ORIGINALES
Cuantificación del ADN y análisis del ciclo
celular en un modelo de hepatocarcinogénesis
Lourdes Rodríguez Fragosoa, Alejandro Nieto Rodrígueza, Teresa Cadenab,
Sara García-Jiméneza y Jorge Alberto Reyes-Esparzaa
a
Facultad de Farmacia. Universidad Autónoma del Estado de Morelos. Cuernavaca. Morelos. México.
b
División de Patología. Instituto Nacional de Cancerología. México.
El objetivo de este estudio fue cuantificar el
ADN y analizar el ciclo celular en muestras de
tejido hepático de ratas a quienes se les indujo un
carcinoma hepatocelular bien diferenciado. Se
cuantificó y analizó el ADN de las muestras con
carcinoma hepático mediante citometría de flujo.
Nuestros resultados mostraron la presencia de
ADN diploide en todos los grupos durante la he-
patocarcinogénesis. El contenido de ADN fue nor-
mal, independientemente de las características
histopatológicas y etapa del cáncer. El análisis de
animales incluidos en el modelo de hepatocarci-
nogénesis mostró un incremento en la cantidad de
células hepáticas en proliferación, desde el se-
gundo mes de tratamiento. Fue también evidente
un importante incremento en la fase G2+M, en el
sexto y octavo mes de tratamiento. Aunque hubo
variaciones en todas las fases del ciclo celular a
lo largo del desarrollo de la hepatocarcinogé-
nesis, fue observada una actividad proliferativa
constante (fases S+G2+M) en todo el proceso. Este
modelo de hepatocarcinogénesis química inducido
en rata puede ser empleado para estudiar alte-
raciones celulares y moleculares que se presentan
desde etapas tempranas hasta la invasión y metástasis.
Palabras clave: ciclo celular, diploidía, prolifera-
ción, cáncer, citometría.
Rodríguez Fragoso L, Nieto Rodríguez A, Cadena T, García-Ji-
ménez S, Reyes-Esparza JA. Cuantificación del ADN y análisis
del ciclo celular en un modelo de hepatocarcinogénesis. Rev
Oncol 2002;4(8):443-54.
Ó
INTRODUCCIÓN
El carcinoma hepatocelular (CHC) es uno de los
tumores más agresivos y por ello con pobre pronós-
tico1. La patogénesis multifactorial y de múltiples
etapas que caracterizan al CHC han llamado la
Correspondence: Dra. M. L. Rodríguez Fragoso.
Flavio García, 32.
Col. Presidentes Ejidales 2a Sección.
Coyoacán 04470. México, D.F.
E-mail: mlrodrig1@yahoo.com.mx
Received 23 April 2002; Revised 22 July 2002; Accepted 22 July 2002.
Rev Oncol 2002;4(8):443-54
DNA content and cell cycle analysis
in a model of hepatocarcinogenesis
The aim of this study was to quantify DNA con-
tent and to analyze cell cycle on samples of li-
ver tissue from rats with an induced well-diffe-
rentiated hepatocellular carcinoma. For the
study we analyzed and quantified DNA by flow
cytometry. Our results showed the presence of
DNA diploid in all groups during carcinogenesis.
DNA content was normal
independently of the histological features and
the stage of cancer. The analysis of animals in-
cluded in the hepatocarcinogenesis model showed
an increase in the amount of liver cells in prolife-
ration since the se-cond month of treatment. Cell
population in S-phase showed an important incre-
ase between the second and fourth months. It was
also evident an important increase in the G2+M
phase in the sixth and eighth months. Although
there were variations in all phases of cell cycle
throughout hepatocarcinogenesis, it was obser-
ved a constant proliferative activity (S+G2+M
phases) in all process. This hepatocarcinogenesis
model could be used to study the molecular and
cellular alterations present since early stages un-
til the invasion and metastasis.
Key words: cell cycle, diploidy, proliferation, cancer,
and cytometry.
atención de un amplio grupo de investigadores
durante varias décadas. Sin embargo, aunque una
variedad de factores etiológicos ya ha sido iden-
tificada, la alteración a nivel molecular no ha si-
do aún definida. Entre los cánceres humanos el
carcinoma hepatocelular se caracteriza porque,
generalmente, existe la presencia de unas enfer-
medades hepáticas crónicas previas como la hepa-
titis crónica y la cirrosis hepática, en las cuales
el hígado está continuamente regenerándose des-
pués del daño hepático2-4. Esas observaciones han
llevado a pensar que la continua proliferación de
443
 RODRÍGUEZ FRAGOSO L, NIETO RODRÍGUEZ A, CADENA T, ET AL. CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y ANÁLISIS
DEL CICLO CELULAR EN UN MODELO DE HEPATOCARCINOGÉNESIS
las células hepáticas puede causar desórdenes de
genes que están regulando el ciclo celular de es-
tas células y por con-
secuencia conducen al desarrollo de este cáncer.
Una de las características fundamentales de las
células cancerosas es la pérdida de su capacidad
para controlar el crecimiento y la división. Recien-
tes avances en oncología molecular han proporcio-
nado una explicación, a nivel del ADN, sobre la
transformación maligna y el potencial metastático
de varios cánceres5,6. De esos estudios se concluye
que la transformación maligna puede originarse
por mutaciones no reparadas en protooncogenes y
antioncogenes o por daños genéticos ambientales,
infecciosos o de origen espontáneo. Sin embargo,
cualquiera que sea el agente causal, la consecuen-
cia de tales mutaciones se puede manifestar en di-
ferentes sitios de la vía transductiva en las dife-
rentes rutas bioquímicas celulares, desde el
receptor hasta el núcleo. Como consecuencia de es-
to se produce un disbalance en la homeostasis de
las fuerzas reguladoras que promueven y aquellas
que restringen la proliferación celular7-9.
La mayoría de los cánceres tiene alguna anomalía
en los mecanismos que controlan la progresión
del ciclo celular. Por ejemplo, se sabe que en mu-
chos cánceres humanos frecuentemente están al-
terados los mecanismos reguladores del ciclo ce-
lular que controlan la progresión de la fase
G110-13. Asimismo, estudios recientes indican que las
funciones de varios genes que controlan el ciclo
celular están alterados durante la carcinogéne-
sis, y se sabe que esos cambios perturban tanto la
proliferación celular como la estabilidad genó-
mica, promoviendo así la transformación celular
y acelerando el proceso de progresión tumoral.
Aunque han sido encontradas pocas alteraciones
en oncogenes conocidos, hay evidencia que involu-
cra varios supuestos genes supresores en el desa-
rrollo y progresión del carcinoma hepatocelu-
lar. Sin embargo, la mayoría de los genes
afectados no han sido identificados todavía, por
lo que el conocimiento de su existencia se basa en
evidencias circunstanciales relacionadas con pér-
dida de ramas cromosomales14,15.
La cuantificación del contenido de ADN y análisis
del ciclo celular mediante citometría de flujo es
un método conocido y utilizado para el estudio de
las características biológicas y clínicas de varios
tumores ma-lignos16, y parece ser un útil indica-
dor para una variedad de tumores sólidos. En la
mayoría, pero no en todos los tumores, el consen-
so es que la presencia de un tumor aneuploide
predice una pobre tasa de supervivencia. Algunos
estudios de citometría de flujo relacionados con
carcinoma hepatocelular han sido descritos, pero
el resultado del significado del modelo de ploi-
444 Rev Oncol 2002;4(8):443-54
día del ADN ha sido controvertido17,18. Hasta la fe-
cha no hay informes en los que se hayan analizado
las variaciones del contenido de ADN y el ciclo
celular a través de la hepatocarcinogénesis expe-
rimental, por lo que la finalidad de este estudio
fue cuantificar el contenido de ADN y analizar el
ciclo celular en muestras de tejido hepático de
ratas a las que se les indujo químicamente un car-
cinoma hepatocelular bien diferenciado.
MATERIAL Y MÉTODOS
Animales
Se realizó en ratas Wistar macho que pesan de 120 a 150 g
y que fueron mantenidas con una dieta basal estándar
(24% de proteína). Los animales fueron mantenidos en
un ambiente de temperatura y humedad controlados y
expuestos a ciclos alternos de luz/oscuridad por perío-
dos de 12 horas. El alimento y agua fueron administra-
dos ad libitum. Todos los procedimientos experimentales
fueron aprobados por un comité ético.
Modelo de hepatocarcinogénesis
Se utilizó un modelo experimental de hepatocarcinogé-
nesis química con una duración de 12 meses. Los animales
fueron sometidos a un procedimiento de selección descri-
to por Farber y Solt19, ligeramente modificado por Lans
et al20. Brevemente, 220 animales recibieron una dosis
única intraperitoneal de dietilnitrosamina (DEN) (200
mg/kg) disuelto en solución salina. Después de dos sema-
nas los animales fueron alimentados con una mezcla ho-
mogénea de su dieta estándar más 0,02% de 2-acetilamino-
fluoreno (2-AFF), suministrado a libre demanda por dos
semanas (semana 3 y 4). Al término de la tercera semana
los animales recibieron una dosis intragástrica de tetra-
cloruro de carbono (2 ml/kg) en una dilución 1:1 en aceite
mineral. Después de la cuarta semana los animales reci-
bieron una solución al 0,05% de fenobarbital (FB) en el
agua para consumo, la cual ingirieron ad libitum hasta su
sacrificio. Un segundo grupo de 110 animales fue utilizado
como controles sanos, y sólo recibieron fenobarbital en
la misma dosis y vía descrita previamente. Finalmente se
utilizaron tres grupos controles constituido por 20 ani-
males cada uno: el primero recibió DEN y 2-AAF, el segun-
do recibió 2-AAF y CCl4 y el tercero recibió DEN y CCl4.
Asimismo se incluyeron 20 animales que no recibieron tra-
tamiento. No se observaron síntomas de sedación, por
efecto del fenobarbital, en ninguno de los animales a lo
largo del experimento.
Los animales fueron sacrificados en grupos de 4 a 15 en
intervalos de dos meses durante los siguientes 12 meses.
El sacrificio de los animales fue por exsanguinación, pre-
via anestesia con dietil éter. Después del sacrificio se re-
alizó un examen visual post mortem del hígado y del resto
de los órganos en
busca de alteraciones evidentes. Los hígados fueron pe-
sados y cortados con una hoja de bisturí en pequeñas sec-
ciones para revelar tumores no apreciables sobre la su-
perficie del órgano.