos, ha puesto de manifiesto sus principales
limitaciones. La primera de ellas es que la lámina de tejido que se obtiene es demasiado
fina y frágil, lo que dificulta su manejo y da lugar a pérdidas de superficie tanto en la
preparación de la lámina para el trasplante, como en el transporte a quirófano e
implante de la misma, ya que inicialmente se pierde entre un 20 a 25 % de la superficie
sembrada al fijar la lámina sobre un soporte sólido. Para evitar la fragilidad de las
láminas, la ausencia del componente dérmico y mejorar los primeros resultados
obtenidos mediante el cultivo de queratinocitos, se han seguido tres vías diferentes:12

1. Empleo del cultivo de queratinocitos, asociado a trasplante previo de un

componente dérmico, por ejemplo aloinjertos de cadáver o imitadores dérmicos.
2. Cultivar los queratinocitos sobre un soporte.
3. Cultivar los queratinocitos sobre una dermis artificial o equivalente dérmico.
En este sentido, es importante desglosar los diferentes tipos de cultivo de
queratinocitos.

2.2.4.1.- Cultivo clásico de queratinocitos

31
Esta técnica corresponde a la implementada por Rheinwald y col., donde introdujeron
en su cultivo una capa celular llamada feederlayer, para que estimule la proliferación y
maduración de los queratinocitos. Los pasos consisten en:
1. Toma de biopsia en condiciones de esterilidad. Se introduce en medio de
cultivo a 40C y se envía rápidamente a laboratorio.
2. Se elimina el tejido celular subcutáneo y se fragmenta la biopsia, una vez
recibida la muestra.
3. Los fragmentos resultantes se digieren enzimáticamente con tripsina/EDTA
(ácido etilendiaminotetracético) (T/E)
4. Las células aisladas mediante T/E se cultivan junto a línea celular de
fibroblastos de ratón 3T3 (línea alimentadora, células de ratón albino suizo)
irradiada con 6000 rads o tratadas con Mitomicin C durante 2 horas, ello con el
fin de inhibir su multiplicación. Este tratamiento previo con los fibroblastos
permite que se adquieran las siguientes características: promueven el
crecimiento, diferenciación y adhesión de los queratinocitos; secretan proteínas
de matriz extracelular y factores de crecimiento e inhiben la proliferación de los
fibroblastos humanos. (ing de tejido)
5. Entre 1% a 3% de los queratinocitos formarán pequeñas colonias y por
crecimiento excéntrico llenarán poco a poco la superficie del frasco de cultivo
desplazando a los 3T3.
6. Aproximadamente a los 9 días del inicio del cultivo primario, los queratinocitos
son tratados con T/E (enzima proteolítica que rompe las uniones proteicas que
existen entre la célula y la superficie del frasco, individualizándolos).
7. Los queratinocitos son sembrados de nuevo en presencia de nuevas células 3T3.
8. A partir de un solo frasco de cultivo primario, se pueden sembrar de 20 a 30
frascos de cultivo secundario, que alcanzarán la confluencia en 10 a 11 días.
9. Después de 21 a 24 días del inicio del proceso, se puede obtener una gran
superficie de piel cultivada, que puede alcanzar 10.000 cm 2 a partir de 1 cm 2 en
un período de 3 a 4 semanas.
10. Cuando es confluente el cultivo secundario, se despega del fondo del frasco,
utilizando para ello dispasa II (enzima proteolítica que rompe las uniones entre
las células y el soporte plástico, sin romper las uniones intercelulares).

32
 11. La lámina de queratinocitos para ser transportada, debe ser fijada a un soporte
sólido (gasa).12 (Ver esquema 1).

Esquema1.Tomado de Nuñez E. Obtención de un modelo dermoepidérmico autólogo artificial.

2.2.4.2.- Cultivo primario de células a partir de biopsias de piel.

El desarrollo de esta técnica para obtener el máximo número de células recogidas en

mejores condiciones, requiere de una serie de pasos que se describen a continuación:

1. Asepsia y antisepsia de la piel.

2. Toma de muestra de fragmento de piel entre 1 y 8 cm 2 , que contenga epidermis,
dermis y tejido celular subcutáneo.
3. Limpiar la muestra con suero fisiológico para eliminar todo resto de antiséptico
que pudiera interferir en el resultado o tener un medio de cultivo estéril con
MEM (minimal essential Medium), D-MEM ( Dulbeccos minimal essential
Medium). Medio de cultivo modificado por Dulbeccos
4. El medio de cultivo debe tener agregados antibióticos y antimicóticos
(penicilina, estreptomicina +/- anfotericina B), a dosis estándar de 100 U/ml de
penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina.

33
5. La biopsia debe ser trasladada en el menor tiempo posible al laboratorio a una
temperatura de 4oC, conservando cadena de frío en un recipiente estéril
herméticamente cerrado, envuelta en gasas.
6. Recibida la biopsia, se retira del medio de transporte, se introduce en alcohol
estéril al 70 % entre 2 a 3 segundos, posteriormente se coloca sobre una placa
de Petri y se procede a lavar la muestra con T/E.
7. Se debe eliminar el tejido graso subcutáneo, para dejar expuesta la capa de
dermis y epidermis. Se procede a lavar nuevamente la biopsia con T/E y se pasa
a una nueva placa de Petri. Se cubre con T/E y se cortan pequeños fragmentos de
piel.
8. Con la ayuda de una pipeta, previamente empapada de T/E, se pasa la piel a un
frasco esterilizado con agitador magnético.
9. Se añaden unos 25 a 50 ml de T/E al frasco y se incuba a 37 oC, en agitación
constante durante 30 minutos.
10. Se agita la piel con ayuda de una pipeta empapada en T/E y se dejan decantar los
fragmentos.
11. Se recoge la tripsina y se pasa un tubo cónico de 50 ml.
12. Se añade T/E fresca al frasco agitador que contiene todos los fragmentos de piel
y la muestra se incuba nuevamente durante 30 minutos a 37oC.
13. La T/E recogida se neutraliza con igual cantidad de medio de cultivo de
queratinocitos sin EGF (factor de crecimiento epidérmico) y se centrifuga
durante 10 minutos a 1.400 revoluciones por minuto.
14. El material comprimido que se obtiene, se disuelve en 2-3 ml de medio de
queratinocitosy se cuentan las células obtenidas en cada incubación.
15. El procedimiento de recolección de T/E se repite hasta que no se obtengan más
células de la biopsia, y una vez que ocurra esto, la tripsina se retira
completamente y los restos de la biopsia se introducen en solución de colagenasa
tipo I a 2 mg/ml disueltos en DMEM (aproximadamente 20-25 ml de solución).
16. La solución con colagenasa se agita a 37oC, entre 6 y 12 horas hasta completar
la disolución de los restos.
17. Al finalizar la incubación, la colagenasa se somete a un filtro de células de 60
micras, se centrifuga y se retira el sobrenadante.

34
 18. La muestra se resuspende en 2-3 ml de medio de cultivo para fibroblastos y se
cuentan las células obtenidas.

2.2.4.3 Cultivo primario y congelación de queratinocitos.

1. El cultivo de queratinocitos se siembra en un frasco de 75 cm 2 de superficie por

cada 2 x 106 células obtenidas tras la digestión con la biopsia con T/E, en
presencia de 8 x 106 células 3T3 irradiadas.
2. Como medio de cultivo se utiliza DMEM y Ham-F 12 (medio de cultivo
Biocrom AG), en una proporción 3:1, suplementado con 10 % de suero bovino
fetal, insulina (5 mcg/ml), hidrocortisona (0.4 mcg/ml), triiodotironina (1.3
ng/ml), adenina (24 µg/ml).
3. El medio se cambia cada tres días y al final del primer cambio se le añade el
EGF (factor de crecimiento epidérmico) a 10 ng/dl.
4. Los queratinocitos deben ser tratados por media hora aproximadamente, con
T/E, para despegarlos de la superficie del frasco de cultivo.
5. Al estar confluentes los cultivos se procede a congelar las células.
6. Se debe neutralizar la tripsina con igual cantidad de medio de cultivo
suplementado de SBF (suero bovino fetal) y se centrifugan a 1.400 r.p.m durante
10 minutos.
7. Las células se mantienen sobre hielo y se resuspenden en medio de congelación
para queratinocitos (10 % de glicerol, 15 % SBF y 75% D-MEM).
8. Se mantienen a 60oC durante 24 horas, para luego ser pasado a un tanque de
nitrógeno líquido.
9. Los queratinocitos son congelados a una densidad de 1/10, por lo que un frasco
de cultivo celular de 75 cm2 permite producir 10 crioviales para congelar. Cada
uno de estos crioviales permite sembrar un frasco de cultivo de 75 cm2 .

2.2.4.4.- Cultivo primario y congelación de fibroblastos.

En esta técnica se parte de las células obtenidas tras el procesamiento de la biopsia con
colagenasa.12

35
1. En un frasco de cultivo celular de 75 cm2 con 3T3 irradiados, se utiliza como
medio de cultivo DMEM suplementado con 10 % de SBF.
2. Las células se siembran en una concentración aproximada de 100.000
células/cm2 .
3. Las células cultivadas deben mantenerse en una incubadora a 37 oC con un 5%
de CO2.
4. Una vez que se tienen abundantes células de aspecto fibroblástico, el frasco se
lava dos veces con T/E y se incuba entre 2 y 5 minutos con T/E a 37oC.
5. Se recogen las células obtenidas y se neutralizan agregando cantidades
equivalentes de medio de cultivo y de T/E.
6. Se procede a centrifugar por 10 minutos a 1.400 r.p.m y se siembran las células
en una superficie 2 y 3 veces mayor a la inicial.
7. Al tener el número suficiente de fibroblastos para el trasplante, éstos son
nuevamente tripsinizados, se cuentan y se resuspenden en 10 ml del mismo
medio hasta su utilización.
8. El método de congelación es similar al de queratinocitos pero en proporciones
de 10 % de DMSO, 10 % de SBF y 80 % de D-MEM, utilizando dos crioviales
por cada frasco de 75 cm2 confluentes. (Ver esquema 2)

36
 Esquema 2. Tomado de Nuñez E. Obtención de un modelo dermoepidérmico autólogo
artificial

4.5.- Preparación de piel artificial basada en plasma humano.

El plasma fresco se obtiene a partir del fraccionamiento primario de sangre completa de

donantes del Banco de Sangre correspondiente, según normas y recomendaciones de la
Asociación Americana de Bancos de Sangre.12

1. Se prepara gel de plasma para un frasco de cultivo celular de 75 cm2, con 5-12
ml de plasma (20-25 mg de fibrinógeno por lámina); entre 800-1200
fibroblastos/cm2; cloruro de calcio (2 ml al 1% en suero fisiológico); ácido
tranexámico (200 µl) y se completa con suero fisiológico hasta un volumen
total de 25 ml.
2. El plasma se deja en la estufa a 37oC entre 30 y 60 minutos, hasta que el gel
quede completamente solidificado.
3. Se cubre con 10 a 20 ml de queratinocitos y se espera un mínimo de 2 horas
antes de sembrar los queratinocitos en su superficie y se debe dejar hasta el día
siguiente.

37
 4. Después de 24 horas de preparar los geles, los viales de queratinocitos se
descongelan en solución a 37 oC, las células se resuspenden en un volumen
apropiado de queratinocitos y se siembran sobre los geles de plasma y
fibroblastos.
5. La siembra se debe hacer con una densidad de 1/10-1/35, es decir, con un frasco
de cultivo primario se siembran 10 frascos de cultivo secundario.
6. El seguimiento de cultivo se debe realizar mediante el microscopio invertido.
(Ver esquema 3)

Esquema 3. Tomado de Nuñez E. Obtención de un modelo dermoepidérmico autólogo artificial

4.5.1.- Preparación de la dermis para el trasplante.

Cuando los queratinocitos sembrados sobre la dermis alcanzan la confluencia, entre 10

y 12 días, se prepara la lámina para el trasplante. Este proceso incluye las siguientes
etapas:12

38
 1. Se retira el último medio de cultivo empleado y se abre el frasco de cultivo, con
un objeto caliente que funda el plástico.
2. El gel se cubre con un tul estéril de forma que este ocupe toda la superficie del
mismo, en la cual están los queratinocitos, mediante el empleo de un pegamento
inorgánico (cyanoacrylato, Histoacryl ®), el cual se aplica en pequeñas gotas en
los bordes del gel.
3. Una vez seco el pegamento, se procede a despegar el gel del frasco del cultivo.
4. Luego se debe levantar con cuidado la lámina unida al tul y tras despegarla se
cubre con medio de cultivo para facilitar su manipulación, se enrolla sobre la
misma y se introduce en un tubo cónico con medio de cultivo para su
transporte. (Ver figura 3)

Figura 3. Tomado de Nuñez E. Obtención de un modelo dermoepidérmico autólogo artificial

4.6.- Células cultivadas y no cultivadas en suspensión.

El trasplante de células epiteliales cultivadas autógenas en suspensión, reduce el tiempo
necesario para el cultivo y pueden estar disponibles antes de dos semanas. Los
preparados se pueden transportar y almacenar (congelados) hasta su aplicación, cuando
la superficie de la herida se encuentre lista. También existen las células epiteliales no
39
cultivadas en suspensión, que se han utilizado en el tratamiento de las grandes heridas
de los quemados y en el cierre de heridas crónicas; un pequeño fragmento de piel
tomado con un dermatomo se procesa junto al paciente y en unos cuantos minutos está
disponible para su aplicación en forma de aerosol, con lo que cubren grandes
superficies, pero el verdadero valor de este procedimiento no se ha definido
claramente.16

CAPITULO III

MARCO METODOLOGICO

En este capítulo se aborda aspectos concernientes con las técnicas empleadas para
cumplir el objetivo general de esta investigación. Inicialmente se expone el tipo y
diseño de investigación, luego los criterios de búsqueda, las fuentes de información,
criterios de exclusión y procedimiento.
40
3.1. Tipo y Diseño de Investigación

De acuerdo con el enfoque, el presente trabajo de investigación se define como una

investigación cualitativa- interpretativa, debido a que la información recolectada no fue
medida en escalas numéricas, sino que se interpreta en el contexto natural del
fenómeno, la cual se utiliza para estudiar cómo las personas ven, entienden y
construyen su mundo Fernández. Asimismo, la investigación tiene un diseño no
experimental, descriptivo, dado que no se manipuló los datos y sólo se describen los
hechos a partir de las fuentes de información arrojada en los estudios primarios y
secundarios, publicados en el periodo comprendido entre los años 2006 y 2016, y por
lo tanto, permitió conocer la efectividad de las diferentes técnicas de los cultivos de
queratinocitos en injurias de piel.

3.2. Criterios de búsqueda

Se realizó una búsqueda exhaustiva durante los meses desde noviembre del año 2015
hasta febrero del presente año. Para tal búsqueda se utilizaron y se combinaron los
términos claves: injurias de piel, modelos in vitro y sistemas de cultivo de
queratinocitos. En la investigación bibliográfica se empleó un método, basado en los
criterios de búsqueda siguientes:

Idioma: estudios publicados en inglés, español y portugués, independientemente del

país de origen de la publicación, autor o del lugar donde se haya realizado el estudio.

Tiempo: artículos publicados en el periodo comprendido entre los años 2006 y 2016.
No fue considerado el momento en el que se realizó la investigación, sino la fecha
establecida de publicación.

Descriptores: para identificar los descriptores se emplearon los comandos Medical

SubjetHeadings (MeSH) de PubMed para inglés, y para español los descriptores de
Ciencia de la Salud (DeCS) de Bireme.

MeSh: skin injury, models in vitro, systems of keratinocytes culture

DeCs: injurias de piel, modelos in vitro y sistemas de cultivo de queratinocitos.
41
3.3. Fuentes de información

La base de datos utilizada para la búsqueda de información fue la siguientes: Medline

(vía PubMed), Elsevier (vía ScienceDirect), Lilacs (vía Bireme), Scielo y Google
Académico, respectivamente.

3.4. Selección de los estudios

Seguidamente se procedió a la selección de los estudios, considerando los siguientes

criterios:
 La presencia explícita de dos o más descriptores en el título del trabajo, tomando
como término principal: cultivo de queratinocitos. Para esto se leyó el titulo de
cada artículo encontrado.
 Textos que hayan sido sometidos a un proceso de evaluación: revistas
científicas, tesis y trabajos de grado y seguidamente se realizó una evaluación
de las fuentes de información.
 Que comprendan estudios tales como: revisiones sistemáticas, meta-análisis,
estudios experimentales, ensayos clínicos, estudio de cohorte y de caso control.
Con este propósito, se revisaron los artículos para identificar información,
título, resumen, palabras claves y la sección de metodología.

3.5. Criterios de exclusión

Como criterio de exclusión se tomaron los trabajos, en los cuales no aparecían

identificado en forma explícita el autor o los autores.

3.6. Procedimiento de la investigación

a. Al inicio, se realizó una búsqueda en internet de información, con base a los criterios
anteriormente seleccionados.

42
b. Seguidamente se revisaron los artículos para seleccionar aquellos que cumplan con
los criterios establecidos para el presente estudio.
c. Una vez seleccionados, se procedió a una primera lectura de los textos para su
posterior clasificación.

d. Se crearon grupos, con base en su contenido categorizado.

e. Seguidamente cada investigador realizó una lectura en profundidad de cada artículo,

para seleccionar los datos más relevantes y realizar una síntesis.

f. Finalmente se procedió a interpretar los datos. Para realizar el análisis de los datos de
esta investigación, se procedió a la revisión detallada de los textos para buscar patrones
y así poder categorizar la información y mostrar los resultados de una manera más clara
y detallada. Este proceso se llevó a cabo por secciones:

Materiales y métodos: el análisis de esta sección permitió la creación de sub

clasificaciones para categorizar y ordenar la información recolectada de acuerdo a
características comunes y no comunes que presentaban los escritos.

Resultados: permitió verificar la efectividad del método diagnóstico estudiado.

Discusión: se evaluó dicha sección con el fin de poder explicar e interpretar los
resultados a los que habían llegado los autores y condensarlos.

Conclusiones y recomendaciones: se verificaron éstos dos últimos apartados para

buscar coincidencias en dichos aspectos y así saber en qué están de acuerdo la mayoría
de los autores: y conocer las posibles interrogantes o vertientes que no hayan sido
totalmente respondidas o estudiadas y sirvan como punto de partida para
investigaciones futuras.

43
 CAPITULO IV
RESULTADOS Y DISCUSION

En este apartado se presentan los resultados de la revisión de los estudios que reportan
sobre el cultivo de queratinocitos en el tratamiento de injuria de la piel por diferentes
causas. Estructurados de la siguiente manera: Injurias de la piel y enfermedades que
han sido sometidas a estudios de tratamiento a través del cultivo de queratinocitos y
factores biológicos, económicos y técnicos que inciden en la elaboración de la
aplicación de técnicas mediante el cultivo de queratinocitos en pacientes con
quemaduras y daños crónicos.

4.1.- INJURIAS DE LA PIEL Y ENFERMEDADES QUE HAN SIDO

SOMETIDAS A ESTUDIOS DE TRATAMIENTO A TRAVÉS DEL CULTIVO DE
QUERATINOCITOS.

La información consultada revela la evidencia de los tratamientos con cultivos de

queratinocitos en diferentes instituciones hospitalarias a nivel internacional y nacional,
siendo las más relevantes: quemaduras, úlceras, epidermólisis bullosa y
esquistosomiasis.

4.1.1.-TRATAMIENTO DE QUEMADOS CON CULTIVO DE

QUERATINOCITOS

El paciente quemado con compromiso de gran extensión de la piel, representa un gran

reto en los avances terapéuticos, ya que la mortalidad sigue siendo un problema
importante al que se enfrentan los profesionales sanitarios, no sólo por el shock
hipovolémico, la inhalación de humos que sufren estos pacientes y el shock séptico,
sino también, por las entidades directamente relacionadas y por la ausencia proporcional
de zonas donantes para la cobertura de extensas superficies corporales expuestas. 4,17

La investigación sobre quemaduras ha generado en las últimas décadas, varios avances

importantes que tienen como resultado la estabilización del paciente de forma eficaz y

44
disminución de la mortalidad, especialmente entre los pacientes jóvenes y aquellos con
quemaduras de grado intermedio. Sin embargo, para el intensivista, existen desafíos que
complican a menudo el apoyo para el paciente y su estabilización. 4,9,17,18

La elevada mortalidad de estos pacientes se justifica por la severa alteración del estado
general que sufren, las múltiples complicaciones que se asocian y por la ausencia de piel
apropiada para cubrir las quemaduras, como sucede en las de gran extensión. Este
último inconveniente se solventa de diferentes maneras, siendo una de las más
importantes el cultivo de queratinocitos. 9,17,18

En la Unidad de Quemados del Hospital Universitario de Cruces en Baracaldo

(Vizcaya), España, iniciaron la aplicación del cultivo de queratinocitos en 2001, con una
experiencia acumulada en una década de 14 pacientes. Durante décadas, estos pacientes
quemados fueron cubiertos con autoinjertos mallados a escalas superiores al 1:3, con
resultados variables. La escasez de zonas donantes obligaba a continuas tomas de piel,
con la consecuencia evidente del progresivo deterioro de los pacientes y del largo
intervalo que se debía establecer entre una y otra operación de cobertura para permitir la
reepitelización de estas zonas donantes sobre-explotadas. 9

Entre 2001 a 2011, la Unidad de Grandes Quemadosdel Hospital de Cruces ingresó 586
pacientes, 50 de los cuales presentaban quemaduras de extensión superior al 50%. De
ellos, 14 cumplían criterios de cobertura con queratinocitos (edad inferior a 65 años y
extensión de quemadura entre el 50 y el 97%, presentando 4 de ellos extensiones
superiores al 80%). De ellos, 2 tenían edad superior a 60 años y 1 era un joven con
quemaduras del 90% de SCT (superficie corporal total), y fallecieron durante el
tratamiento. La tasa media de prendimiento fue del 65%, con un rango del 45 al 90% 9.

A continuación se mostrarán imágenes de protocolo de estudio de una paciente que se

encontraba entre los criterios de cobertura de queratinocitos en tiempo descrito en la
Unidad de Grandes Quemados del Hospital de Cruces. (Ver figura 4 a 12).

45
 Figura 4. Mujer de 20 años de edad, con quemaduras del 97% SCT. Mecanismo. Explosión de gas en
su domicilio. Fotografía en el momento del ingreso. Tomado de González I, Aguilar P, Torrero J,
Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de
nuestra Unidad y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam.

Figura 5. Utilización de Tisscol como hemostático. Tomado de González I, Aguilar P, Torrero J,

Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de
nuestra Unidad y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam

46
Figura 6. Imagen tras desbridamiento y coberturas con Homoinjertos. Tomado de González I, Aguilar
P, Torrero J, Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos:
casuística de nuestra Unidad y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam

Figura 7. Suspensión con estribo de la extremidad inferior. Tomado de González I, Aguilar P, Torrero
J, Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de
nuestra Unidad y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam

47
 Figura 8. Láminas de queratinocitos en su medio de transporte. Tomado de González I, Aguilar P,
Torrero J, Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos:
casuística de nuestra Unidad y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam.

Figura 9. Láminas bicapa del equivalente cutáneo autólogo. Tomado de González I, Aguilar P, Torrero
J, Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de
nuestra Unidad y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam.

48
Figura 10. Primera cura. Se puede observar islotes de epitelización que con el tiempo van confluyendo.
Tomado de González I, Aguilar P, Torrero J, Ferreiro I, Gabilondo F. Cobertura de grandes
quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de nuestra Unidad y protocolo de tratamiento.
Cir.plást.iberolatinoam

Figura 11. Detalle de figura 10. Tomado de González I, Aguilar P, Torrero J, Ferreiro I, Gabilondo
F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de nuestra Unidad y
protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam

49
Figura 12. Resultado a los 4 años. Tomado de González I, Aguilar P, Torrero J, Ferreiro I,
Gabilondo F. Cobertura de grandes quemados con cultivo de queratinocitos: casuística de nuestra Unidad
y protocolo de tratamiento. Cir.plást.iberolatinoam

4.1.2.- TRATAMIENTO DE ULCERAS

En el Hospital Clínico Universitario de Caracas, Venezuela, se realizó un estudio clínico

donde se seleccionaron seis pacientes que presentaban: 1) lesiones crónicas de larga
evolución 2) fracaso en el proceso de cicatrización por ser úlceras rebeldes tras el
tratamiento ambulatorio 3) ausencia clínica y bacteriológica de infección bacteriana.3

Los seis pacientes seleccionados tenían una edad media de 51 años dentro de un
intervalo de 37 y 65 años; de ellos tres eran de sexo femenino y tres de sexo masculino.
Uno de los pacientes masculinos con amputación de la pierna izquierda, en cuyo muñón
presentaba una úlcera crónica de larga evolución. Todos los pacientes cumplían con los
criterios de selección mencionados anteriormente.3

Una vez incluido cada paciente en el estudio, se siguió un protocolo que incorporaba la
historia clínica en la que constaban todos los datos pormenorizados referentes al

50
paciente y su estado físico, así como todo lo referente a la úlcera: tiempo de evolución,
tratamiento previo, aspecto del lecho y bordes, resultado de los cultivos, fecha de la
colocación de los equivalentes cutáneos, área inicial de la úlcera y su evolución,
incluyendo fotografías semanales.3

Cumplidos todos los requisitos y seleccionados los pacientes, se inició la elaboración de

los equivalentes cutáneos (queratinocitos y fibroblastos), mediante la obtención de la
muestra de piel normal y su expansión “in vitro”, a partir de biopsias de piel humana
colectadas asépticamente de donantes sanos sometidos a cirugías estéticas, con su
respectivo consentimiento informado, donde los queratinocitos fueron cultivados con
células 3T3-J2, cuyo resultado se obtuvo al cabo de 25 días del procedimiento. (Ver
figura 13)

Figura 13. Equivalente epidérmico humano obtenido “in vitro” Tomado de Arvelo F, Cotte C, Pérez P,
Sojo F. Estudio preliminar del tratamiento de úlceras crónicas con equivalentes cutáneos obtenidos por
ingeniería de tejidos. Medisur

51
De los cuatro pacientes que siguieron el tratamiento, uno de ellos es ejemplo resaltante,
para mostrar los efectos reparadores que se observan al usarse los equivalentes
cutáneos al producir la curación de una forma rápida y efectiva. El paciente, de 37 años
de edad, sexo masculino, amputado a nivel de la rodilla de su pierna izquierda, y con
una úlcera refractaria a todo tratamiento convencional, y el cual previamente, durante
seis meses recibió tratamientos con apósitos, donde no se logró el cierre de la herida.

La lesión presenta un tejido granuloso desigual, bordes irregulares y trasudado profuso.

(Ver figura 14A). Se le colocó el primer implante y al cabo de una semana, se observó
un tejido de granulación uniforme con trasudado profuso, (Ver figura 14B). Se aplicó un
segundo equivalente y luego de finalizar la segunda semana se observó que la lesión
presentaba bordes planos y migración centrípeta de un tejido cicatricial hacia el centro
de la herida (Ver figura 14C).

Con el tercero y cuarto equivalente se pudo percibir que la herida fue disminuyendo de
tamaño hasta su cierre completo y sin ningún signo de trasudación, (ver figura 14D). El
paciente se recuperó totalmente, sin presentar signos de recidiva, considerándose que
había alcanzado la cicatrización completa y definitiva de la lesión crónica existente en
el sitio de la amputación.

52
Figura 14. Ulcera vascular: sin tratamiento (A), despues de 1 semana de tratamiento con el equivalente
epidermico, (B) al cabo de la segunda semana de tratamiento con el equivalente epidermico, (C) a la
tercera y cuarta semana de tratamiento con el equivalente epidermico. Tomado de Arvelo F, Cotte C,
Pérez P, Sojo F. Estudio preliminar del tratamiento de úlceras crónicas con equivalentes cutáneos
obtenidos por ingeniería de tejidos. Medisur

La evolución del resto de los pacientes fue la esperada con este tipo de procedimiento,
y todos respondieron al tratamiento con los implantes. Dos de los pacientes tratados,
como consecuencia de que el tamaño de la úlcera era muy grande, mayor de 50 cm2,
además de la condición de ser úlceras con lesiones crónicas de larga data, presentaban
lechos muy atróficos para que el tratamiento con los equivalentes funcionara bien, por
lo que fue necesario una limpieza inicial de la herida para retirar el tejido fibroso y
necrótico, y de esta manera crear un ambiente óptimo para recibir el trasplante. Esto
hace que las células del equivalente puedan actuar induciendo la regeneración de las
células del borde de la úlcera de la piel del paciente.3

53
4.1.3.-CULTIVO DE QUERATINOCITOS COMO TRATAMIENTO DE
ENFERMEDADES DE LA PIEL

4.1.3.1.-Epidermolisis Bullosa

La Epidermolisis bullosa (EB) es una enfermedad genética de la piel con un estimado de

500.000 casos en todo el mundo; que se caracteriza por la fragilidad crónica y
formación de ampollas de la piel, inducida principalmente por traumas mínimos. Las
diversas formas de EB son causadas por mutaciones en genes que codifican
componentes proteicos de la zona de unión dermal de la epidermis. Como resultado de
las mutaciones, las proteínas producidas en células de la piel están funcionalmente
deterioradas o ausentes. 19,20

La ausencia de la proteína o el deterioro de su función, conduce a la disminución de la

resistencia de la piel a las fuerzas de tensión y cizallamiento mecánico. La
Epidermólisis Bullosa se ha clasificado en cuatro tipos principales de acuerdo con el
nivel de formación de ampollas en la piel: EB simple (EBS), EB juntural (JEB), EB
distrófica (DEB), y Síndrome de Kindler. (review gene cell). Esto determina que los
tejidos se separen ante traumas de baja intensidad con formación de ampollas, vesículas
hemorrágicas y úlceras. 19,20

Su tratamiento se centra en la prevención del estrés mecánico sobre la piel y mucosas

para evitar la generación de nuevas lesiones. El tratamiento de las lesiones ya formadas
busca la protección de la zona con apósitos activos para lograr una reepitelización por
segunda intención. 19,20

En los últimos años se han hecho avances sustanciales en el área preclínica y

experimental en el tratamiento de enfermedades de la piel. En la epidermólisis
bullosa monogénica se han desarrollado enfoques prometedores en los campos de
terapia de proteínas y células, incluyendo el trasplante alogénico de células madres.
Además, la aplicación de enfoques de terapia génica se ha convertido en una realidad.
La primera terapia génica (en vivo) para un paciente con epidermólisis bullosa se llevó
a cabo en Italia hace más de 8 años.19

En el 2013 se realizó en Chile de manera experimental, intervención con cultivo de

queratinocitos humanos alogénicos en el tratamiento de esta enfermedad, en un centro
54
de salud familiar. Se trata de un paciente de 4 años de edad, del sexo masculino,
portador de una epidermólisis bullosa, confirmada por estudio histológico y microscopia
electrónica; con los siguientes diagnósticos asociados: estenosis de la vía área,
desnutrición, anemia crónica, síndrome de inmovilización y dolor crónico con un
componente mixto, más infección por Pseudomonas pyocyanea. Presentaba el 80% de
su cuerpo cubierto con lesiones que se localizaban principalmente en tronco, pelvis y
piernas; se movilizaba de manera asistida. Como era la primera vez en Chile que se
planteaba una intervención para pacientes con esta patología utilizando un apósito de
queratinocitos humanos alogénicos crio-preservado, debido al extenso compromiso que
presentaba y el elevado costo del apósito, lo que hacía imposible cubrir todo el cuerpo,
se decidió intervenir la extremidad inferior derecha.20

El compromiso de la pierna derecha era del 80%, correspondiendo a lesiones

enrojecidas de una profundidad menor a 1 cm, exudativas, con exudado turbio,
hipergranuladas asociado a tejido desvitalizado, escala de dolor en 8/10, piel
circundante macerada y sin signos de reepitelización.20 (Ver figura 15 )

Figura 15. Cara anterior y lateral de la pierna derecha al momento del diagnóstico. Tomado de Nicolás
L; Carlos M; Javier M. Bioingeniería de tejidos: cultivo de queratinocitos humanos en el tratamiento de la
epidermólisis bullosa. Rev Chil Cir

Procedieron a realizar curas y tratamiento para la Pseudomonas pyocyanea. Una vez

confirmado un cultivo negativo para este patógeno, se inició el uso del apósito biológico
con queratinocitos humanos, asociado a un apósito hidrocelular o espuma de poliuretano
55
constituido por tres capas (una de film de poliuretano, una capa de espuma y una capa
de contacto) no adhesivo; de manera de disminuir la fricción y adherencia y proteger la
piel indemne. Finalmente, como apósito secundario se utilizó venda gasa, como
fijación.20

Los apósitos con cultivo de queratinocitos humanos autólogos se mantuvieron durante

5 semanas. Al final del período del tratamiento, observaron una clara disminución de las
lesiones, con formación de piel indemne.20 (Ver figura 16).

Figura 16. Cara anterior y lateral de la pierna derecha al finalizar la quinta semana de tratamiento.
Tomado de Nicolás L; Carlos M; Javier M. Bioingeniería de tejidos: cultivo de queratinocitos humanos en
el tratamiento de la epidermólisis bullosa. Rev Chil Cir

4.1.3.2.- Esquistosimiasis

La esquistosomiasis es una importante enfermedad parasitaria de los seres humanos, que

para el 2012, eran más de 230 millones de personas en todo el mundo infectadas. La

56
etapa larval (cercarias) del ciclo de vida del esquistosoma E/S, es la primera en
interactuar con el huésped y activamente invade la piel a través de la secreción de
antígenos, incluyendo las enzimas proteolíticas y glicanos inmunogénicos8

El papel de las células inmunes no profesionales, tales como los queratinocitos

epidérmicos no se ha investigado en el contexto de la esquistosomiasis cutánea. Los
queratinocitos son de particular interés ya que constituyen la mayoría de las células en
la barrera primaria de la piel contra los patógenos invasores, la epidermis, y es probable
que sea el primer tipo de células expuestas a los antígenos E/S de las cercarías de
Schistosoma. Además de proporcionar una barrera física a la infección, los
queratinocitos median la homeostasis de la piel.8

Los queratinocitos también son conocidos por ser una fuente de citoquinas asociadas a
estrés producidas en respuesta a una serie de otros patógenos cutáneos (por ejemplo,
Candida albicans Trichobilharzia spp. y Sarcoptes scabiei). Las observaciones
realizadas en modelos mecánicos sugieren que la diversidad fenotípica entre los
queratinocitos epidérmicos también puede influir en el desarrollo de este tipo de
respuestas. 8

Por ejemplo, los queratinocitos situados en diferentes nichos epidérmicos, en particular

dentro de las estructuras del folículo piloso, muestran repertorios de quimioquinas
diferentes, implicadas en el reclutamiento de precursores de células epidérmicas. Así,
tanto la naturaleza de las respuestas de queratinocitos y su ubicación dentro de la
epidermis, puede contribuir a la iniciación de la respuesta inmune a la invasión de
cercarias en el sitio de la infección.8

A diferencia de las larvas de Schistosoma spp., que infectan a las aves y provocan la
dermatitis en el punto de entrada en la piel de mamíferos, una sola exposición
percutánea a cercarias de S. mansoni, no da lugar a una lesión tisular manifiesta en los
modelos murinos de infección. Sin embargo, la exposición repetida estas cercarías,
causa más daño a los tejidos de una sola exposición y promueve tanto las respuestas
angiogénicas, (es decir, formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos
existentes), también activos durante la curación de heridas. Por lo tanto, los cambios en
los subtipos de queratinocitos epidérmicos pueden tener consecuencias importantes
para la posterior activación y el acondicionamiento de las respuestas inmunes adquiridas
de las larvas de esquistosoma y el daño tisular causado por la migración de parásitos.8
57
A partir de este principio, Claire D. Bourke, Catriona T. Prendergast, David E.
Sanin, Tate E. Oulton, Rebecca J. Hall, and Adrian P. Mountford., publicaron en Int J
Parasitol. en marzo del 2015, un estudio realizado sobre los queratinocitos epidérmicos
en la curación y respuesta inmune proinflamatoria después de la infección de la herida
percutánea por esquistosomas en murinos, que sirve de base para ampliar el
conocimiento con respecto a la respuesta inflamatoria producida por la piel en
enfermedades infectocontagiosas y el papel de los queratinocitos en su manejo
terapeútico.

4.2.- FACTORES BIOLÓGICOS, ECONÓMICOS Y TÉCNICOS QUE

INCIDEN EN LA ELABORACIÓN DE LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS
MEDIANTE EL CULTIVO DE QUERATINOCITOS EN PACIENTES CON
INJURIAS DE LA PIEL

Desde 1981 se ha empleado ampliamente el cultivo epitelial autógeno para dar

cobertura cutánea a pacientes extensamente quemados. Desde entonces existen reportes
con resultados controversiales; los principales inconvenientes son los costos elevados y
la espera de tres semanas a partir de la toma de la muestra de piel del paciente quemado
para poder disponer de ellos.18

Estudios clínicos en pacientes con quemaduras masivas, han demostrado que el empleo
de queratinocitos autógenos cultivados disminuye la mortalidad, el número de cirugías y
la toma de injertos cutáneos; sin embargo, a largo plazo, las cicatrices son mayores a las
producidas por la aplicación de autoinjertos cutáneos. Con esta técnica se logra el cierre
de la herida hasta en un 76.4%, por lo que en la mayoría de los pacientes se requieren de
2 a 4 aplicaciones para el cierre total.9,18

En pacientes quemados observamos un claro cambio de opinión en los últimos quince

años, con tasas de captación paulatinamente superiores, que en algunas series alcanzan
medias del 90 % (6). Estas tasas de prendimiento, aunque inferiores a las habituales del
autoinjerto, justifican la aplicación de esta cara y laboriosa técnica, pues la experiencia
ha demostrado que el cultivo de queratinocitos permite la cobertura de quemados de
gran extensión que en ausencia de este procedimiento, fallecerían por falta de zonas
donantes viables. Es sin duda, un procedimiento caro, laborioso y que implica no sólo

58
una curva de aprendizaje, sino también sobradas dosis de paciencia, dado que los
resultados no se observan hasta pasados unos 15 días desde la siembra de
queratinocitos, para obtener finalmente una tasa de captación inferior a la obtenida
habitualmente con el autoinjerto.9

La adición de las células 3T3 a los cultivos de los queratinocitos, sirven de soporte y
estimula al desarrollo de los mismos, promoviendo su crecimiento, diferenciación y
adhesión e impidiendo el crecimiento de los fibroblastos humanos. La feederlayer
permite expresar a los queratinocitos características diferenciales y también se
demostró que las deficiencias encontradas inicialmente para el cultivo de las células
epiteliales no se debe en realidad a limitaciones intrínsecas de dicho tipo celular, sino
más bien a las complejas relaciones entre los queratinocitos y los fibroblastos1,3

La adhesión de los queratinocitos al frasco de cultivo, hace que sea necesario un

proceso de digestión enzimática para su separación, lo que dificulta la creación de una
membrana basal adecuada, una vez injertado el tejido.

Como toda nueva biotecnología, el cultivo de queratinocitos tiene un costo económico

elevado y los diferentes procedimientos son muy laboriosos, que ameritan de mucha
atención por parte del personal que manipula el tejido a cultivar, bien sea que se utilice
la técnica tradicional, el cultivo congelado, el plasma, los fibroblastos o la combinación
de los queratinocitos con estos dos últimos; por lo que su utilización debería ser
considerada caso a caso.

DISCUSION

La estructura de la piel presenta una menor complejidad que otros órganos, su

reemplazo por medio de equivalentes cutáneos desarrollados “in vitro” representan una
alternativa que asegura un alto porcentaje de éxito en la mayoría de los casos de
pacientes tratados por injurias de la piel. 3

En situación de pacientes quemados, los cultivos de queratinocitos humanos alogénicos

en la actualidad, han sido ampliamente utilizados con muy buenos resultados. Boyce y

59
col. sugieren que el uso de sustitutos cutáneos cultivados permite la reducción del
requerimiento de autoinjertos, con la disminución de la morbilidad que ello implica en
términos de un menor número de cirugías y de disminución de la estancia hospitalaria.4,9

En lo que respecta a las úlceras, se infieren tres funciones dinámicas primordiales que
pueden actuar y ser fundamentales en este tipo de lesiones al considerar la naturaleza
del órgano, tanto física como fisiológica: a) impedir la entrada de gérmenes y evitar la
pérdida de líquidos y electrólitos; b) cierre efectivo en el lecho de la herida a través de
la interacción con las células del huésped proporcionando una cobertura estable; c)
secreción de factores de crecimiento, por parte de las células del equivalente cutáneo, lo
cual estimularía las células del huésped que se encuentran en los bordes de la herida.
Todo esto, en su conjunto, acelera el proceso de cicatrización regulando el balance entre
la síntesis y la degradación de la matriz extracelular, así como la estimulación de la
angiogénesis. De aquí surge la explicación de la necesidad de la limpieza del tejido de la
lesión para colocar los implantes en unos tejidos más asertivos para responder a los
factores de crecimiento producidos por las células trasplantadas.3

En el caso de la Epidermólisis Bullosa, solo había un único antecedente de tratamiento

de cultivo de queratinocitos, realizado en Italia. En Chile decidieron apostar por esta
técnica con resultados prometedores, en un caso, en particular, donde nunca se había
logrado tener piel indemne en zona intervenida; debido a que las células alogénicas no
presentaron mutación ni generaron respuesta inmune, lo que permitió formar piel, ya
que las proteínas de anclaje de la unión dermoepidérmica son funcionales. Sin embargo,
la vida media de estos queratinocitos es sólo de 28 días. Los cultivos de queratinocitos
son una alternativa para el manejo agudo de esta enfermedad, de manera de lograr
cubrir lesiones activas en cortos períodos de tiempo, para disminuir la morbilidad
asociada.19,20

Es indiscutible que desde su aparición, los cultivos de queratinocitos han supuesto una
herramienta muy útil para el tratamiento de diferentes injurias de la piel. Sus bajas tasas
de prendimiento han mejorado con procedimientos asociados, como la preparación del
lecho dérmico mediante aloinjertos de piel de bancos de células, tal como lo ha revelado
la literatura consultada Sin embargo, uno de los problemas con los cultivos de
queratinocitos sigue siendo la fragilidad a largo plazo. Los queratinocitos trasplantados
60
al lecho de la herida deben ser capaces de generar una nueva membrana basal,
semejante a la unión dermoepidérmica normal y así, cubrir permanentemente esta
superficie por lo que es imprescindible que se genere esta unión de una forma
consolidada.

Con respecto a las enfermedades infectocontagiosas que afectan la piel (bacterianas,

parasitarias y micóticas), aún hay que investigar y se debe ampliar el conocimiento en
trabajos que demuestren que el cultivo de queratinocitos pueda ser útil en el tratamiento
de algunas entidades infecciosas que produzca daño severo de la piel, tal es el caso de
esquistosomiasis, donde citamos un trabajo realizado en murinos a los que se indujo a la
infección, con muy buena respuesta en la cicatrización por parte de los queratinocitos
cultivados in vitro. Otras enfermedades que se deben tomar en cuenta son leshmaniasis;
esporotricosis; vitiligo, tomando en cuenta el papel de los queratinocitos junto con los
melanocitos en la pigmentación de la piel; cicatrices de acné, motivo de consulta
frecuente en el área de la estética; entre otras.

Es importante promover la investigación en este campo y desarrollar nuevos

estudios de ingeniería tisular, concretamente sobre el perfeccionamiento de
equivalentes dérmicos que mejoren las tasas de captación y estabilidad de
los cu1.- Arvelo F. Ingeniería de tejidos y producción de piel humana in vitro.
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ltivos de queratinocitos. Hay múltiples trabajos en este campo del desarrollo de
equivalentes dérmicos, ya sean sintéticos, biológicos (autógenos o alógenos) o mixtos; y
parecen prometedoras las nuevas matrices biológicas sobre las que se realizan
expansiones de fibroblastos del propio paciente como soporte para el cultivo de
queratinocitos. 18

64
 CAPITULO V
CONCLUSIONES

Con base en los estudios revisados en la literatura seleccionada, se puede concluir lo

siguiente:

 El tratamiento mediante equivalentes cutáneos produce una cicatrización casi

inmediata de la lesión crónica rebelde a todo tratamiento convencional.

65
 Se deduce de los casos estudiados, que la expansión de los queratinocitos en
fibroblastos más plasma humanos, después de la extracción de la tripsina, y el
uso de piel por ingeniería con queratinocitos sobre una matriz de fibrina, han
producido mejoría notable en la cicatrización de heridas.

 La revisión de la literatura sobre el uso del cultivo de queratinocitos autólogos

muestra que cultivados pueden acelerar la cicatrización de heridas o diferentes
injurias en la piel. En su conjunto, el impacto futuro de las opciones de
cobertura celular de queratinocitos mediada es prometedor, pero se necesita más
investigaciones para sustentar esta afirmación

 El uso de los equivalentes cutáneos constituye una alternativa en el tratamiento

de las úlceras que por su tiempo de evolución, tamaño y atrofia del lecho
ulceroso sean difíciles de tratar.

 Es necesario tener presente que el cultivo de queratinocitos humanos no es un

tratamiento curativo para la epidermolisis bullosa, ya que no cambia la
condición del paciente y en estas lesiones reepitelizadas posteriormente se
deben tomar medidas preventivas para evitar la recidiva o la formación de
nuevas lesiones.

66
67