Universidade Federal de São João Del-Rei

Bioquímica Tecnológica

1. Transglutaminase
A transglutaminase (TGase), cuja classificação é dada por EC 2.3.2.13, é uma
enzima capaz de catalisar reações de transferência de grupos acil formando ligações
cruzadas intra e intermoleculares em proteínas, peptídeos e várias aminas primárias,
principalmente através de ligações covalentes entre resíduos de glutamina e lisina.
No mecanismo de reação catalisada pela TGase, o grupo tiol de uma cisteína ataca a
cadeia lateral de um resíduo de glutamina acessível no substrato protéico, formando um
complexo acil-enzima e amônia. No passo seguinte, uma amina primária entra no lugar da
enzima formando uma glutamina carboxamida modificada. Se a ligação protéica envolve a
lisina, a ligação cruzada entre peptídeos, intra ou inter molecular, ocorre via N(-
glutaminil) L-lisina. Dessa forma, as reações com transglutaminase levam a formação de
agregados protéicos irreversíveis, sendo muito importante a regulação da ação desta
enzima nos organismos. [1]
Esta enzima tem sido encontrada em mamíferos, vertebrados, invertebrados,
moluscos, plantas e microrganismos. A transglutaminase parece estar envolvida em
inúmeras reações envolvendo proteínas; no entanto, a função mais estudada é sua
participação no processo de coagulação sanguínea em mamíferos em que ocorre a
formação de ligações cruzadas entre proteínas catalisada pelo fator XIIIa, uma forma
ativada da TGase do plasma, e o estancamento do sangramento em ferimentos. Outro
exemplo é o fenômeno interessante de “suwari” ou endurecimento da pasta de proteína de
peixe moído a baixa temperatura, pela formação de ligações cruzadas na fabricação do
kamaboko, devido a TGase presente naturalmente no peixe. [2]
Recentemente a transglutaminase microbiana adquiriu importância devido às
inúmeras aplicações possíveis em alimentos, tornando importante buscar o aumento da
disponibilidade e redução de custos de produção. A transglutamase de microrganismos
(MTGase) é uma proteína monomérica e simples (não uma lipoproteína ou
glicoproteína), embora tenha dois sítios potenciais de glicosilação (-Thr-Xxx-Asn-).
 Alguns estudos para a caracterização da MTGase mostraram que o pH ótimo para
a sua atividade se mostrou entre 5 e 8, entretanto a enzima apresentou alguma atividade
em uma faixa de pH de 4 a 9. A enzima também foi considerada estável em uma ampla
gama de pH. A temperatura ótima para atividade enzimática foi de 55ºC (por 10min a
pH 6,0); ela manteve toda sua atividade quando mantida por 10 min a 40ºC, porém
perdeu atividade em apenas alguns minutos a 70ºC. A enzima ainda estava ativa a 10ºC,
e manteve atividade residual até perto da temperatura de congelamento. No que diz
respeito à especificidade quanto ao substrato, a maioria dos alimentos ricos em
proteínas pode ter ligações cruzadas em seus grupos proteicos. [3]
Diversos estudos demonstram que a TGase produzida por microrganismos é capaz
de formar ligações cruzadas com a maioria das proteínas dos alimentos, tais como,
caseínas, globulinas de soja, glúten, actina, miosina e proteínas dos ovos de forma tão
eficiente quanto as TGase de mamíferos. Os estudos baseados na seleção de milhares de
microrganismos mostram que linhagens do gênero Streptoverticillium têm a habilidade
de produzir a transglutaminase em grandes quantidades devido ao tipo de crescimento
micelial no meio de cultura, que é característico do gênero. Entretanto, sua principal
vantagem sobre todas as outras fontes da enzima é de produzir uma enzima cálcio
independente, e de peso molecular relativamente baixo. Ambas as características são
importantes para a aplicação industrial da enzima. [1]
De forma geral, existem três maneiras de buscar o desenvolvimento da produção
de uma fonte de transglutaminase para fins industriais. A primeira é extrair e purificar a
enzima de tecidos e fluidos corporais de animais usados na alimentação humana, tais
como: bovinos, suínos ou pescados. Na Europa, o fator XIII, um tipo de TGase, é
extraído comercialmente de sangue de gado e de suínos de abate. A enzima de sangue é
muito pouco utilizada na fabricação de alimentos, uma vez que possui uma coloração
vermelha que prejudica a coloração dos produtos. Além disso, essa enzima precisa de
uma protease específica, chamada trombina, para sua ativação. A segunda forma de
obter a enzima é através de manipulação genética utilizando microrganismos
hospedeiros, como a E. coli, Bacillus, leveduras ou Aspergillus.[1]
Muitos pesquisadores têm tentado obter a TGase em grandes quantidades a baixos
custos. Recentemente, obteve-se sucesso com uma secreção eficiente de TGase de
Streptomyces pelo Corynebacterium glutamicum, uma bactéria muito utilizada na
produção industrial de aminoácidos, tais como lisina e glutamato. Entretanto, nenhuma
destas enzimas têm sido comercializadas; isto se deve em grande parte por problemas de
aceitação do mercado devido sua origem oriunda de microrganismos geneticamente
modificados. A terceira forma de buscar pela enzima é realizar um “screening” por um
microorganismo produtor de TGase. Com um microorganismo apropriado, seria
possível produzir TGase em grande quantidade pela tecnologia tradicional de
fermentação. [1]

2. Fitase
Fitase (mio-inositol-hexaquifosfato fosfohidrolase, EC 3.1.3.8) é uma enzima que
catalisa a liberação do fosfato de fitato (mio-inositol hexaquifosfato), o qual é a
principal forma de fósforo predominantemente ocorrendo em grãos cereais, legumes e
sementes oleaginosas, onde o ácido fítico armazenado compreende de 1 a 5% em peso
(VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).
O ácido fítico e intermediários de inositol têm sido incluídos na resposta de glucose
do sangue, diminuindo o colesterol e triglicerídeos, na formação de tumores, no
tratamento da doença de Parkinson, doença de Alzheimer e esclerose múltipla (VATS,
P.; BANERJEE, U. C., 2004). A hidrólise do ácido fítico (fitato) a mio-inositol e ácido
fosfórico é considerada como um importante processo metabólico em vários
biosistemas.
A sensibilização da sociedade e os regulamentos, cada vez mais exigentes, do
mundo de controle sobre poluição agrícola, particularmente na poluição de fósforo (P),
que limita o conteúdo de fósforo no estrume, têm intensificado a pesquisa sobre as
fitases. O foco tem sido principalmente sobre a produção de fitase e sua utilização como
um meio de reduzir a suplementação de fósforos inorgânicos na alimentação e
conseqüente redução na excreção fecal de fósforo. A poluição ambiental, devido ao
estrume com muito fosfato, tem resultado na acumulação de fosfato em várias
localizações, especialmente em corpos de água. A suplementação de fitase pode reduzir
a quantidade de fosfato no estrume para aproximadamente 30% (PANDEY, A, 2001).
Fitases são consideradas de grande valor no melhoramento da qualidade nutricional
de ração, aumentando a quantidade de fosfato disponível. Dois grupos importantes de
animais, porcos e aves, carecem da enzima necessária para a digestão eficiente do fitato
nas rações. Fitase também melhora a biodisponibilidade de fosfato de fitato em
alimentos vegetais para humanos. (PANDEY, A, 2001).
Existem três grandes problemas gerados pela falta de fitases e incapacidade de
digestão de fósforo de fitato pelos animais monogástricos. Primeiro, o fósforo da
alimentação não aproveitado acaba no estrume, causando sérios problemas de poluição
ambiental em áreas de intensa pecuária (KIM, T., 2006). Um dos problemas ambientais
global é o da eutrofização, que ocorre quando o fosfato acaba em rios, propiciando o
crescimento de cianobactérias, hipóxia e morte de animais aquáticos (VATS, P.;
BANERJEE, U. C., 2004).
Segundo, é necessário a suplementação de fosfato inorgânico na dieta de suínos,
aves e peixes para satisfazer as exigências nutricionais de fósforo. Isso representa um
custo significativo na alimentação animal. Terceiro, o fósforo inorgânico é não-
renovável, e os acessos fáceis ao fósforo inorgânico em terra podem estar exauridos em
80 anos, com a atual taxa de extração. Em excesso, o fitato pode quelar oligoelementos,
como ferro e zinco, causando deficiência generalizada desses nutrientes em populações
cuja alimentação é baseada em leguminosas. (KIM, T., 2006)
No entanto, para crescimento ósseo correto, esses animais necessitam de fosfato em
concentrações adequadas. Isso cria uma situação complexa. Mas a suplementação de
fitase à alimentação fornece uma alternativa para enfrentar efetivamente essas duas
condições (PANDEY, A, 2001).
Uma abordagem alternativa para diminuir o teor de ácido fítico em produtos
agrícolas poderia ser o uso de métodos químicos, no entanto, esses métodos geralmente
são caros e afetam a qualidade nutricional do produto (PANDEY, A, 2001).
A União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) em consulta
com a IUPAC-IUB, Comissão Mista em Nomenclatura Bioquímica (JCBN) listam dois
tipos de fitases:

i) EC 3.1.3.8
Nome recomendado: 3-fitase
Nome sistemático: mio-inositol hexaquis fosfato-3-fosfohidrolase
Hidrolisa a ligação éster na terceira posição de mio-inositolhexaquisfosfato em d-mio-
inositol-1,2,4,5,6-pentaquisfosfato e ortofosfato (VATS, P.; BANERJEE, U. C., 2004).

ii) EC 3.1.3.26
Nome recomendado: 6-fitase
Nome sistemático: mio-inositol hexaquis fosfato-6-fosfohidrolase
Hidrolisa a ligação éster na sexta posição do mio-inositolhexaquisfosfato em d-mio-
inositol-1,2,3,4,5-pentaquisfosfato e ortofosfato. Subseqüentes ligações éster no
substrato foram hidrolisadas em diferentes taxas. Em um estudo recente, Mullaney e
Ullah, descreveram três classes de fitases baseadas em diferenças estruturais e
propriedades catalíticas variadas. Estas incluem membros de fosfatases de histidina
ácida (HAPs), β-propeller fitase (BPP) e fosfatases ácido roxas (PAP) (VATS, P.;
BANERJEE, U. C., 2004).

3. Tanase
Tanino acil hidrolase conhecida como tanase (E.C:3.1.1.20) é uma enzima que
hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis (BANERJEE et al., 2001). O
ácido tânico é um típico tanino hidrolisável, que pode ser hidrolisado por tanase em
glicose e ácido gálico (HELBIG, 2000).
A tanase pode ser obtida a partir de fontes vegetal, animal e microbiana. A tanase
está presente em muitas plantas ricas em taninos como myrobalan (Terminalia chebula),
divi divi (Caesalpinia coriaria), dhawa (Anogeissus latifolia), konnam (Cassia fistula),
babul (Acacia arabica) e avarum, principalmente em suas frutas, folhas, galhos e nas
cascas (BANERJEE & KAR, 2000). De fontes animais, tanase pode ser extraída do
intestino bovino e das mucosas dos ruminantes. O meio microbiológico é a fonte mais
importante de obtenção da tanase, uma vez que as enzimas produzidas desta forma são
mais estáveis do que aquelas obtidas por outros meios. Além disso, microrganismos
podem produzir tanase em altas quantidades e de maneira contínua, com conseqüente
aumento de rendimento (BANERJEE et al., 2001).
A tanase é uma enzima extracelular, induzível, produzida na presença de ácido tânico
por fungos, bactérias e leveduras (AGUILAR et al., 1999). A primeira etapa para o
desenvolvimento do processo de produção de enzimas microbianas é a seleção da
linhagem. Enzimas extracelulares são preferidas, pois são mais facilmente extraídas e
dispensam métodos de extração mais dispendiosos (COURI et al., 1998). Existem
estudos de produção da tanase por fermentação sólida, líquida e submersa (LEKHA &
LONSANE, 1994).
A fermentação sólida para a produção de enzimas oferece vantagens sobre o método
de fermentação submersa e líquida convencional (LAGEMAAT & PYLE, 2001). O
meio de produção é simples, pode-se utilizar subprodutos agroindustriais como casca de
uva, caju, café ou farelo de trigo, arroz e aveia, acrescidos de ácido tânico.
Lekha & Lonsane (1997) produziam tanase de Aspergillus niger e Penicillium
glabrum utilizando farelo de trigo e Aguilar & Gutiérrez-Sanchez (2001) e Lagemaat &
Pyle (2001) produziram tanase em espuma de poliuretano. A utilização de resíduos
provenientes de indústrias hidrólise do ácido tânico (AGUILAR et al., 1999).
processadoras de frutas e grãos pode consistir em uma alternativa para promover a
redução dos custos de produção da enzima e evitar problemas de poluição que possam
causar. O interesse na fermentação sólida para a produção de compostos de importância
comercial é uma conseqüência da demanda por insumos de menor custo.
Embora existam muitas aplicações industriais da tanase em potencial, poucas são
efetivamente empregadas devido essencialmente ao custo de produção da enzima, que
ainda é elevado e, principalmente ao pouco conhecimento sobre seu modo de ação
catalítica. A enzima pode ter vasta aplicação na indústria de alimentos, principalmente
sucos, cervejaria, cosméticos, farmacêutica e indústria química (LEKHA & LONSANE,
1997), sendo principalmente utilizada para produção de ácido gálico, chás instantâneos,
na estabilização da coloração de vinhos, refrigerantes a base de café, processo de
tratamento de couro, detanificação de alimentos e para tratamento de efluentes na
indústria de couros (BANERJEE et al., 2001).

4. Bibliografia

[1] MACEDO J. A., SATO H. A. Propriedades e aplicações da transglutaminase

microbiana em alimentos. v.16, n.4, p.413-419, out./dez. 2005

[2] NONAKA, M. et al. Polymerization of several proteins by Ca2+ independent

transglutaminase derived from microorganisms. Agric. Biol. Chem., v.53, p.2619- 2623,
1989.
[3] YOKOYAMA, K.; NIO, N.; KIKUCHI, Y. Properties and application of microbial
transglutaminase. Appl. Microbial Biotechnol., v. 64, p.447-454, 2004.