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1.3.

METODOS UTILIZADOS PARA DETECTAR HONGOS MICOTOXIGENICOS


1.3.1. METODOS BASADOS EN LA UTILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO
DIFERENCIALES
Se ha ensayado con distintos métodos para poder determinar la capacidad potencial de lleva
consigo una cepa para producir sus micotoxinas; es aquí que se menciona la propuesta de
elaborar medios de cultivos especiales que favorezca la producción de micotoxinas. Algunos ya
utilizan medios de cultivos específicos que favorecen la producción de la micotoxina, y su
presencia se puede detectar en la misma placa donde se está desarrollando la colonia de la cepa
mediante la aplicación de luz UV (Soriano del Castillo). Ejemplos como lo mencionado tenemos
el Medio Agar Coco (ACY), se utilizan para discriminar cepas toxigénicas de las cepas no
toxigénicas, ya que al crecer las que son micotoxigénicas emiten fluorescencia cuando son
expuestas a luz ultravioleta. (Vega, veronica)

1.3.2. METODOS BASADOS EN TECNICAS CROMATOGRAFICAS


Diversas técnicas cromatográficas, mencionamos la cromatografía en capa fina (Thin Layer
Chromatography: TLC), la cromatografía liquida (Liquid Chromatography: LC) y la cromatografía
de gas (Gas Chromatography: GC) son utilizados por presentar mayor sensibilidad en la
determinación de cepas potencialmente productoras de micotoxinas.

Ya existen métodos basados en la utilización de las técnicas mencionadas y está diseñada para
minimizar el uso de medios de cultivo, incubaciones de tiempos largos y extracciones por
disolventes.

1.3.3. METODOS BASADOS EN TECNICAS INMUNOLOGICAS


Basado en el empleo de anticuerpos monoclonales o policlonales frente a antígenos casi
específicos (por ejemplo polisacáridos fúngicos, enzimas relacionados a la biosíntesis de
micotoxinas) de especies fúngicas potencialmente productores e micotoxinas (soriano del
castillo).

Los inconvenientes que presentan son (soriano del castillo):

- Reacciones cruzadas entre especies fúngicas debido a la poca especificidad de antígenos


y anticuerpos elegidos.
- Incapacidad de discernimiento entre cepas productoras y no productoras de
micotoxinas de una misma especie productora de micotoxinas.

Una de las técnicas más empleadas es la técnica de inmunoensayo enzimático sobre fase solida
(ELISA).

1.3.4. METODOS BASADOS EN TECNICAS DE ANALISIS DE ADN


Entre las técnicas de biología molecular, las basadas en PCR, son las más utilizadas para la
detección de hongos micotoxigénicos. La amplificación por PCR utiliza como reactivos
principales las 4 bases del ADN: adenina, guanina, timina y citosina (en sus formas de nucleosido
trifosfato dNTPs: dATP, dGTP, dTTP, dCTP), además de ello, un ADN polimerasa especial (taq
polimerasa) y un par de oligonucleótidos, denominados cebadores (primers), que son
complementarios en secuencia a los extremos de la región de ADN que queremos amplificar y
por donde se iniciara la copia de los fragmentos génicos (soriano del castillo).

1.4. ANALISIS DE MICOTOXINAS EN ALIMENTOS


Los métodos normalizados de análisis para diferenciar micotoxinas, validados por estudios
interlaboratorios, han sido recomendados por parte de la Asociación de Químicos Analíticos
Oficiales (Association of Official Analytical Chemist, AOAC) y el Comité Europeo de
Normalización (European Commitee for Standardization) (soriano del castillo).

La AOAC contiene 40 métodos validados para análisis de micotoxinas pertenecientes a


diferentes familias químicas, mientras que el Comité Europeo de Normalizacion tiene una
publicación de un documento que contiene criterios muy específicos para varios métodos de
análisis de micotoxinas (soriano del castillo).

Debemos tener en cuenta que el análisis de micotoxinas requiere un altísimo grado de exactitud,
precisión y reproducción de manera consecutiva en cada ejecución experimental (soriano del
castillo).

Las técnicas analíticas más empleadas en el análisis de micotoxinas son (soriano del castillo):

- Extracción y purificación
- Técnicas de presunción o screening
- Técnicas de confirmación

1.4.1. EXTRACCION Y PURIFICACION


La muestra tomada de la materia prima necesita ser sometida a un proceso de extracción y
purificación ya que la distribución no es uniforme sobre los alimentos (materias primas) de las
micotoxinas, es requerido un proceso de homogeneización; la purificación de la materia prima
es imperante debido a la alta complejidad de componentes presentes en dichos alimentos
(proteínas, lípidos, carbohidratos, agua, minerales, etc.), por todo ello se aplica para eliminar
todas las sustancias interferentes (soriano del castillo).

Con respecto a la extracción se utilizan dos técnicas dependiendo la naturaleza (matriz) de la


muestra: sólido y líquido; de matriz líquida (técnica líquido- líquido) ya no es de elección debido
a presentar muchos inconvenientes (soriano del castillo):

- Necesidad de altos volúmenes de muestra y disolventes


- Disminuida selectividad
- Insuficiente recuperación
- Dificultad de automatización

Es de elección la técnica de extracción cuando la matriz es sólida, contando con una lista amplia
de disolventes (metanol, acetona, acetato de nitrilo, acetonitrilo, diclorometano y hexano); la
selección de estos disolventes se ajusta por los siguientes factores (soriano del castillo):

- Polaridad de la micotoxina (enfoque químico)


- Naturaleza de la micotoxina (enfoque físico, fisicoquímico)

Para optimizar el rendimiento de la extracción de micotoxinas, se añade sales específicos y


además se realiza un ajuste de pH. Luego de la extracción convencional con disolventes es
sustancial llevar a cabo una etapa de purificación o limpieza (clean-up) las cuales permiten
obtener cromatogramas más limpios. Las técnicas de extracción y limpieza para el análisis de
micotoxinas son las siguientes (soriano del castillo):

- Extracción en fase solida:


 Extracción en fase solida (Solid Phase Extraction, SPE) convencional.
 Extracción con columnas Mycosep.
 Dispersión de matriz en fase solida (Matriz Solid Phase Dispersion, MSPD).
 Microextracción en fase solida (Solid Phase MicroExtraction, SPME).
- Extracción con columnas de intercambio iónico (Ion Exchange Column).
- Extracción con columnas de inmunoafinidad (Inmunoaffinity Column, IAC).
- Extracción por fluidos supercríticos (Supercritical Fluid Extraction).
- Extracción asistida por microondas (Micro-Wave Assisted Extraction).
- Extracción acelerada por disolventes (Accelerated Solvent Extraction).

1.4.2. TECNICAS DE EXPLORACION O SCREENING


Entre los métodos screening tenemos los inmunoensayos y los biosensores

1.4.2.1 INMUNOENSAYOS

Muchas técnicas muchos ensayos para micotoxinas abarcan diferentes problemas como contar
con un laboratorio bien equipado, en cuanto a instrumentación y personal con experiencia en
el manejo de muestras y estándares de referencias; sin embargo, a los intentos de simplificar
estos procedimientos estos procedimientos analíticos dio lugar al desarrollo de sistemas
inmunoquímicos, que encierran una gran dificultad en su elaboración, pero simplificado de tal
manera que se adquieren en forma de “kits” que requieren el mínimo de instrumentación y la
comprensión del proceso analítico de detección (Pozas).

Las micotoxinas al no ser antigénicas, los primeros estudios realizados se pretendió lograr la
conjugación con proteínas o polipeptidos que pudieran producir anticuerpos en condiciones
óptimas para conejos y otros animales. Progresivamente avanzaba la tecnología se logró la
producción de anticuerpos monoclonales. (Perez)(Pozas)

En la mayoría de los sistemas de inmunoensayos no es necesario efectuar los procedimientos


de limpieza de extractos. De manera que el extracto de matriz solida puede ser usado
directamente previa dilución son una solución tampón característica del propio sistema. Sin
embargo la sensibilidad de las determinaciones se incrementa cuando se utilizan un
procedimiento adecuado de limpieza de los extractos (Pozas).

En los de inmunoensayos tenemos:

1.- Radioinmunoensayo (Radio Inmuno Assay: RIA)

En esta técnica consiste en añadir al medo de reacción un anticuerpo específico y una cantidad
conocida de la micotoxina marcada con isotopo radiactivo (soriano del castillo) (Pozas) (3H, 14C
o 125I) (soriano del castillo); la cual se incuba con la muestra problema. Tras un lavado del medio,
se mide la radioactividad emitida por la muestra con un contador de centelleo, siendo la medida
inversamente proporcional a la concentración de la micotoxina en la muestra problema. La
concentración de la micotoxina se determina comparando los resultados con una recta patrón
(soriano del castillo).

Cada vez se utiliza de manera decreciente por varias razones: el laboratorio debe contar con
autorización para manipular radioelementos y además los costes de los patrones y de la gestión
de los residuos es muy elevado (soriano del castillo) (pozas).

Fue rápidamente reemplazado por el “kit”ELISA (soriano del castillo) (pozas).

2.- Enzimoinmunoensayo (Enzyme Linked Inmunosorbent Assay: ELISA)

ELISA es una técnica inmunoenzimática que consiste en reacciones serológicas que utilizan
conjugados para poder visualizar la reacción antígeno-anticuerpo (Perez, Marta); está basado
en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que
directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto puede ser medido
espectrofotométricamente (Pozas, Ruben).

Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto,
simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase
sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre (Perez) (Pozas).

Los diferentes tipos de ELISA son a continuación (Perez) (Pozas):

 Anticuerpos marcados:

o ELISA Directo

o ELISA Indirecto

o ELISA Sándwich:

 Doble (DAS)

 Heterólogo (HADAS)

 Antígenos marcados

o ELISA competitivo

1.4.2.2. BIOSENSORES

Son dispositivos analíticos conformado por un elemento biológico de reconocimiento (un


anticuerpo) (soriano del castillo) asociado a un mecanismo de detección e interpretación
(sistema de transducción) de la señal obtenida entre el analito y el dispositivo analítico (Jimenez,
Claudio Leon, Daniel). Cuando la micotoxina reacciona con el elemento de reconocimiento se
produce la variación de una o varias propiedades fisicoquímicas (PH, transferencia de
electrones, de calor, cambio de potencial, de masa, variación de las propiedades ópticas, etc.)
que detecta el transductor (soriano del castillo).

1.4.3. TECNICAS DE CONFIRMACION


1.4.3.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) (THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY: TLC) Y
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA DE ALTA RESOLUCIÓN (HIGH-PERFORMANCE THIN LAYER
CHROMATOGRAPHY, HPTLC)

Técnicas como la cromatografía en capa fina (CCF) (Thin-Layer Chromatography: TLC), ha sido
uno de los métodos de elección para la investigación y determinación de micotoxinas. Esta
técnica es extremadamente útil cuando trabajamos con extractos muy limpiosy en donde el
desarrollo en una sola dirección (CCF-unidimensional) es suficiente para la separación. A partir
de la década de los ochentas, se inició la cromatografía en capa fina de alta resolución (High-
Performance Thin Layer Chromatography, HPTLC), con desarrollo bidimensional (soriano del
castillo).

1.4.3.2. LA ELECTROFORESIS CAPILAR (CAPILLARY ELECTROPHORESIS, CE)

Es una técnica basada en la migración de las moléculas polares en el interior de un capilar en


cuyo interior fluye disolución tampón, cuando se les aplica una corriente eléctrica. La migración
de un determinado ion depende de la relación carga/tamaño, peso molecular, estructura
tridimensional y grado de solvatación (soriano del castillo).

1.4.3.3. LA CROMATOGRAFÍA GASEOSA (CG) (GAS CHROMATOGRAPHY, GC)

Es una técnica basada en la separación de compuestos en función de su volatilidad y afinidad


por la fase estacionaria. Las micotoxinas son sustancias poco volátiles y se requiere una hidrolisis
para remover el grupo del ácido tricarboxilico (cantu) (velazquez) y derivatización del grupo
amino para aumentar la volatilización (cantu)

1.4.3.4. LA CROMATOGRAFÍA LIQUIDA (CL) (LIQUID CHROMATOGRAPHY: LC)

Entre las ventajas más importantes que presenta la CL se encuentra la posibilidad de separar
sustancias termolábiles, no volátiles, polares y apolares con aceptables resolución entre
sustancias químicamente similares de manera rápida y reproducible. Es la técnica más habitual
para el análisis de micotoxinas acopladas a distintos detectores.

Se encuentra en la literatura diversas revisiones sobre el análisis de las micotoxinas por esta
técnica, se observa una clara preferencia de la fase reversa sobre la fase normal.

Los detectores utilizados son: el UV que es universal pero poco selectivo ya que muchas
moléculas absorben a la misma longitud de onda que las micotoxinas; fluorescencia, que por el
contrario es muy selectivo, y espectrometría de masas (EM) qué genera detecciones específicas.
La espectrometría de masas acoplada a la cromatografía líquida ha experimentado en la última
década un importante desarrollo gracias a las mejoras introducidas en las interfaces, por lo que
se ha convertido en la técnica de elección para la identificación y cuantificación de micotoxinas
termolábiles.

Sin duda el método más empleado hasta la fecha para el análisis de fumonisinas es la
cromatografía líquido-líquido de alta resolución (HPLC). Ahora bien, debido a que las
fumonisinas no presentan ningún cromoforo fuerte (sillue), no absorben en la zona del espectro
UV en la zona del visible para su análisis por estos métodos (velazquez), son necesarios técnicas
de derivatización (velazquez) (cantu) de los grupos aminos libres, que son transformados a
compuestos capaces de absorber en longitudes de onda de ultravioleta o fluorescentes (cantu).

La primera determinación cuantitativa de las fumonisinas en hplc comprendía una detección en


el espectro UV a 230nm de los correspondientes derivados maleicos (velazquez) (sillue), si bien
dio buenos resultados en el análisis de cultivo de hongos no es suficientemente sensible para el
análisis de las muestras contaminadas naturalmente. Para mejorar esta sensibilidad se optó por
la preparación de derivados fluorescentes.

Tenemos de los primeros como agentes derivatizantes a la fluorescamina (velazquez) (sillue),


luego un segundo reactivo introducido fue el ortoftaldialdehido (cantu) =σ-ftaldialdehido (OPA)
(velazquez) (sillue), el inconveniente con el derivado OPA-fumonisina es que no es estable y se
degrada rápidamente con el tiempo (cantu) (velazquez); sin embargo, es el reactivo más
utilizado para este tipo de análisis (velazquez) (cantu).

Otro reactivo usad es el naftalen-2,3-dicarboxialdehido (NDA) (sillue) (velazquez), este


constituye una buena alternativa al OPA, siendo sus derivados significativamente más estables
y con una mayor fluorescencia, sin embargo se tiene la dificultad de trabajar con el reactivo KCN,
que es parte de la técnica (velazquez).