PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

Las plantas y sus tejidos de interés colectados se lavan con agua del grifo y
después con agua destilada, se seleccionan para garantizar buen estado. Se
puede trabajar con material fresco y troceado, o se puede trabajar con material
secado en horno a 45±2°C por 24 horas, luego se pulveriza y se someten al
proceso de extracción (Granados et al., 2012; Vitola y Pérez, 2016).

EXTRACCIÓN DE LOS ACEITES ESENCIALES

Se realiza por el método hidrodestilación asistida por microondas (MWHD)

empleando un equipo de hidrodestilación tipo Clevenger cuyo balón tiene
capacidad para 2.0 L, dentro del cual se introduce el material vegetal con 0.30 L
de agua destilada y se somete a calentamiento en el horno por un tiempo de
extracción de 45 minutos divididos en 3 ciclos de 15 minutos cada uno. Los
aceites esenciales (AE) se colectaron en un recipiente tipo Dean Stark separados
por decantación, deshidratados con sulfato de sodio anhidro y se almacenan en
viales tipo ámbar a temperatura aproximada de 4°C hasta su posterior uso (Vitola
y Pérez, 2016).

OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES CON EQUIPO SOXHLET

El material vegetal seco o fresco molido se pesa y se adiciona como solvente

etanol grado analítico y se somete al proceso de extracción empleando un equipo
Soxhlet con cartuchos de celulosa y temperatura de ebullición de 85°C por 4 horas
de extracción (Vitola y Pérez, 2016).

OBTENCIÓN DE FRACCIONES POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Los extractos etanólicos previamente rotaevaporados se llevan a una columna

cromatográfica de vidrio con bulbo previamente empaquetada con gel de sílice 60
(0,063-0,200 mm) como fase estacionaria y como fase móvil en gradiente las
mezclas de los solventes (F1) Ciclohexano: Tricloroetileno (6:4), (F2) Cloroformo:
Acetona (8:2) y (F3) Metanol, obteniendo tres fracciones por extracto (Peroza,
2016).

ROTAEVAPORACIÓN DE LOS BIOPRODUCTOS

Los extractos y las fracciones fracciones se concentrarán en rotaevaporador a

temperatura reducida de 40±1°C a baño de María y presión reducida así: para los
extractos a 175 mbar, para las F1 a 183 mbar, para las F2 a 474 mbar y para las
F3 a 337 mbar (Peroza, 2016).
PREPARACIÓN DE LOS BIOPRODUCTOS A ENSAYAR

Las concentraciones de los bioproductos a evaluar se prepararán utilizando como

solventes una solución de Tween 20 al 1% y DMSO al 0,2%. Se utilizará como
control positivo el Benomil 2.5%, control negativo la solución de Tween 20 al 1% y
DMSO al 0,2% y un testigo absoluto que es el hongo sin ningún tipo de
tratamiento.

PRUEBAS ANTIFÚNGICAS IN VITRO

 INHIBICIÓN DEL MICELIO

Para la prueba de inhibición del crecimiento micelial se siguirá la metodología de

siembra directa propuesta por Vitola y Hernández (2015) con modificaciones. En
esta prueba se utilizarán aislados de aproximadamente 7 mm de diámetro de área
de crecimiento los cuales se sembrarán sobre la superficie del medio PDA
enriquecido con cloranfenicol, rifampicina y ampicilina. A cada aislado sembrado
se le adicionará 50µL de cada tratamiento con el objeto que el aislado quede bien
impregnado. Los ensayos se incubarán de 30±2°C por 8 días en intervalos de 12
horas de luz y 12 horas de oscuridad. La actividad antifúngica se evalúa midiendo
el crecimiento radial de cada aislado con los diferentes tratamientos en el día
octavo. El resultado se interpreta como porcentaje de índice antifúngico mediante
la siguiente ecuación:

%I.A=[1-D_a/D_b ]X100

Donde Da corresponde al crecimiento de cada tratamiento y Db al crecimiento del

testigo absoluto (Guo et al., 2008).

INHIBICIÓN DELA GERMINACIÓN DE CONIDIAS

De acuerda a una curva de germinación se realizará la prueba de inhibición de la

germinación utilizando placas de Elisa de 96 pozos, en cada pozo se adicionarán
100 µL de una suspensión de conidias ajustada a 1x10 6 conidias/mL y el mismo
volumen de los tratamientos, se incubaron a 30±2°C hasta el periodo de máxima
germinación determinado en la curva de germinación. Después se tomará 10 µL
de cada tratamiento y se inoculará en cajas de Petri con PDA incubado a 3±1 día
a 30±2°C con intervalos de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad (Conti et al.,
2013). Después de lo cual se realizará conteo de la UFC y se determinará el
porcentaje de inhibición en la germinación.

Inhibición de la Germinación (%I.G)=100-((CFU experimental)/control X100)

INHIBICIÓN DE LA TASA DE ESPORULACIÓN

Para este ensayo se utilizará los cultivos de la prueba de inhibición del micelio. La
tasa de esporulación se determinará en solución acuosa con Tween 20 al 1% y
NaCl al 0.85%. para esto se adiciona 20.0 mL de la solución sobre el hongo y se
raspa para favorecer la extracción de las conidias las cuales se contaron en
cámara de Neubauer realizando cuatro conteos por caja y se tomará el promedio
(Alzate et al., 2008).

CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (MIC) Y CONCENTRACIÓN MÍNIMA

FUNGICIDA (MFC)

Con las concentraciones de los bioproductos más eficientes en cuanto actividad

inhibitoria se prepararán concentraciones para determinar que concentración es la
que causa la mayor actividad.

Los valores de la MIC y MFC se calculan sobre la germinación de las conidias y

sobre el crecimiento micelial en PDA enriquecido con cloranfenicol, rifampicina y
ampicilina e incubados a 30±2°C teniendo en cuenta el testigo absoluto y el control
negativo. La MIC de los bioproductos será definida como la concentración más
baja de los tratamientos que mostró inhibición del crecimiento ≥90% a los 8 días
de incubación (Consentino et al., 1994) y la MFC como la concentración más baja
de los tratamientos que no muestra crecimiento visible del hongo o provoca la
inhibición del crecimiento alrededor del 100% a los 14 días de incubación.

CARACTERIZACIÓN POR CROMATOGRAFIA DE GASES ACOPLADO A

ESPECTROMETRÍA DE MASA GC/MS

 PARA LOS ACEITES ESENCIALES

Para la caracterización de los aceites esenciales se usará un cromatógrafo de

gases marca Agilent Technologies 7820A y un espectrómetro de masas Agilent
Technologies 5977E, y los índices de Kóvats se determinarán usando una
columna capilar apolar HP-5MS con una longitud de 30 m, diámetro de 0.24 mm y
el espesor de la fase estacionaria de 0.25mm. El horno tendrá una temperatura
inicial de 60°C y permanecerá allí por 5 min y asciende 4°C/min hasta 160°C,
luego asciende a 15°C/min hasta 240°C. La temperatura del inyector y la
temperatura de la línea de transferencia se ajustarán a 250°C cada una y la
temperatura de la fuente será de 150°C. El volumen de inyección será de 1µL y se
usará como gas de arrastre el helio con flujo de 1 mL/min. La identidad de los
componentes se asignó por comparación del espectro de masas obtenido
experimentalmente para cada componente, con los reportados en las bases de
datos de NIST2011.

 PARA LOS EXTRACTOS Y FRACCIONES

Para la caracterización química de los extractos y fracciones se usará un
cromatógrafo de gases marca Agilent Technologies 7820A y un detector
selectivo de masas Agilent Technologies 5977E, y los índices de Kóvats se
determinarán usando una columna capilar DB-5MS con una longitud de 40 m,
diámetro interno de 0.18 mm y el espesor de la fase estacionaria de 0.18mm.
El horno tendrá una temperatura inicial de 75°C y permanecerá allí por 1 min y
asciende 7°C/min hasta 125°C mantenida allí por 3 minutos, luego asciende a
7°C/min hasta 250°C y se mantiene por 5 min y por último se incrementa a
razón de 7°C/min hasta 325°C y se mantiene por 5.29 min. La temperatura del
inyector es de 225°C y la temperatura del detector será de 350°C. El volumen
de inyección será de 0.2µL en modo Splitless y se usará como gas de arrastre
el helio con flujo de 1 mL/min. La identidad de los componentes se asignó por
comparación del espectro de masas obtenido experimentalmente para cada
componente, con los reportados en las bases de datos de NIST2011.
MATERIAL ESTADO BIOPRODUCTO ESTRUCTURA MÉTODO SITIO DE CROMATOGRAFÍA PERFIL QUIMIOTIPO
VEGETAL BLANCO COLECTA EN COLUMNA QUÍMICO
Hojas de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Sincelejo no si Ciclononasiloxano,
Neen molidas conidias octadecametil
Frutos de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Sincelejo no si Ácido
neen molidas conidias Hexadecanoico, metil
ester
Hojas de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Sincelejo no si Dodecil acrilato
Melia molidas conidias
Frutos de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Sincelejo no si 2-isopropil-5-metil-1-
Melia molidas conidias heptanol
Semillas de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Sincelejo no si Octasiloxano
Melia molidas conidias
Hojas de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Sincelejo si si trans-1-
Swinglea molidas conidias Cinnamoilimidazol
Hojas de secas y Extracto Micelio y Soxhlet Tolú si si D-Germacreno
Swinglea molidas conidias
Hojas Lippia Frescas y Aceites Micelio y Hidrodestilación Sincelejo no si Citral
alba troceadas esenciales conidias
Hojas Lippia secas y Aceites Micelio y Hidrodestilación Sincelejo no si Timol
origanoides molidas esenciales conidias
hojas de Frescas y Aceites Micelio y Hidrodestilación Sincelejo no si Antranilato de linalilo
naranja troceadas esenciales conidias
agria
hojas de Frescas y Aceites Micelio y Hidrodestilación Sampués no si Linalool
naranja troceadas esenciales conidias
agria
hojas de Frescas y Aceites Micelio y Hidrodestilación La Unión no si Linalool
naranja troceadas esenciales conidias
agria
hojas de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación Sincelejo no si Geraniol
limoncillo troceadas esenciales
hojas de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación Sampués no si Geraniol
limoncillo troceadas esenciales
hojas de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación La Unión no si Geraniol
limoncillo troceadas esenciales
hojas de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación Sincelejo no si Eugenol
Ocimun troceadas esenciales
basilicum
hojas de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación Sampués no si Eugenol
Ocimun troceadas esenciales
basilicum
Flor de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación Sincelejo no si Linalool
amor troceadas esenciales
Flor de Frescas y Aceites Micelio Hidrodestilación La Unión no si Benzoato de Bencilo
amor troceadas esenciales
Hojas Secas Extractos Micelio Soxhlet Corozal no si Ácido cianhídrico
Mascagnia
sp.
BIBLIOGRAFÍA

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