Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

PRÁCTICA 4. PUNTO ISOELÉCTRICO DE PROTEÍNAS

¿SE PUEDE DETERMINAR EL PUNTO ISOELÉCTRICO DE GELATINA Y CASEÍNA POR PRECIPITACIÓN?

Introducción Propiedades dieléctricas del disolvente

PROTEÍNA: Biomacromoléculas formadas por cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y con un peso molecular mayor o igual a 5000g/mol.
CLASIFICACION DE LAS PROTEÍNAS
Discusión
La constante dieléctrica se define como la capacidad de mantener separados a iones de diferente carga, en este sentido el agua presenta la mayor constante Resultados
dieléctrica lo que permite mantener en solución a las proteínas. La adición de solventes de menor capacidad de separación de iones hace que las proteínas
precipiten. Se usan como agentes precipitantes solventes miscibles con el agua como Acetona y Etanol. Se debe trabajar a temperatura baja para evitar la
desnaturalización de la proteína. Caseína El ph de la caseína teórico es de 4.6 y ése dato es el que se consideró para la solución problema. Cuando al mililitro de solución problema
se le añadió soluciones a ph ácido, hubo un cambio de ph que promovió la modificación de las cargas en la solución total. Ése cambio se

Hojas de seguridad
Tubo 1 0 presentó en forma de precipitación y conociendo el concepto de ph isoeléctrico, quiere decir que se igualaron el número de cargas; lo
mismo que hay de protones existe de radicales hidroxilo, presentando la mínima solubilidad ya que no existe repulsiones electrostáticas en
Tubo 2 0 las moléculas.

Tubo3 + La cuestión es encontrar el valor de ése ph isoeléctrico, el cual se obtiene con la ecuación de Henderson-Hasselbach; una expresión
utilizada en química para calcular el pH de una disolución reguladora, o tampón, a partir del pKa o el pKb (obtenidos de la constante de
Tubo 4 ++ disociación del ácido o de la constante de disociación de la base); en éste caso utilizamos el pka del ácido acético que es 4.76 y de las
concentraciones de equilibrio del ácido o base y de sus correspondientes base o ácido conjugado, respectivamente.
Proteínas conjugadas
Tubo 5 X En el primer caso, para utilizar la ecuación Henderson-Hasselbach nuestra solución problema es nuestra base del resultado de añadir
Tubo 6 +++ caseína, hidróxido de sodio y aforarla con ácido acético al 0.1N obteniendo caseinato de sodio y nuestro ácido que son las soluciones de
ácido acético a distintas concentraciones.
Tubo 7 +++ En la práctica el tubo 5 presentó precipitación y utilizando la fórmula obtenemos un ph de 4.76 el cual es muy cercano si lo comparamos
Tubo 8 ++ TURBIDEZ
con el pI de la caseína mostrando una congruencia con lo que se vió en el experimento.

Tubo 9 0 En el experimento de la gelatina, el ph resultante fue de 4.458 a comparación del punto isoeléctrico de la gelatina que es de 4.7. Esto
TUBO 1 0 ocurre porque en nuestra solución se agregó 6 mililitros de alcohol etílico, un solvente que no logra mantener la separación de los iones en
NIVELES ESTRUCTURALES DE LAS PROTEINAS nuestra solución provocando una precipitación pero en el caso de la gelatina, se reprodujo en una leve nebulosidad.

CASEINA La caseína es una proteína de digestión lenta y rica en calcio

TUBO 2 ++
con acción anti-catabólica en el cuerpo. PUNTO ISOELÉCTRICO: 4.6
Es uno de los principales componentes proteicos de la leche de origen TUBO3 ++
animal, especialmente del ganado vacuno, representando Conclusión
aproximadamente el 80% del total de proteínas de la leche. Una
característica distintiva de la proteína de caseína es su insolubilidad a
TUBO 4 +++
un pH bajo.
TUBO 5 +++ Con los resultados obtenidos en los diferentes tubos en base a la presencia de turbidez, precipitación, con el uso de soluciones de concentración
Contiene aa. Esenciales, de los cuales destaca su elevado contenido
de glutamina, la cual se le atribuye las propiedades beneficiosas en la
musculatura y también a nivel de inmunidad de nuestro cuerpo.
TUBO 6 X conocida y el empleo de la ecuación de Henderson Hasselbach, pudimos determinar los valores de pH en cada tubo, a que valor de pH se
presentaban como solubles las proteínas y por lo tanto a que pH se presentaba el punto isoeléctrico. Igualmente observamos el uso del alcohol
como agente precipitante en base en su solubilidad en dos compuestos distintos (agua y proteínas).
TUBO 7 ++
Se puede determinar el punto isoeléctrico de la caseína, debido al cambio de pH cambiando la carga total de la proteína, así́ las cargas eléctricas
TUBO 8 ++ son estables, presentando la mínima solubilidad, ya que no hay repulsión electrostática y provocando la precipitación.

TUBO 9 0 Se puede determinar el punto isoeléctrico de la gelatina, adicionando solventes de menos capacidad de separación de iones provocando que
las proteínas se precipiten.

Cálculos

PUNTO ISOELECTRICO: Es el pH al que un polianfólito tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en Concentración de la solución Concentración del tubo pHsolución
las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. problema
0.01
Para calcularlo se deben utilizar los pKa. (0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C= = 0.01
(0.01𝑁)(0.62𝑚𝐿)
C= = 6.2𝑥10−4 pH=4.76+log = 5.807
10𝑚𝐿 10𝑚𝐿 6.2𝑥10−4

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.01
(0.01𝑁)(1.25𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 1.25𝑥10 −3 pH=4.76+log
0.01
1.25𝑥10−3
= 5.66
Cuestionario
OBJETIVOS (0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.01
(0.1𝑁)(0.25𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 2.5𝑥10−3 pH=4.76+log
0.01
2.5𝑥10−3
= 5.362

Se llama pH isoeléctrico o punto isoelectrico al pH en el que la concentración de Zwitterión es máxima (el aminoácido no presenta carga neta).
0.01
Otra definición de punto isoelectrico es: pH al que la concentración de especies protonadas y desprotonadas se iguala. 1. Determinar el pI de diferentes (0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.01
(0.1𝑁)(0.5𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 5𝑥10−3 pH=4.76+log
5𝑥10−3
5.061
1.- Defina pI de una proteína
Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico y presenta el
mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas. proteínas. (0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C= = 0.01
(0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C= = 1𝑥10 −2 pH=4.76+log
0.01
= 4.76
2. Observar el efecto del alcohol 10𝑚𝐿 10𝑚𝐿 1𝑥10 −2
R= Es cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas, cuando se logra esta igualdad
la proteína presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas.
como agente precipitante. (0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.01
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.02 pH=4.76+log
0.01
0.02
= 4.458

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.01
(0.1𝑁)(4𝑚𝐿)
C=
10𝑚𝐿
= 0.04 pH=4.76+log
0.01
0.04
= 4.157 2.- Escriba la ecuación de Henderson- Hasselbach
(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) (0.1𝑁)(8𝑚𝐿) 0.01
C= = 0.01 C= = 0.08 pH=4.76+log = 3.856
10𝑚𝐿 10𝑚𝐿 0.08

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) (1𝑁)(1.6𝑚𝐿) 0.01

C= = 0.01 C= = 0.16 pH=4.76+log = 3.55
10𝑚𝐿 10𝑚𝐿 0.16

Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga MATERIALES Y REACTIVOS
neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento
neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico. - 18 tubos de ensaye. - Ácido acético: 0.01 N, 0.1 N, 1.0 N. Concentración de solución de Concentración de los tubos pHgelatina
GELATINA
- 2 gradillas. - NaCl 1% gelatina
- Pipetas de 1, 5 y 10 mL. - NaOH 10% C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
8𝑚𝐿
= .025 C=
(.1𝑁)(.12𝑚𝐿)
8𝑚𝐿
= 1.5𝑥10−3 pH=4.7+log
0.025
1.5𝑥10−3
= 5.816
La gelatina es parte del gran grupo de los hidrocoloides. PUNTO ISOELÉCTRICO 4.7 - Vaso de precipitado. - NaOH 1.0 N.
Donde:
Los hidrocoloides son sustancias que se producen de sustancias proteínicas vegetales o animales o azúcares múltiples. Tienen la capacidad de hincharse y - Acetato de sodio 0.1 N. C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
8𝑚𝐿
= .025 C=
(.1𝑁)(.25𝑚𝐿)
8𝑚𝐿
= 3.125𝑥10−3 pH=4.7+log
0.025
3.125𝑥10 −3
= 5.66

ligar el agua. Los hidrocoloides se utilizan para espesar, gelificar y estabilizar los alimentos. Aunque no todos los hidrocoloides reúnen todas estas propiedades,
Alcohol etílico y agua destilada
la gelatina si las tiene.
C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
= .025 C=
(.1𝑁)(.5𝑚𝐿)
= 6.25𝑥10 −3 pH=4.7+log
0.025
= 5.36
 S es la sal o especie básica, y
8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 6.25𝑥10−3

La gelatina es una sustancia derivada del colágeno, una sustancia que constituye gran parte del tejido conectivo en los seres vivos. El colágeno es una
molécula de naturaleza proteica, es decir que está formada en base a aminoácidos. Está formada por 3 cadenas de aminoácidos, también llamados
C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
= .025 C=
(.1𝑁)(1𝑚𝐿)
= 0.0125 pH=4.7+log
0.025
= 5.061
 A es el ácido o especie ácida
monómeros de tropocolágeno enlazados en forma de hélice. Esto debido a los enlaces de hidrogeno que se encuentran dentro de las cadenas Desarrollo 8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 0.0125

Primer desarrollo C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
= .025 C=
(.1𝑁)(2𝑚𝐿)
= 0.025 pH=4.7+log
0.025
= 4.76
3.- ¿Por qué el alcohol actúa como agente precipitante para la gelatina?
8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 0.025
Fundamento
Segundo desarrollo R = La gelatina, es una mezcla heterogénea de proteínas, de alto peso molecular, todas son proteínas solubles en agua, y
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) (.1𝑁)(4𝑚𝐿) 0.025
C= = .025 C= = 0.05 pH=4.7+log = 4.458
Agregar a cada tubo el 8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 0.05
el agua está incorporada dentro de las moléculas individuales de los aminoácidos, lo que hace su carácter de gel.
pH Agregar 1 ml de la
volumen Al agregar suficiente alcohol etílico, se rompen las uniones de las moléculas, pues el agua se mezcla con el alcohol, y las
solución problema y Agregar en cada tubo
correspondiente a las las soluciones Desechar con pipeta C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
= .025 C=
(.1𝑁)(0.8𝑚𝐿)
= 0.1 pH=4.7+log
0.025
= 4.157
proteínas precipitan, además de no ser solubles en alcohol.
El cambio de pH de la solución en que se encuentra la proteína promueve cambio en las cargas de los residuos y por lo tanto un cambio de carga total de la agitar inmediatamente. Mezclar el contenido
8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 0.1
soluciones indicadas indicadas por la la mitad de cada uno
proteína. Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico
práctica
(Punto isoeléctrico) y presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas. (0.1𝑁)(2𝑚𝐿) (.1𝑁)(1.6𝑚𝐿) 0.025
C= = .025 C= = 0.2 pH=4.7+log = 3.856
8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 0.2

El valor del pH isoeléctrico de una proteína determinada, puede variar dependiendo de la cantidad de iones presentes en la solución (aniones o cationes).
Cuando se eliminan todos los iones diferentes a H+ o –OH se determina el llamado pH isoiónico y este no varía en la proteína específica. Anotar resultados Al tubo número 5 Adicionar a los demás C=
(0.1𝑁)(2𝑚𝐿)
= .025 C=
(.1𝑁)(3.2𝑚𝐿)
= 0.4 pH=4.76+log
0.025
= 3.55
Anotar los reusltados 8𝑚𝐿 8𝑚𝐿 0.4
añadir de 5 a 8 ml de tubos la misma
"0"; falta de turbidez, de la misma forma
Se pueden separar proteínas usando precipitación por su punto isoeléctrico ya que cada proteína tiene un valor específico. Además las proteínas presentan Esperar 15 minutos etanolhasta producir cantidad de alcohol
que para la caseína
su conformación nativa y es posible solubilizarlas en una solución con el pH adecuado. "+" grados de turbidez una leve nebulosidad. añadida al tubo 5.
y "X" precipitación. Bibliografía
Ayudas didácticas
www.farmacopea.org.mx/Repositorio/Documentos/110.pdf