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METODOS GENERALES DE ANALISIS
MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS. II.
ANALISIS DE LOS MICROORGANISMOS TOTALES
Recuento de microorganismos viables totales. Métodos físicos para la detección de microorganismos. Métodos
químicos para la detección de microorganismos. Métodos inmunológicos. Exámen de superficies. Recuentos de
mohos y levaduras.
1. Recuento de microorganismos viables totales. (Muestras líquidas u homogeneizadas).
Se trata de conocer el número total de microorganismos presentes en el alimento. Este
número no guarda relación con el de microorganismos patógenos por lo que no puede usarse
como índice de su presencia y sólo debe considerarse un indicador de las características
higiénicas generales del alimento.
Dependiendo de las características del medio utilizado (medio rico, medio limitado en
nutrientes para medida de la flora no láctica de alimentos fermentados) y de las condiciones de
incubación (mesófilos, psicrófilos) los microorganismos analizados serán miembros de
poblaciones diferentes. En general se investiga la presencia de microorganismos aerobios o
aerotolerantes (anaerobios facultativos); aunque, en ciertas situaciones (alimentos envasados
al vacío), puede ser de interés hacer recuentos de anaerobios totales.
Se han desarrollado técnicas que hacen posible la automatización del proceso.
Hay cuatro técnicas biológicas básicas técnicas de recuento de viables:.
1. Contaje en Placa Standard (Standard Plate Count).
2. Determinación del número más probable.
3. Métodos basados en la reducción de colorantes por viables.
4. Contaje microscópico directo.
1. Contaje de Placa: Consiste en el plaqueo de una muestra de volumen conocido del
alimento que se analiza. El resultado es función de una serie de factores como son el método
de muestreo, el tipo de microorganismo, el tipo de alimento y las características del medio de
cultivo. Los cultivos pueden hacerse tanto en masa como en superficie, aunque hay que
considerar que los cultivos en masa son letales para la flora psicotrofa. Cada bacteria viable
formará una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa normal o por medio de un
plaqueador en espiral que va depositando concentraciones progresivamente más diluídas de la
muestra.
2. Filtros de membrana: utilizados cuando el número de bacterias es bajo. Son filtros con un
poro de 0,45 mm que retienen las bacterias. Se filtra un volumen dado y se coloca el filtro
sobre una placa del medio de cultivo apropiado. La muestra puede haber sido procesada para
epifluorescencia previamente, lo que facilita el recuento (la epifluorescencia se puede provocar
con naranja de acridina que tiñe específicamente los ácidos nucleicos).
3. Microcolonias en DEFT: DEFT son las iniciales en ingñlés de Direct Epifluorescence Filter
Technique (técnica deepifluorescencia directa en filtro). En esta técnica las bacterias se filtran
para retenerlas en una membrana apropiada que posteriormente se trata con un agente
fluorescente (como la naranja de acridina) para teñir las células bacterianas (se somete el
filtrado a un tratamiento previo con detergentes para destruir las células somáticas). La
detección de los microorganismos ha de hacerse mediante microscopía de fluorescencia o por
cualquier otro método de medida de la epifluorescencia. En ciertos casos, las membranas se
incuban para producir colonias que son más fácilmente dtectables.
4. Contaje de microcolonias al microscopio: Se añade un pequeño volumen de agarcultivo a
un porta y se incuba para seguir la formación de microcolonias al microscopio.
5. Gotitas de agar: Se hacen diluciones de la muestra (solución madre) y se depositan gotitas
de 10 ml en una placa Petri (gotitas de cultivo + agar). Se examina el crecimiento de las
colonias en las gotitas tras la incubación.
6. Films secos (Petrifilm): Son películas deshidratadas de medios de cultivos generales o
selectivos en las que se deposita 1 ml de la muestra que rehidrata el medio. Tras la incubación
se hace el recuento.
7. Método del número más probable: Basado en series de diluciones y cálculo estadístico del
número de bacterias presentes en las diluciones más altas. Se puede hacer con 3 ó 5 tubos. El
método es popular aunque poco exácto.
8. Métodos basados en la reducción de colorantes: Usando azul de metileno o resazurina.
Colorantes reducidos por las bacterias; al reducirse cambian de color y esto es medible. Usado
en medios líquidos (lácteos).
9. Tubos rodantes: son tubos herméticamente cerrados en los que haciéndolos girar se forma
una fina capa de agua. Utiles para recuento de anaerobios.
10. Contaje microscópico directo: Usando cámaras de cuenta, se coloca un volumen
determinado y se recuentan las bacterias.
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Además de las técnicas de recuento basadas en la formación de colonias observable
(técnicas biológicas) hay una serie de procedimientos de recuento basado en técnicas
químicas, físicas e inmunológicas.
2. Métodos físicos para la detención de microorganismos.
A) Impedancia: Es la resistencia aparente presentada a la corriente alterna. En un cultivo los
microorganismos alteran las substratos cambiando su conductividad eléctrica y esto varía la
impedancia. El método se basa en detectar estos cambios y la cantidad de microorganismos
se expresa como función del tiempo que tarda el cultivo en alcanzar unos valores de
impedancia correspondientes a 106 107 células por ml1. (IDT: Imdepedance Detection Time).
Es necesario que el medio de cultivo permite un crecimiento homogéneo sin «escalones».
B) Microcalorimetria: Estudio de los pequeños cambios de calor producidos como
consecuencia del antabolismo de nutrientes. Los diferentes tipos de microorganismos
metabolizan los substratos de forma diferente y, por ello, se ha usado la microcalorimetría para
poder identificar las especies presentes en un alimento: usando un medio de cultivo con una
composición definida de azúcares pueden llegar a identificarse diferentes tipos de bacterias
lácticas mediante los termogramas de su metabolización de los azúcares presentes en el
medio.
C) Citometria de flujo: Método basado en hacer pasar una a una las células de una suspensión
por un sistema de detección; este sistema puede contener un detector capaz de medir
diferentes parámetros (diferentes tipos de fluorescencia, absobancia, dispersión de luz, etc.) lo
que permite identificar las bacterias durante su paso por el detector.
3. Métodos químicos de detección de microorganismos.
A) Nucleasa Termoestable: S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y
en mayor cantidad que la enterotoxina responsable de la intoxicación. La endonucleasa puede
detectarse experimentalmente como un índice de la presencia de S. aureus incluso en
concentraciones demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de
enterotoxina.
B) Lisado de Limulus: Usado para detección de endotoxinas (derivadas del lipopolisacárido
LPS de las bacterias Gram negativas). Se basa en la aglutinación de extractos de amebocito
de sangre de Limulus (cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de
LPS. Puede detectar 300 células de E. coli. El método detecta células viables y noviables. Es
muy rápido.
C) Sondas de ácidos nucleicos: Sirven para identificar microorganismo desconocidos por
medio de Southern.
D) PCR: Método para detectar número extremadamente bajos de microorganismos con una
cierta rapidez basado de la producción de copias de genes específicos de un microorganismo
en cuestión.
E) Medida de ATP: Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos
problemas experimentales que hacen que la técnica sea controvertida.
F) Radiometria: Medida de la transformación de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo
necesario para detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de
microorganismos presente.
G) Substratos Fluoro y Cromogénicos: Se añaden como aditivos a los medios de cultivos para
facilitar y acelerar la detección de los microorganismos.
4. Métodos inmunológicos.
Normalmente se usan antisueros que detectan flagelos (responsables de las formas móviles
de Salmonella y otras bacterias)
A) Anticuerpo fluorescentes: Se utiliza anticuerpo marcado con una molécula fluorescente o un
segundo anticuerpo que reconozca el primero. Se pueden usar antisueros complejos en el
primer anticuerpo y de esta forma detectar cualquier tipo de Salmonella sin necesidad de
aislarlas. El método también se ha usado para Clostridios aunque su mayor aplicación ha sido
en Salmonella donde es muy conveniente por la sensibilidad y rapidez.
B) Serologia de enriquecimiento: En este procedimiento especialmente desarrollado para la
detección de Salmonella, el antisuero no se añade al alimento sino que se efectúa un paso
previo de enriquecimiento del cultivo y de selección para evitar falsos positivos.
C) Test 1 2 de Salmonella: Sistema con dos cámaras de agar blando. Una de las cámaras (la
de siembra) contiene un medio selectivo para Salmonella, las bacterias móviles de este género
atraviesan la cámara selectiva y pasan a la no selectiva pero portadora de un anticuerpo
específico por lo que se forma una banda de aglutinación cuando entre Salmonella.
D) Radioinmunoensayo: se basa en el marcaje con un radioisótopo de un antígeno
determinado (toxina producida por una bactería patógena) y su posterior detección por
anticuerpos específicos fijados sobre un soporte sólido.
E) ELISA: El método es similar al radioinmunoensayo: el antígeno se fija en un soporte sólido,
se trata con el antisuero correspondiente y la interacción se detecta mediante una actividad
marcadora (peroxidesa) unida al anticuerpo en cuestión o a un segundo anticuerpo de
revelado.
El método se ha usado para detección de Salmonellas. Toxinas de S aureus, micotoxinas,
toxinas de C. botulinum, enterotoxinas de E. coli.
F) Difusión en gel: Método de Ouchterlony para detección de antígenos.
5. Examen de superficies.
Algunas veces es necesario añadir agentes neutralizantes para eliminar el efecto de
detergentes que han sido utilizados para limpiar la superficie.
El método más clásico de obtención de muestra es el uso de torundas de algodón o de
alginato cálcico. Las muestras se recogen en seco o en húmedo y se depositan sobre medios
de cultivo líquido (generales o de enriquecimiento).
En algunos casos se usan otros metodos como el contacto con placa o la jeringa de agar.
6. Recuento de mohos y levaduras.
Se realiza o bien directamente en el alimento humedecido e incubado a 22ºC o bien mediante
diluciones sucesivas y siembra en placa en superficie. Es necesario añadir agentes
antibacterianos al medio de cultivo para evitar el crecimiento de las bacterias, que es más
rápido que el de los mohos.
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