Reporte Final de Microbiologia General PDF

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ
INGENIERÍA QUÍMICA
REPORTE DE PRACTICAS
Para la materia de
MICROBIOLOGÍA GENERAL
Presentan
GÓMEZ PÉREZ ANA CECILIA

PESTAÑA SANTIAGO YESSICA LUCIA
SANTIZO VAZQUEZ MANUEL ALFONSO
Catedrático
QBP. EUCARIO ZENTENO VELASCO
TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS DICIEMBRE DE 2012

REPORTE DE PRÁCTICAS. MICROBIOLOGÍA GENERAL
Temas Página
Bacterias
Practica 1.Esterilización y preparación de medios ……………………………………………………….……………………4-12

de cultivo
Practica 2.siembra de microorganismos ………………………………………………………..…………………14-29
Practica 3.morfología colonial y preparación de …………………………………………………………..………………30-34

frotis
Practica 4.tinción de Gram y obs.microscopica …………………………………………………………………….…….36-40
Hongos
Practica 5.siembra, observación e identificación ……………………………………………………………………..……42-54

morfológica de los hongos.
 obs.macroscopica ………………………………………………………………………………..47
 obs.microscopica ………………………………………………………………………………..47
practica 6: esterilización y desecho …………………………………………………………………………..56-62
Bibliografía ………………………………………………………………………………….63
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Practica 1
“Esterilización y preparación de medios de cultivo”
Objetivo:
Conocer los medios de cultivo que se utilizan para el crecimiento de microorganismos demás de
aprender la forma de preparación y esterilización del mismo.
Marco Teórico:
Medios de cultivo.
Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de

microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar
sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y
multiplicarse para dar colonias.
Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas
de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos.
Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno,
dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores
de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. (LÓPEZ, 2006).
Clasificación de los medios de cultivo
o Según su origen:
 NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o

vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se
conoce exactamente.
 SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida
cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
 SEMISINTÉTICOS: son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento
bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de
levadura.
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o Según su consistencia:
 LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.
 SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de

15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae
de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún
elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en
placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar
bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio líquido".
 SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la

motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran disponibles
comercialmente con el agregado de agar.
o Según su composición:
 COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los

microorganismos poco existentes. Es el medio más frecuentemente utilizado para
mantener colonias microbianas. Por ejemplo: agar común o caldo común.
 ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al

cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos,
por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para microorganismos que
tienen grandes exigencias nutricionales.
 SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las

condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos
específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no
interesa. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un grupo de
microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar
microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o
Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos).
 DIFERENCIALES: son medios de cultivos que nos permiten distinguir entre varios
géneros y especies de microorganismos. Por ejemplo si al medio se le ha añadido un
carbohidrato y un indicador y la bacteria que se cultiva es capaz de fermentar dicho
carbohidrato, se produce una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color
del indicador por el cambio de pH. El citrato de Simmons es un medio cuya única fuente
de carbono es el citrato sódico, entonces en él solo crecerán las bacterias capaces de
desarrollarse utilizando como única fuente de carbono ese componente.
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 DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que contienen un agente que inhibe las
especies no deseadas pero que favorece el crecimiento irrestricto del agente
infeccioso. El medio de Muller - Kauffman, permite el crecimiento de Salmonella
inhibiendo a su vez el de numerosos coliformes. Esto es de gran importancia ya que en
ciertas muestras, por ejemplo fecales, el agente infeccioso (Salmonella) es frágil y
puede ser superado en número por agente bacterianos indígenas como E. coli; por lo
tanto antes de realizar las pruebas de laboratorio es necesario aumentar su número con
respecto a ésta en un caldo de enriquecimiento.
Ejemplo de este tipo de caldos son: de tetrationato y selenito. El agua de peptona
alcalina se utiliza para Vibrio cholerae.
Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos:
Cambio de pH:
Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias
producidas por el propio microorganismo; por ejemplo:
 Utilización de carbohidratos ----> Producción de ácidos orgánicos ----> Acidificación

 Catabolismo de proteínas ----> Producción de materiales nitrogenados ----> Alcalinización
Estos cambios pueden llegar a ser tan grandes que inhiban el crecimiento del microorganismo.
Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampón. Uno de los más
utilizados en microbiología es la combinación de KH2PO4 y K2HPO4 tamponando el medio a un pH
de aproximadamente 6.8. Por ejemplo:
Agregando ácido acético para favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil
para la mayoría de las especies que crecen entre 6.5 y 7.2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S.
faecalis a pH 9.6.
Cambio de temperatura:
La mayoría de las bacterias crece óptimamente entre 20º C y 40º C. Los cultivos típicos de
S.Faecalis requieren 60º C de temperatura y los de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a
4º C. Cada especie microbiana posee una temperatura óptima de crecimiento clasificándose según
esto en los siguientes grupos:
I. Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de los

15° C.
II. Mesófilas: crecen mejor entre 25 y 40° C.
III. Termófilas: crecen mejor entre 45 y 60° C.
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Alteraciones osmóticas:
Se acrecientan las propiedades osmóticas un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos
medios intensifican la selección de bacterias halófilas como Staphylococcus spp. (7,5%).
Grado de humedad.
Esterilidad
Protección: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminación microbiana
ambiental. (U.A.B.C, 2000).
Material y equipo:
- 1 mechero
- 1 agitador
- 1 matraz de 500 ml
- 1 balanza
- 1 espátula
- 1 probeta de 250 ml
- 10 cajas de Petri estériles desechables
- Algodón
- 1 pizeta
- Encendedor o cerillos
- Papel estraza
- 1 vidrio de reloj
- Papel kleempack
- Masking
- Papel aluminio
- Plumón indeleble
- Trapo
- Reactivos para el medio de cultivo
-E.M.B.Agar
-Autoclave
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Procedimiento:
El instructor indicará los medios de cultivo que se preparan y esterilizan en esta sesión.
*Técnicas para preparar medios de cultivo
1. Pesar el medio necesario para 210 ml (por equipo). Ponerlo en un matraz.
2. Con una probeta medir 210 ml de agua destilada y añadirla al matraz con el polvo.
3. Agitar el matraz hasta disolver
4. Una vez disuelto colocar casi directo al fuego (poner y sacar), sin dejar que este hierva y agitar
de esta manera por un minuto.
5. Colocamos un tapón de pañalina y cubrimos con papel aluminio.
6. Colocar el matraz en la autoclave (la cual estará prendida previamente, con agua suficiente)
por 30 minutos a 121 lb.
7. Con ayuda de un trapo, sacar el matraz.
8. Vaciar el medio en las cajas Petri estériles siguiendo la técnica aséptica. Las cajas no pueden
estar destapadas a menos que sea entre los mecheros. Las tapas no se tocas por dentro con los
dedos, no se sacan del área de esterilidad.
9. Ya sólidas, se cubren cada una con papel kleempack, se hacen una pila y se cubren
nuevamente con papel kleempack y se envuelven con papel estraza.
10. Se etiquetan con el tipo de medio, equipo, grupo y fecha de elaboración.
11. Guardar en el refrigerador para utilizarlas en la siguiente práctica.
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*Procedimiento simplificado para el uso del autoclave
1. Comprobar el nivel del agua
2. Colocar en su interior el material a esterilizar
3. Atornillar la tapa, apretar los tornillos por parejas diametralmente opuestas de forma que la tapa
encaje perfectamente
4. Abrir la válvula de vapor y encender la fuente de calor
5. Una vez que salga el vapor por la válvula, se espera al menos 5 minutos para expulsar todo el aire y
cerrar la válvula
6. Vigilar el manómetro y la válvula de seguridad. Cuando se alcanza la presión requerida, disminuir la

intensidad de calor
7. Dejar que transcurra el tiempo necesario. Apagar la fuente de calor
8. Esperar que el manómetro descienda a cero, abrir la llave de vapor
9. Esperar 5 minutos y abrir la tapa
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Diagrama de flujo:
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Resultado:
El cultivo que preparamos fue E.M.B. Agar, obtuvimos un medio de cultivo limpio y no tuvo
ningún tipo de contaminación. El color final fue purpura.
Observaciones:
*E.M.B. Agar.
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las
especies de la familia Enterobacteriaceae.
Formula aproximada para 1000 ml de agua destilada (suspender 36 gr en 1 lt de agua):
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un
Lactosa 5.0 litro de agua destilada. Reposar 5
Sacarosa 5.0 minutos; mezclar, calentando a
Fosfato dipotásico 2.0 ebullición durante 1 o 2 minutos
Agar 13.5 hasta su disolución. Esterilizar en
Eosina 0.4 autoclave a no más de 121°C
durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y
Azul de metileno 0.065
distribuir agitando suavemente.
pH final: 7.2 ± 0.2
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*Se realizó un ajuste para preparar 210 ml:
Para 210 ml
36 gr 1000 ml
X  210 ml
X = 7.56 gr
Conclusión:
Al elaborar esta práctica podemos comprender que los medios de cultivo son muy importantes para el
microorganismo, ya que éste le dará los nutrientes necesarios para su crecimiento.
El obtener un medio de cultivo limpio fue muy importante para la realización de la siguiente práctica
que es siembra de microorganismo.
Obtuvimos una gran experiencia debido a que nunca habíamos preparado ningún tipo de medio
cultivo, para siembra de bacterias, entendimos también que el cultivo siempre debe ser preparado
bajo condiciones controladas que permiten verificar sus características en generaciones sucesivas en
tiempos relativamente cortos. Además aprendimos la utilización de la autoclave para la esterilización
de material.
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Práctica 2
“Siembra de microorganismos”
OBJETIVO:
Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petrin,
con el uso de medios selectivos para poder diferenciar dos microorganismos de acuerdo a sus
características que presentan en el cultivo.
MARCO TEÓRICO:
En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una
población de microorganismos, denominada entonces inoculo, de un cultivo crecido a un medio
nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios
previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los monitores de prácticas. La principal
advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes
de convección verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente
alrededor y debajo de la llama.
En Microbiología, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier
tipo de contaminación en el área de trabajo. Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los
medios de cultivos se realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un gabinete de seguridad
biológica, con los protectores de plástico o vidrio para el cuello y la cara, las muestras procesadas se las
debe considerar como potencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente. También se deben
utilizar guantes de goma o látex biológicos. La mesada de trabajo debe estar equipada con todos los
materiales necesarios para efectuar las siembras, también se debe contar con todos los medios de
cultivos necesarios para realizar las siembras.
Como instrumento portainóculos más frecuente se utiliza el asa de siembra, con el que se puede tomar
inóculo a partir de colonias o de medio líquido, debido a que mantiene un pequeño volumen de agua
por tensión superficial. Para depositar el inóculo en líquido basta con introducir el extremo en el medio
y agitar ligeramente. Sobre sólido hay que hacer un recorrido largo sobre la superficie salvo en el caso
del medio TSI, en el que también hay que inocular picando en profundidad para observar reacciones
metabólicas en anaerobiosis.
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Tipos de agar.
 Mac Conkey.
El agar Mac Conkey II es una medio selectivo y diferencial para la

detección de organismos coliformes y patógenos entéricos. Actualmente
existen una gran cantidad de medios diseñados para el aislamiento,
cultivo e identificación de bacterias entéricas. El artículo base sobre el
agar Mac Conkey, uno de los primeros que se desarrollaron, fue
publicado en 1905 y contenía una descripción detallada de su
composición y de los diferentes patrones de crecimiento obtenidos.
La fórmula del agar Mac Conkey II es de 1983 y se diseñó especialmente para mejorar su capacidad de
inhibir el "swarming" de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciación entre fermentadores
y no fermentadores de la Lactosa.
Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentración de sales Biliares, que inhiben el
crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relación con otros medios similares. Se
incluye también cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas,
especialmente estafilococos y entero cocos.
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la
lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los
agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva.
Por fermentación de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del
color del indicador de pH (rojo neutro), la absorción en las colonias, y la precipitación de las sales
biliares.
Siembra
 Sembrar en superficie
 Utilizando la técnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml
de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 ºC.
Incubación
Durante 18-48 horas, a 35-37 ºC, en atmósfera aeróbica
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 XLD.
El agar XLD (Xilosa, Lisina, Desoxicolato) es un medio selectivo diferencial, utilizado para el aislamiento
y diferenciación de patógenos entéricos Gram negativos, especialmente del género Shigella.
Fundamento
La degradación de los carbohidratos presentes en el medio (xilosa, lactosa y
sacarosa) genera la producción de ácido haciendo virar el indicador (rojo
fenol) de rojo a amarillo. En este medio se incorpora la xilosa porque es
prácticamente fermentada por todas las entero bacterias con excepción de
los microorganismos pertenecientes al género Shigella.
La lisina se incluye para aumentar la diferenciación de los microorganismos pertenecientes al género
Salmonella, ya que sin la lisina estos microorganismos rápidamente fermentan la xilosa produciendo la
acidificación del medio y no se pueden diferenciar de otras especies no patógenas. Como la cantidad de
este carbohidrato es limitada, una vez que estos microorganismos lo consumen, comienzan a utilizar la
lisina lo cual produce la alcalinización del medio; este hecho se evidencia porque el rojo fenol
nuevamente vira a un color rojo. En el caso de los coliformes lisina positiva, para prevenir la alcalización
del medio por la utilización de la lisina, se incorpora en el medio un exceso de lactosa y sacarosa.
El medio también tiene la capacidad de detectar la producción de H2S, a través del sistema indicador
tiosulfato de sodio y citrato férrico amonio. Cuando el microorganismo produce H2S se observan
colonias con el centro negro. Los microorganismos no patógenos productores de H2S no descarboxilan
la lisina; cuando están presentes estos microorganismos la reacción ácida producida por la utilización
de los carbohidratos previene en ennegrecimiento de las colonias.
El Desoxicolato de sodio es utilizado como un inhibidor de los microorganismos Gram positivos.
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Interpretación de resultados.
Después de la incubación, registrar el crecimiento de microorganismos. Las características típicas a
observar incluyen: tamaño de la colonia, morfología y pigmentación.
La mayoría de los microorganismos entéricos fermentaran la lactosa para producir ácido, creando
colonias amarillas brillantes habitualmente rodeadas de zonas nebulosas de precipitación de sales
biliares. Por el contrario, las colonias de Shigella son irregulares y rosas/rojas de apariencia. La
salmonela también descarboxilara la lisina cuyos resultados en el mantenimiento del pH neutro y en la
reducción de tiosulfato producirán H2S, creando colonias rosas/rojas con un centro negro. (BD, 2009).
Microorganismos Resultado
E. coli Inhibición parcial
Enterococcus faecalis Inhibición parcial
Salmonella typhimurium Crecimiento
Shigella flexneri Crecimiento
 E.M.B. Agar.
Este medio (también denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram
negativos de rápido desarrollo y escasas exigencias
nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la
familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las fórmulas de Holt-Harris y Teague con
la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el
aislamiento selectivo de entero bacterias y otras especies de
bacilos Gram negativos. La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa,
y aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno; éstos
ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli
y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo metálico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen
centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.
Este medio permite el crecimiento de Candida spp. Como colonias rosadas y puntiformes; la siembra
en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. Crece en este
medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias
oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean
capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporación de azul de metileno a
sus membranas. En este medio se obtiene además, un buen desarrollo de especies de Salmonella y
Shigella.
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Siembra
 En superficie, por estriado a partir de un inóculo poco denso, para obtener colonias aisladas.
 En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubación
De 24 a 48 horas a 35-37 °C, en aerobiosis.
(Cuadro 6). BRITANIA, 2011.

Interpretación de resultados (cuadro 6). Tipo de Colonia
Microorganismos
Escherichia coli Verdosas con brillo metálico y centro negro
azulado
Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis Incoloras
Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri Incoloras
Salmonella typhimurium Incoloras
 AGAR ASM.
Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

diferenciación de estafilococos.
Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a
partir de muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros
materiales de importancia sanitaria.
Fundamento.
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentración salina. Los estafilococos
coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una
zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona
roja o púrpura. Las colonias sospechosas, se repicarán en un medio sin exceso de cloruro de sodio para
efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono,
nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio
(que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora
acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen
ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo.
Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los
estafilococos coagulase positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas
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de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como
colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.
Siembra
 Sembrar en superficie un inóculo denso de la muestra.
Incubación
Durante 18-24 horas a 35-37 °C, en aerobiosis. The American Public Health Association (A.P.H.A)
recomienda la incubación durante 3 días a 32 °C, en aerobiosis.
PRUEBAS BIOQUIMICAS.
 TSI.
Medio universalmente empleado para la diferenciación de entero bacterias, en base a la fermentación

de glucosa, lactosa, sacarosa y a la producción de ácido sulfhídrico.
Siembra
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del
medio.
Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.
Fundamento.
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el
desarrollo bacteriano.
La lactosa, sacarosa y glucosas son los carbohidratos de carbono fermentables.
El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el sulfato de
hierro y amonio ,es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y producen
sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de
fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido.
El tío sulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.
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Características del medio

Medio preparado: rojo. (fig. 4).
 SIM Medio
Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de
hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
El triptófano es un aminoácido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la tripteína,
que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de
enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehído del reactivo de Kovac´s o
de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este
medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.
Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio sólido, sembrar por punción profunda con aguja de
inoculación recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la punción debe
abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra
se realice en línea recta.
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Incubación.
Durante 24 horas, a 35-37 °C, en aerobiosis. Luego de la incubación, agregar 3-5 gotas de reactivo de
Kovac´s o de Erlich.
Interpretación de resultados (cuadro 14).

Cepas móviles: producen turbidez del medio, que se extiende más de la línea de siembra.
Cepas inmóviles: el crecimiento se observa solamente en la línea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo al agregar el reactivo de Kovac´s o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido

sulfhídrico
E. coli + + -
K. pneumoniae - - -
P. mirabilis + - +
S. typhimurium + - +
S. enteritidis + - +
S. flexneri - - -
Limitaciones
En las bacterias aerobias estrictas, que sólo crecen en superficie, la movilidad puede ser difícil de
observar.
Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no
debe confundirse con el color negro debido a la producción de ácido sulfhídrico. (BRITANIA, 2011).
Características del medio.

Medio preparado: ámbar.
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 Lisina Hierro Agar (LIA).
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado
en la decarboxilación / desaminación de la lisina y en la producción de ácido sulfhídrico.
Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo
bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para
detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el
tiosulfato de sodio, son los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de
bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color
violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que
alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina,
tiene lugar en medio ácido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada. Los
microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa,
producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hrs de incubación se
observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La producción de sulfuro de hidrógeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la
formación de sulfuro de hierro. Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de
Morganella, desaminan la lisina, esto produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro
y bajo la influencia del oxígeno forma un color rojizo en la superficie del medio.
Siembra
Por punción profunda con aguja de inoculación.
Incubación
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C.
Interpretación de resultados
a) Decarboxilación de la lisina:
 Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
 Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
b) Desaminación de la lisina:
 Pico rojizo/fondo amarillo.
 Producción de ácido sulfhídrico
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-Prueba positiva: Color en el pico de flauta Color en la base del tubo Ennegrecimiento del medio
Ennegrecimiento del medio
Microorganismos
Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo
Salmonella typhimurium Púrpura Púrpura Positivo
Salmonella enteritidis Púrpura Púrpura Positivo
Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo
Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo
Morganella spp.* Rojo Amarillo Negativo
Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo
Klebsiella pneumoniae Púrpura Púrpura Negativo
Escherichia coli Púrpura Púrpura Negativo
Características del medio. Medio preparado: color violeta.
 Christensen Medio (Urea Agar Base).
Medio utilizado para diferenciar microorganismos en base a la actividad ureásica. Se utiliza para
identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras enterobacterias y estafilococos.
Fundamento
En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de
microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo de fenol es el indicador
de pH.
Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amoníaco y dióxido de
carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este
medio, la fermentación de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo
en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.
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Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos
microorganismos pueden requerir mayor tiempo de incubación. Se recomienda no punzar la capa
profunda para controlar el color.
Incubación
En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °
Interpretación de resultados
Microorganismo Actividad ureásica Color del medio

Proteus mirabilis ATCC Positiva Rojo-Rosado
43071
K. pneumoniae ATCC Positiva débil Rojo-Rosado
700603
Escherichia coli ATCC Negativa Amarillo
25922
S. flexneri ATCC 12022 Negativa Amarillo
S. typhimurium ATCC Negativa Amarillo
14028
Limitaciones
Bacterias que hidrolizan lentamente la urea, como ser Klebsiella, Enterobacter y Citrobacter, viran al
color rojo-rosado de todo el medio de cultivo luego de varios días de incubación.
No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fácilmente. (BRITANIA,
2011).

Medio preparado: amarillo.
24
 Simmons Citrato Agar
Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como
única fuente de carbono y energía.
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato mono amónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es
la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las
sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático. El cloruro de sodio
mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar
citrato como única fuente de carbono, usan sales de amonio como única fuente de nitrógeno, con la
consiguiente producción de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a través del
ciclo del ácido tricarboxílico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato.
Este último, en presencia de un medio alcalino, da origen a ácidos orgánicos que, al ser utilizados como
fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto
es indicativo de la producción de citrato permeasa.
Siembra
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, sembrar en superficie un inóculo ligero, usando un asa sin
arrastrar el agar.
Incubación
A 35-37 ºC, durante 24-48 horas, en aerobiosis. Algunos microorganismos pueden requerir hasta 4 días
de incubación.
Interpretación de resultados:
Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay
cambio de color.
Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Klebsiella pneumoniae ATCC Positivo Azul
700603
S. typhimurium ATCC 14028 Positivo Azul
E. coli ATCC 25922 Negativo Verde
S. flexneri ATCC 12022 Negativo Verde
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Limitaciones
Si se usa un inóculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del verde al
amarillo-amorronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la
visualización azul de un resultado positivo.
Inóculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos.
Cuando se siembra una serie de pruebas bioquímicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la
aguja de inoculación antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre
de materia orgánica puede originar resultados falsos positivos. (BRITANIA, 2011).

Medio preparado: verde
MATERIAL Y SUBSTANCIAS:
 Caja de Petri conteniendo agar nutritivo estéril.

 2 Tubos de ensayo conteniendo agar inclinado.
 Tubos de ensayo conteniendo cultivo mixto.
 Lápiz graso.
 Asa bacteriológica.
 Mechero Bunsen.
 Cerillos ó encendedor.
 Gradilla.
 Estafilococo
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PROCEDIMIENTO
1. Con el lápiz graso dividir la caja Petri en 2 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a
la inoculación.
2. Usando la técnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condiciones asépticas obtener una
azada del material. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla.
3. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material,
trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho. Cerrar la caja.
4. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría.
5. Esterilizar de nuevo el asa, y repetir el paso 3.
6. Incubar a 37°C por 24-48 horas.
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 RESULTADOS:
Preparamos 100 mL de lya con ayuda de la información contenida en la etiqueta:
33 gr 1000 mL
X= 3.3 gr 100 mL
Clasificamos los medios de cultivos con sus correspondientes:
Soya Tripticaseina Citrobacter Problema

Styp 110 Staphylococcus aureus “
2pec Dox Candida “

EMB Coli “
Soya Tripticaseina Mano
CONCLUSION:
Pudimos identificar que nuestra muestra problema era Escherichia coli y que nuestras manos no
siempre están limpias ya que en la mano en la que se puso la Soya Tripticaseina se observaron puntos
blancos y para quitar esas pequeñas manchas se tuvo que lavar esa mano con alcohol y abundante
jabón. Esta práctica nos demuestra que las bacterias están en todas partes y es muy fácil enfermarnos,
además de que la vida de estos microrganismos y los estragos que pueden causar son de vital
importancia, ya que de ellos mismos se pueden elaborar anticuerpos, medicinas y tomar las medidas
necesarias en las prácticas de laboratorio para no sufrir enfermedades. Aprendimos a elaborar los
medios de cultivo y a realizar la siembra de bacterias lo cual nos provoco demasiada emoción ya que
pudimos ver paso a paso las transformaciones y el desarrollo de los cultivos, además de poder ver la
apariencia de las bacterias y aprender con esta experiencia mucho acerca de nuestro organismo y la
vida de los microorganismos.
28
CUESTONARIO
 ¿Para que hacemos un cultivo?
Para hacer crecer un microrganismo o grupos de microorganismos, para el aislamiento e identificación

de los patógenos participantes, nos permite conocer y entender el modo de acción de algunos
antimicrobianos que bloquean una vía metabólica o la síntesis de alguna macromolécula esencial para
la bacteria.
 ¿Qué debe contener un medio de cultivo?
Los medios de cultivo deben contener los nutrientes necesarios para el crecimiento del o los
microorganismos para el cual fue creado. Los microorganismos son muy diversos en cuanto a sus
requerimientos nutritivos.Para construir un medio de cultivo para un organismo o grupo dado, deben
conocerse las necesidades nutritivas de los mismos. Las células microbianas tienen entre un 80% a 90
% de su peso en agua, por lo que éste es un nutriente principal. El peso seco restante contiene una
serie de elementos en diversas proporciones, de los cuales los principales son: H, O, C, N, P y S.
 ¿Cómo se define el crecimiento bacteriano?
El crecimiento bacteriano se define como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos
de la célula. Se trata de un proceso complejo, que supone la replicación de todas las estructuras y
componentes celulares a partir de los nutrientes exógenos.
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30
Practica 3
“Morfología colonial y preparación de frotis”

 OBJETIVO:
Observar las características que presentan las bacterias de acuerdo a su morfología que tienen al
analizarlas en frotis
 MARCO TEÓRICO:
Microscópica
La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular.
Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica
o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas últimas se encuentran:
Treponema, Borrelia y Leptospira (ver figura 1). Las espirilos varían en el número de vueltas,
desde pocas (Borrelia) a muchas (Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas conotras
después de la división celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si el plano de
división es único, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena (microorganismos del género
Streptococcus). Si los planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en tétradas o en
racimos (Staphylococcus). Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos
pueden ser redondeados o rectos; pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras
chinas (Corynebacterium).
31
Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio cholerae). La morfología bacteriana debe ser
observada con el microscopio óptico o el microscopio electrónico, dado el tamaño pequeño de estos
microorganismos. El más usado en el laboratorio es el microscopio óptico de campo claro, pero existen
otros como el microscopio óptico de campo oscuro en los que los organismos aparecen brillantes en
fondo oscuro.
Este microscopio permite la visualización de bacterias difíciles de colorear como el Treponema

pallidum, agente de la sífilis. Las bacterias pueden observarse sin tinción (examen en fresco) si se las
coloca en glicerol o soluciones no acuosas que aumenten el índice de refracción o con tinción usando
distintas coloraciones que mejoran su visualización ya que son células incoloras. Dichas tinciones se
basan en la afinidad que presentan los colorantes por las estructuras bacterianas. Los colorantes
catiónicos por ejemplo, son atraídos por los componentes de carga negativa como los ácidos nucleicos
y los polisacáridos. Ejemplo de este tipo son: el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.
Las coloraciones que se usan para teñir los preparados de bacterias, se pueden dividir en: simples,
diferenciales y especiales. Las primeras, por ejemplo el azul de metileno, nos permiten observar la
existencia de bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de esporos y la existencia de otros
tipos celulares. Las diferenciales (por ejemplo la coloración de Gram y la de Ziehl Nielseen) además de
lo anterior, permiten la diferenciación de las bacterias porque usan diferentes colorantes que se
comportan distinto según el microorganismo en cuestión. Las tinciones especiales se usan para
objetivar distintas estructuras como la cápsula, el núcleo, los flagelos, los esporos, etc.
Antes de la coloración hay que realizar la preparación y la fijación del frotis. La preparación del frotis
consiste en extender homogéneamente la muestra (por ejemplo un cultivo bacteriano) o una
suspensión de la misma sobre una lámina. Una vez preparado el frotis debe secarse y fijarse (por
ejemplo con calor).
Con la fijación del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesión a la lámina
y la conservación de su morfología. Después de preparar y fijar el frotis, se puede realizar cualquier tipo
de coloración (simple o diferencial).
La coloración de Gram es la más usada en bacteriología; debe su nombre a quién la describió en 1884.
Es una coloración diferencial, dado que las bacterias pueden clasificarse según su respuesta en
grampositivas o gramnegativas. Las primeras se tiñen de color azul violeta y las segundas adquieren un
color rosado o rojo. La diferente reacción de las bacterias a la coloración de Gram se relaciona con
diferencias fundamentales de la envoltura celular de estas dos clases de células.
En el cuadro 1 se muestran los colorantes usados, su tiempo de aplicación y la diferente coloración que
adoptan las bacterias grampositivas y gramnegativas en cada paso de la coloración de Gram.
32
MATERIAL Y REACTIVOS:
 Asa de siembra.
 Portaobjetos y cubreobjetos.
 Cultivo a analizar
 Mechero Fisher.
 Espátula.
 Alcohol desnaturalizado.
 Agua destilada.
METODOLOGÍA:
1.-Se realiza una resiembra del cultivo puro para analizar y se inocula durante 24 a 48 horas, es
decir el tiempo en el que aproximadamente la bacteria ya ha crecido y formado colonias separadas.
2.-Después de las cuales de escoge una colonia aislada; para realizar las observaciones. Para la
observación de las características macroscópicas se estudia el tipo de colonia formada por la cepa,
antes mencionada en la teoría.
OBSERVACIONES:
MEDIO DE CULTIVO COLOR

TCL Naranja
LIA Ambar
MIO Morado
SIM Amarillo
SIMTREC E-verde
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 CONCLUSION:
Las colonias fueron caracterizadas morfológicamente en base a color, tamaño, bordes, elevación,
superficie, luz reflejada y consistencia. Para ello hicimos uso de microscópico y de la observación
directa para poder identificar las características que presentaba cada colonia, además de clasificarlas en
base a la investigación que realizo el equipo acerca de la morfología colonial la cual aprendimos a leer y
poder hacer uso de ella para identificar nuestro medio de cultivo.
34
35
Practica 4
“Tinción de Gram y observación microscopia”

OBJETIVO:
Observar las características morfológicas microscópicas de las colonias bacteriológicas y conocer las
técnicas de tinción de Gram, además de poderlas clasificar como positivas o negativas y Observar
microscópicamente los agentes patógenos de un exudado y de una bacteria.
MARCO TEÓRICO:
MORFOLOGÍA
Macroscópica
La mayoría de las bacterias se multiplican rápidamente y son visibles como colonias cuando se las
siembra en medios de cultivo sólidos adecuados. Requieren una incubación de aproximadamente 24
horas en una atmósfera que favorezca su desarrollo, a temperatura óptima. Existen excepciones como
M. tuberculosis, que requiere para su desarrollo de dos a ocho semanas de incubación.
Una colonia está constituida por los descendientes de una o unas pocas células. Las características de la
colonia también dependen de la movilidad de la bacteria. El tamaño puede variar desde 0.5 mm
(Haemophilus sp. o N. gonorrhoeae) a más grandes como las entero bacterias.
La forma de la colonia puede ser circular (Staphylococcus), irregular o filamentosa

(Bacillus). Los bordes pueden ser ondulados (característicos de los bacilos largos como Bacillus
anthracis), en sierra o dentados (Yersinia pestis) o lisos (por ejemplo Proteus vulgaris o Escherichia coli).
La superficie de la colonia también es orientadora y puede ser: plana, convexa, mamelonada,
umbilicada (S. pneumoniae). En relación al pigmento que adquieren, éste puede ser: verde (P.
aeruginosa), amarillo (S. aureus), grisáceo (N. meningitidis).
También es diferente el comportamiento frente a la luz: brillante (Streptococcus) u opaca
(Staphylococcus). Pueden presentar olores particulares como el frutal de P. aeruginosa o el putrefacto
de los anaerobios.
Por último hay que destacar la consistencia: mucoide (M), liso (S) o rugoso (R). Las colonias M tienen
aspecto acuoso, brillante, propio de las bacterias capsuladas o que forman cubiertas polisacáridos
como Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae. Los polímeros
capsulares pueden ser específicos de grupo y son generalmente antigénicos. Entre las bacterias
patógenas, las formas capsuladas suelen ser más virulentas.
36
Por otra parte, las colonias S son de aspecto homogéneo, de textura uniforme y son características de
microorganismos de tipo salvaje recientemente aislados de su hábitat natural como las enterobacterias.
Las colonias R son de aspecto granulado, en general son cepas mutantes que carecen de proteínas o
polisacáridos de superficie. Las formas R de enterobacterias, por ejemplo, generalmente no son
virulentas, en oposición a la mayor resistencia de las bacterias procedentes de colonias S de tipo
salvaje. Un cuarto tipo de colonia es la L y se asocia a la ausencia de la pared celular como resultado de
la exposición a antibióticos; en general estas formas vuelven a sintetizar la pared celular una vez que el
fármaco se extrae del medio.
Las tinciones más frecuente son sales. Las tinciones básicas consiste en un catión coloreado
unido a un anión incoloro, mientras las ácidas constituyen exactamente lo contrario, unido a dos
cationes. Las células bacterianas son abundantes en ácidos nucleicos, los cuales portan cargas
negativas en formas de fosfatos.
Los colorantes ácidos no tiñen a las células bacterias, y por tanto, pueden utilizarse para teñir
al fondo con un color de contraste.
Las tinciones básicas tiñen uniformemente en las células bacterianas, a menos que antes de destruyan
el ARN del citoplasma. También se pueden usar técnicas de tinción especiales para flagelos,
membranas celulares, paredes celulares, gránulos, nucleótidos y esporas.
Tinción Gram.
Una característica taxonómica importante de las bacteria es su respuesta a la tinción a de Gram esta
característica parece ser fundamental, reacción a la tinción se correlaciona a con muchas otras
propiedades morfológicas en maneras relacionadas filogenéticamente. Microorganismo
potencialmente gran positivo puede verse como tal cuando concurre un conjunto de particular de
condiciones ambientales en un cultivo joven. El procedimiento para tinción de Gram se inicia con la
aplicación de un colorante básico el cristal de violeta. Luego se aplica una solución de yodo en este
momento todas las bacterias de tiñen de azul. Continuación las células se tratan con alcohol las células
grampósitiva contienen el cristal violeta-yodo y permanecen de color azul; en cambio las gramnegativa
se descoloran completamente por el alcohol. Por último se aplican un colorante de contraste safranina,
que es un colorante rojo. De esta manera, las células gram negativas, previamente descoloradas,
toman el colorante de contraste y las células gram positivas ahora aparecen púrpura.
Las bacterias gram negativas contienen un gran porcentaje más alto de lípidos que de las bacterias
gram positivas. Las paredes celulares de la bacterias gram negativas son también más delgadas que las
gram positivas con alcohol extrae lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la
pared celular gram negativa.
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MATERIAL Y REACTIVOS:
 Frotis ya realizado
 1 mechero
 Asas bacteriológicas
 Vaso de precipitado de 50 mL
 Cajas Petri
 Campo de esterilización
 Cerillos
 Papel destrasa
 Microscópico
 Soluciones de, cristal violeta
 Solución de yodo-lugol
 alcohol-acetona
 Aceite de inmersión
 Safranina
 Agua destilada
METODOLOGÍA
1. se identifica la colonia aislada a la que se hará la técnica de tinción y se anotan sus

características.
2. Un toque del asa sobre la colonia bacteriana se debe disolver sobre una gota de agua y extender
como una capa fina sobre un portaobjetos.
Se deja secar la preparación y se fija al calor suave.
3. se realiza la Tinción con cristal violeta.
4. se Fija con una solución de yodo-lugol
(todas las bacterias en la preparación permanecen de color púrpura o azul).
5. se decolora con alcohol.
(El alcohol decolora las bacterias Gram negativas y pero no decolora las Gram positivas).
6. por último se lleva a cabo la Tinción de contraste.
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Las bacterias gram positivas están teñidas con cristal violeta y permanecen de color púrpura. Las
bacterias gram negativas se tiñen de color rosa, o simplemente se decoloran.
 RESULTADOS:
MEDIO REACTIVO DE TINCIÓN MOVILIDAD CARACTERISTICAS OBSERVACIONES

TSI Kovacks Arriba(+) Acido, no burbujas de Inmovil, o ligero
gas. desplazamiento hacia
arriba.
LIA Kovacks Abajo(-) Acido Movimiento hacia
arriba, no presento
burbujas.
MIO Kovacks Abajo (-) Color oscuro, presento Movil.
burbujas de gas.
SIM Movilidad Inmovil Descarboxilacion No presento movilidad.
positiva
CITRATO Verde/azul positivo Negativo No presento cambio de Sin desplazamiento.
color.
CONCLUSIÓN:
En esta práctica pudimos identificar las bacterias Gram positivas y negativas, por medio de la técnica de
tinción y observar los macrocultivos, su color, su forma, y su comportamiento. Aprendimos a observar
con ayuda del microscopio las alteraciones debido a la tinción y poder clasificar los cambios.
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CUESTRIONARIO:
 ¿Para qué sirve el aceite de inmersión en un microscópico?
Los objetivos de mayor aumento, tienen una distancia focal muy pequeña y además la primera lente
del objetivo es de pequeño diámetro, los rayos que desde la muestra se dirigen al objetivo atraviesan el
vidrio del cubre objeto y al pasar al aire se separan de la normal.
Algunos rayos incluso sufren reflexión total en la interface vidrio-aire, solo llega al microscopio una
pequeña parte de la luz que parte de la muestra, con el problema que conlleva para la visión.
Al intercalar, entre el objetivo y el cubre objeto una gota de aceite de inmersión, los rayos emergentes
ya no se apartan de la normal, sino que continúan su camino sin desviación, consiguiendo así que una
mayor cantidad de luz llegue al objetivo, mejorando notablemente la visión.
 ¿A que bacterias se les denomina gram-postivas?
Aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram.
Esta característica Química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular por lo que
refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias.
 ¿Porque las bacterias gram negativas no se tiñen de color violeta u oscuro?
Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una
fina pared celular peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan sólo una
membrana lipídica y la pared de peptiglicano es mucho más gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el
colorante durante la tinción de Gram.
40
41
Practica 5:
“Siembra, observación e identificación morfológica de
los hongos.”
Objetivos:
*Identificar las características macroscópicas y microscópicas más distintivas de algunas cepas de

hongos, observando así la organización de sus estructuras reproductoras.
*Utilizar la técnica de inoculación para hongos filamentosos (Rhizopus origosporus, Asprgillus niger,
Penicillium crysogenum ) y puedan ser estos observados macroscópicamente.
*Comparar bibliografías con los resultados obtenidos para la verificación de los mismos.
Marco teórico:
Hongos
Los hongos son organismos multicelulares, es decir que pueden ser unicelulares o pluricelulares, que se
alimenta mediante la absorción, estos vegetales no pueden sintetizar su propios alimentos, viven sobre
otros organismos es por ello que se dicen que son saprofitos o parásitos y forman líquenes. Los hongos
son organismos sin clorofila, por lo que no pueden realizar la función de fotosíntesis, obtienen sus
alimentos en forma directa o indirecta, almacenando sustancias nutritivas.
Los cuerpos de los hongos están formados por unos filamentos llamados hifas en la que podemos
encontrar la materia orgánica donde crece llamada micelio nutritivo. Son inmóviles pero con flujo
protoplasmático en el micelio (Los micelios son masas de filamentos ramificados llamados hifas que
constituyen el hongo). Su ciclo de reproducción es primordialmente sexual y asexual.
Sexual: Todos los hongos con excepción de los hongos imperfectos (Deuteromictos) poseen una
reproducción sexual.
Asexual: esta reproducción ocurre solo en hongos inferiores acuáticos (ficomicetos).
Clasificación
Los hongos son agrupados de acuerdo a diversos criterios que convergen en la taxonomía o sea el arte
de ordenar a los seres según sus interrelaciones fisiológicas, morfológicas o moleculares. A
continuación se indican algunas características de los reinos del dominio Eukarya que contienen a los
diversos hongos y después se muestra un esquema de la división de los hongos en grandes grupos. Los
mixomicetos y mastigomicetos han sido reubicados en los reinos Protozoa y Chromista que incluyen a
los protozoos y las algas respectivamente. (Carlile MJ).
42
Tabla1. Características de los reinos del domino Eucariota que contienen los hongos.
Fig.1 Diversos Tipos de hongos
 Los mastigomicetos son hongos que forman zoosporos. Muchos son saprobios del
suelo que actúan como descomponedores importantes. También se encuentran en
agua dulce así como en aguas residuales. Algunas especies son parásitas de plantas,
algas, peces e insectos, por ejemplo Phytophthora infestans causa el tizón de la
papa. Los quitridiomicetos difieren de los oomicetos, entre otras cosas, en el
número de flagelos de los esporos y la composición de la pared celular. (Carlile MJ)
 Los zigomicetos son saprobios comunes en el suelo. Algunas especies están

asociadas al estiércol y otras, como Entomophthora, son parásitas de insectos.
También incluye hongos asociados simbióticamente con plantas formando
micorrizas vesículo arbusculares, como Glomus y Acaulospora
 Los ascomicetos abarcan hongos miceliales y levaduras. Entre éstas que se

encuentra Saccharomyces empleado en la panificación y la producción de cerveza.
Las levaduras están asociadas a frutas, pero también se hallan en agua dulce y
ambientes marinos. (Deacon JW.)
43
 Los macromicetos están formados por largas hifas ramificados que se reúnen en
cordones rizomorfos y cuerpos de reproducción (ascomas, basidiomas) visibles y
medibles en centímetros. Son organismos saprobios que absorben la materia
orgánica muerta de los residuos donde crecen, o son parásitos de árboles, o viven en
simbiosis con plantas formando ectomicorrizas. Los hay comestibles y venenosos.
Su ciclo de vida es complejo y varía según las clases de hongos. (Deacon JW.)
Tabla3. Clasificación de acuerdo a los caracteres macroscópicos
44
Diversas especies de Hongos
 Penicillum crysogenum
Es el hongo productor de penicilina más conocido y también puede producir algunos alcaloides como la
roquefortina C, meleagrina y chrisogina. Está ampliamente distribuido en la naturaleza, suele formar
colonias verdeazuladas sobre el pan duro y los cítricos, y sus esporas se encuentran frecuentemente en
el polvo doméstico. Se encuentra con frecuencia en los edificios húmedos y mohosos donde deteriora
diferentes materiales de construcción, entre los que resaltan el papel de decoración (crece bien en la
cola empleada para su adhesión a las paredes). No muestra una notable variación estacional. Las
máximas concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las
áreas urbanas que en las rurales). Su temperatura óptima de crecimiento es de 23 °C, pero crece entre
5 y 37 °C.
Es alimento de ácaros como Acarus siro y Tyrophagus pultrescentiae.
Puede encontrase colonizando las vías respiratorias de pacientes con alergias respiratorias y producir
reactividad cutánea. Se han descrito casos de otomicosis, endoftalmitis, queratitis, infecciones
cutáneas, esofagitis, neumonías necrotizantes o infecciones diseminadas en pacientes con neoplasias o
inmunodepresión.
 Asprgillus niger
Aspergillus niger es un hongo que produce un moho negro en vegetales -muy común en la lechuga, el
tomate o la acelga-. Es una de las especies más corrientes del género Aspergillus.
El Aspergillus es un género de alrededor de 200 hongos. Puede existir en dos formas básicas: levaduras
e hifas. El Aspergillus es filamentoso (compuesto de cadenas de células, llamadas hifas, el tipo de
hongos opuesto a las levaduras, que se componen de una sola célula redonda).
Aspergillus niger no causa tantas enfermedades como otras especies de Aspergillus, pero en altas
concentraciones puede producir aspergilosis, que provoca alteraciones pulmonares. Esta enfermedad
aparece con más frecuencia en horticultores, ya que inhalan el polvo del hongo con más facilidad.
Usos
Aspergillus niger se cultiva para varios productos químicos: ácido cítrico (E330), ácido glucónico (E574)
enzimas: glucoamilasa, galactosidasa, fitasa (A. niger var. ficuum), etc.
 Rhizopus oligosporus
Rhizopus oligosporus es un hongo de la familia Mucoraceae que es ampliamente utilizado cultivo

iniciador para la producción doméstica de un producto alimenticio procedente de la fermentación de la
soja que se presenta en forma de pastel. Las esporas producen suaves, blancos micelio, la unión de los
granos juntos para crear un comestibles "torta" de la soja parcialmente fermentado.
Rhizopus oligosporus produce un antibiótico que inhibe bacterias gram-positivas bacterias, incluyendo
la potencialmente dañina Staphylococcus aureus y el beneficio de Bacillus subtilis, incluso después de
que se consume Rhizopus. Esto apoya la evidencia anecdótica de que los que comen con regularidad
tienen tempe menos infecciones intestinales.
45
Material: Reactivos:
 Estufa de incubación.  Medio de cultivo para hongos : PDA

 Cajas Petri de vidrio  Formaldehido 10%
 Varilla doblada en V  Colorantes para la técnica de gram
 Porta objetos.  Colorantes para la técnica de azul de
algodón.
 Cubreobjetos.  Glicerina
 Bisturí.  Desinfectantes.
 Jeringas
 Pinzas de disección. Cepas:
 Vaso de precipitado de 100 ml *Rhizopus oligosporus

 Mechero Fisher. *Aspergillus niger.
 Asa recta de 90° *Penicillium crysogenum
 Asa
 Oroscopio, microscopio
Procedimiento:
Primera parte: Esterilización
1. Preparación de reactivos y medio de cultivo:

a) Solución glicerinada al 5 % (5 ml de glicerina en 100 ml de agua)
b) Agar Sabouraud: Preparar medio siguiendo las indicaciones del reactivo.
2. Preparar las cajas Petri de la siguiente forma:
Colocar una varilla de vidrio en forma de “U” dentro de la caja encima de esta un portaobjetos
y cubreobjetos, cerrar la caja.
3. Colocar las cajas petri preparadas de acuerdo al punto anterior en un cilindro para
esterilizarlas.
4. Esterilizar el medio de cultivo, agua-glicerina, bisturí y pinzas envueltas en papel de estraza y

los cilindros con cajas petri y pipetas en la autoclave a 15 lb/plg2, durante 15 minutos.
5. Guardar y etiquetar los materiales para la siguiente sesión.
46
Segunda parte: Preparación de micro y macro cultivo; Siembra.
Prueba macro:
 Se utilizara dos medios; PDA (2 cajas Petri) y Agar Sabouraud

 Se sembraran los 3 hongos: Rhizopus oligosporus,Aspergillus niger y Penicillium crysogenum
por picadura.
 Tapar las cajas y guardarlas en la incubadora para la siguiente sesión.
Prueba micro:
1. Bajo condiciones estériles y con ayuda de un bisturí cortar cuadros pequeños de agar
aproximadamente de 1 cm X 1 cm.
2. Utilizando las pinzas de disección colocar en cada una de las cajas Petri un cuadro de agar
sobre el portaobjetos.
3. Con el asa estéril inocular por picadura en cada uno de los 4 lados del cuadro de agar hongos
(muestra y aquellos proporcionados por el profesor). Colocar con la ayuda de las pinzas de
disección estériles el cubreobjetos encima del agar.
4. Adicionar agua glicerinada estéril a cada una de las cajas Petri hasta cubrir dos terceras partes
de la varilla de vidrio. Tapar las cajas.
5. Incubar las cajas a 30ºC durante una semana. Verificar que las cajas conserven un nivel
adecuado de agua glicerinada.
Tercera parte: Observación (se realizó una semana después de la inoculación)
1. Se sacan las pruebas macro y micro

2. En la pruebas macro se observa con un oroscopio
3. En la prueba micro se retira el glicerol y se añadirá formol de preferencia con 2 jeringas
esterilizada.
4. Se retira la muestra del medio que se colocó en el porta objeto y el cubre objeto
5. El porta objeto se cubre con otro cubreobjetos y el cubreobjetos se coloca en otro porta objeto
y a estas se le añada unas gotas de azul de algodón.
6. observar al microscopio.
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Diagrama de flujo:
48
*NOTA*: el Penicillium crysogenum no creció.
49
Resultados:
De acuerdo al desarrollo experimental realizado, fue posible identificar mediante su morfología las
diferentes especies evaluadas en la presente práctica:
Tabla1. Características morfológicas de Rhizopus oligosporus de acuerdo al desarrollo experimental.
Rhizopus oligosporus PDA 1) Aspecto de la colonia: consistente, 1) Esporangióforos negros

con denso micelio aéreo, esponjoso, de 8 a 15 μm. Abundantes
algodonosas blancas. rizoides y zigosporas
2) Color del micelio (ambas caras de la esféricas de pared
placa) de la colonia. Anverso: micelio gruesa, desnuda (de hasta
blanquecino. Inverso: transparente 200 μm de diámetro).
3) El micelio de Rhizopus en agar nutritivo 2) Hifas cenocíticas, no
en y las estructuras de negro son tabicadas.
esporangióforos. Fig. 2 y 3
Fig. 1
50
Tabla1.1 Resultado final recopilando datos experimentales y bibliográficos
51
Tabla 2. Características morfológicas de Aspergillus niger de acuerdo al desarrollo experimental.
52
Tabla. 2.1 Resultado final recopilando datos experimentales y bibliográficos
Tabla 3. Características morfológicas de Penicillium crysogenum según bibliografías
53
Observaciones:
* El Penicillium crysogenum no creció; talves fue por el medio en que fue cultivado.
* Una vez terminada la práctica debemos colocar la bata alrevez y tratar de no tener contacto con ella
hasta que sea lavada.
* Tratar de mantener siempre estéril el área de trabajo.
Conclusión:
* Podemos concluir que el medio de cultivo agar papa dextrosa es un medio que permite el
crecimiento de hongos ya que estos se desarrollan en las condiciones óptimas debido a que el medio
contiene nutrientes específicos para los hongos, tal es el caso de ASPERGILLIUM NIGER que se extendió
por todo el medio se tornó oscuro y con un crecimiento abundante
*Los caracteres morfológicos son los más utilizados en la identificación de hongos, ya que su estudio,
sigue siendo el más económico y rápido. Características como el tipo de esporas y las estructuras que
los originan, y la presencia o ausencia de reproducción sexual son utilizadas para definir los principales
grupos de hongos.
54
55
Practica 6:
“esterilización y desecho.”
Objetivo:
Eliminar toda materia peligrosa que pueda intoxicar e infectar al medio y al ser humano en el
área de trabajo.
Eliminar toda forma de vida de un medio o material, lo que se lleva a cabo generalmente por
medios físicos, por ejemplo, filtración, o por muerte de los organismos por calor, productos químicos u
otra vía. Excluye por lo tanto cualquier técnica que resulte solamente en un daño a los microorganismos
o atenuación de la actividad de cualquier tipo.
Marco Teórico:
Existen diversos métodos físicos de esterilización y de inhibición del crecimiento microbiano, como
pueden ser el calor, la filtración y la radiación, pero el más ampliamente usado es el calor, ya sea
húmedo ó seco, los cuales tienen diferente penetrabilidad.
La muerte de las bacterias por el calor es consecuencia de la desnaturalización de sus proteínas.
Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de Hidrógeno), de las proteínas de los cuales
depende su funcionalidad son más lábiles cuando las proteínas están hidratadas que cuando no lo
están, de tal manera que el “calor húmedo” es más efectivo en la desnaturalización de enzimas y otros
componentes proteicos importantes para la célula que el “calor seco”. Es por eso que se dice que el
calor húmedo tiene mayor “penetrabilidad” que el calor seco.
El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal bacteriano y se puede
aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el propósito de matar a las bacterias
que ellos contengan.
Este proceso se flama “Esterilización” y al material, cultivo ó medio de cultivo sometido a éste, se le
denomina entonces “Estéril”, es decir, desprovisto de toda forma viviente.
56
El calor puede ser generado en diversos aparatos y por lo tanto se puede esterilizar por calor húmedo y
por calor seco.
En ambos casos hay numerosos factores que condicionan la efectividad del proceso: Cantidad de agua,
temperatura, presión, tiempo de contacto, superficie de esterilización, pH, “edad” de las bacterias, la
presencia o no de esporas, composición del medio de suspensión, etc.
La esterilización es un proceso esencial para el funcionamiento de un hospital, en el cual se deben

utilizar todos los instrumentos quirúrgicos, implantes y muchos otros dispositivos absolutamente
esterilizados.
Microorganismos viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad

dentro del campo farmacéutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilización de
materiales estériles. Entre éstos podemos destacar:
 La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el propósito de

reducir el riesgo de infecciones en pacientes.
 El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser
utilizado en los laboratorios de microbiología.
 La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos (cultivo
de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis microbiológico de
medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.)
Existen diversos métodos de esterilización. La selección del método a aplicar en cada caso está
determinada por el tipo de producto a esterilizar.
Los métodos de esterilización pueden ser de 3 tipos:
a. Por destrucción total de microorganismos;

b. Por muerte o inactivación; y
c. Por eliminación con medios físicos.
Por destrucción total se entiende un proceso muy violento, que casi siempre implica calentamiento
apreciable del material, como ocurre con la aplicación de una llama, que es lo que hacemos en el
laboratorio cuando flameamos un ansa de platino o las bocas de tubo de ensayo o Erlenmeyer. Otra
manera de destruir contaminantes es con el uso de poderosos agentes oxidantes. Por supuesto ésta
metodología, aunque es efectiva, está muy restringida en su empleo.
La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin que exista necesariamente

desintegración de las células. Se puede efectuar por calentamiento, seco o húmedo, por radiaciones o
por agentes químicos. El calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de
gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria cuando se
esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación. En el caso de los autoclaves, se pueden
alcanzar presiones de 1 a 3 atmósferas. En escala grande el equipo de producción es esterilizado con
vapor saturado bajo presión, y la presión requerida debe ser alcanzada en todas las partes del equipo y
57
el aire debe ser purgado totalmente del sistema (como ocurre también en el caso de los autoclaves)
porque la transferencia de calor disminuye mucho en ese caso. Después de la esterilización se
mantienen las condiciones asépticas, haciendo pasar vapor por las válvulas y sellos.
La eliminación física está restringida a la esterilización de gases líquidos, y es fundamentalmente

llevada a cabo por filtración mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.Los filtros absolutos son de
materiales cerámicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan pequeños que la penetración de
los microorganismos no es posible.
El calor seco o húmedo elimina todas las bacterias combinando adecuadamente factores como la
temperatura a la que se someten y el tiempo de exposición. Se puede esterilizar por calor seco en
estufas a más de 160 °C durante media hora, o por calor húmedo en autoclaves a 120 °C durante 20
minutos y a presión superior a la atmosférica. Esterilización por vapor a presión
La esterilización por vapor a presión se lleva a cabo en un autoclave. Estos equipos emplean vapor de
agua saturado, a una presión de 15 libras lo que permite que la cámara alcance una temperatura de
121ºC. El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas
oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo de esterilización.
Cuando se utiliza este método es importante controlar en el autoclave la relación entre la temperatura,
la presión y el tiempo de exposición, ya que éstos son factores críticos en el proceso.
Entre las ventajas de este método de esterilización tenemos que no deja residuos, las autoclaves
modernas son sencillos de manejar y es un método rápido de esterilización. Éste es el método de
elección para esterilizar materiales termoestables y no sensibles a la humedad como medios de cultivo,
cultivos de microorganismos para descartar, lencería, uniformes, instrumentos quirúrgicos, etc.
Entre sus desventajas están que no permite la esterilización de materiales sensibles al calor y materiales
no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas.
Precauciones
 Antes de comenzar el proceso de esterilización es necesario remover todo el aire de la cámara

del autoclave, porque de lo contrario no se podrán alcanzar las condiciones de esterilización
requeridas debido a que la cámara interna del equipo no podrá ser saturada por el vapor de
agua.
 El tiempo de esterilización se debe comenzar a contar una vez que se han alcanzado los 121ºC
en la cámara interna del autoclave.
 Si se van a esterilizar materiales tales como instrumentos quirúrgicos, equipos, etc. no se
deben cubrir con materiales impermeables al agua como por ejemplo el papel de aluminio,
porque éste no permite que el vapor tenga acceso al material y por lo tanto no se logrará la
esterilización.
 Cuando se coloca el material a esterilizar en el interior del equipo se debe garantizar la libre
circulación del vapor de agua alrededor de todo el material.
58
Para controlar la esterilización por vapor a presión se emplean indicadores físicos tales como
medidores de presión, termómetros, o termógrafos. Aunque estos controles son ampliamente
utilizados, actualmente se consideran métodos secundarios para el control del proceso y son los
indicadores biológicos los que permiten determinar si realmente se llevó a cabo en forma efectiva la
esterilización.
Entre los indicadores biológicos más utilizados para controlar el proceso de esterilización por
vapor a presión, se encuentran las esporas de Bacillus stearothermophilus que son altamente
resistentes a este proceso.
Materiales y reactivos
MATERIALES REACTIVOS
Tubos de ensayo con muestras de mohos. Agua tratada
Cajas de Petri de cristal con inóculos de mohos
Cajas de Petri con muestras de bacterias, etc.
Portaobjetos sucios.
Cubreobjetos sucios.
Pipetas sucias.
Tubos de ensayo con muestras de bacterias.
Lata de metal
Autoclave
Franela
Jabón
Cajas de Petri con agares distintos con cultivos.
59
Procedimiento
1. Trasladar los medios de cultivo preparados en el trabajo práctico Nº 6 a la Sección de Medios

de Cultivo.
2. Colocar los medios de cultivo dentro del autoclave. El material debe colocarse correctamente
dentro del equipo para que permitala correcta distribución del vapor de agua. Para ello se
deben tomar las siguientes precauciones: Distribuir el material en forma ordenada en toda la
superficie interna disponible. Evitar amontonar el material en un área específica. No colocar el
material uno sobre otro. Evitar que el material toque las paredes del autoclave.
3. No preparar cestas con tubos donde éstos se encuentren demasiado apretados.
4. Colocar la ampolla del indicador biológico en el lugar que se considere más difícil que llegue el
vapor.
5. Esperar que se alcancen los 121ºC y comenzar a contar el tiempo de esterilización.
6. Cuando termine el tiempo de esterilización, apagar el autoclave.
7. Esperar que bajen la presión y la temperatura del equipo para abrirlo y retirar los medios de
cultivo. Si alguno de los medios se requiere en forma biselada (inclinado), en este momento se
colocan sobre una superficie que permita obtener el grado de inclinación deseado.
8. Retirar el indicador biológico e incubarlo bajo las condiciones que señale el fabricante.
9. Esperar que el material alcance la temperatura ambiente antes de almacenarlo.
10. Después del periodo de incubación observar las características del indicador biológico.
Manejo de autoclave:
1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. Si no hay suficiente, agregarla
hasta que casi llegue a la parrilla inferior.
2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien colocado para evitar
algún problema y cerrar la puerta ajustándola bien. Debe de quedar herméticamente cerrado.
3. Abrir la válvula de salida de vapor y encender la fuente de calor del autoclave.
4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termómetro), empezará a salir una mezcla
de vapor-aire por la válvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que solo
salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado; a ésto se le flama purgar el
autoclave.
5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la válvula de salida de vapor y dejar que la presión suba
hasta 15 libras por pulgada cuadrada (vigilar el manómetro), lo que proporciona una
temperatura de 121 °C. Observar que no es la presión del autoclave lo que mata a los
60
microorganismos sino la elevada temperatura que puede alcanzarse cuando el vapor de agua
se somete a presión.
6. En ese momento empezar a contar el tiempo.
7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presión, apagar la fuente de calor y dejar que el

autoclave se enfríe sólo (no abrir la válvula de salida de vapor), hasta que la presión haya
bajado a 0 libras.
8. Abrir el autoclave y sacar el material.
Resultados
Los desechos no contaminados (no infecciosos) pueden reutilizarse o reciclarse o eliminarse como si
fuera basura en general.
Del material contaminado (potencialmente infeccioso) después de ser tratado en autoclave, se obtuvo
material esterilizado, desinfectado e inhibida la capacidad reproductora de bacterias, levaduras y
mohos, por lo que ya se pudo lavar todo el material utilizado en las prácticas anteriores.
También se limpió la autoclave y la pulimos.
Cuestionario
1. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el Horno de calor seco y en el
Autoclave Dar ejemplos.
En el horno: pipetas, bisturís, cristalería que pueda ser utilizada a peso constante o material que puede
eliminarse la contaminación a flama directa.
En autoclave todo material para utilizar en laboratorio, objetos que se utilizan en la vida cotidiana como
biberones para bebe, etc y material infeccioso como son muestras de bacterias, mohos, levaduras, etc.
para lograr una buena descontaminación.
2. ¿Por qué es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la esterilización?
Porque de lo contrario no s lograría eliminar la actividad de los microorganismos y porque está

comprobado científicamente que a los 15-20 min con la presión de 15 libras por pulgada cuadrada y a
una temperatura de 121°C es cuando se alcanza la esterilidad de materiales.
61
Conclusión
Consideramos desecho todo aquello que debería descartarse o eliminarse para ya no ser utilizado
nuevamente. En los laboratorios, la descontaminación y eliminación de desechos son operaciones
estrechamente relacionadas. En el trabajo cotidiano, son pocos los materiales contaminados que es
preciso retirar del laboratorio o destruir. La mayor parte de la cristalería, los instrumentos y la ropa del
laboratorio vuelve a utilizarse o se recicla, y que el principio básico es que todo material infeccioso ha
de ser descontaminado, esterilizado en auto clave o incinerado en el laboratorio.
62
BIBLIOGRAFÍAS:
ADACHI JA. Enteroaggregative Escherichia coli. [En línea]. Disponible en:

http://www.bvsops.org.uy/pdf/coli.pdf. (Consultado el 25/11/11).
Dr. VELASCO FERNANDEZ, DAVID. Microbiología. [En línea]. Disponible en:

http://danival.org/micro.html. (Consultado el 24/11/11).
GARCIA MARTOS PEDRO. Microbiología clínica práctica. 2a. Ed. ED. Servicio
Publicaciones UCA. 1994. España. Pág. 52-54.
LABORATORIOS BRITANIA. S.A. Medios de cultivo. [En línea]. Disponible en:

http://www.britanialab.com/. (Consultado el 23/11/11).
LÓPEZ TÉVEZ, LEONOR. Medios de cultivo. [En línea]. Disponible en:

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf. (Consultado el 24/11/11).
MADIGAN T. MACHAEL. Brock, Biología de los microorganismos. 10a. Ed. ED.

Pearson, Prentice hall.2004. México. Pág. 747, 794.
PUMAROLA A. Microbiología y Parasitología Médica. 2a. Ed. ED. Salvat. S. A.

España.1995. Pág. 333-340.
BERNARD D. DAVIS. Tratado de microbiología: con inclusión de inmunología y

genética molecular. 2a. ed., 1978. Barcelona: Ed. Salvat.
63

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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TUXTLA GUTIÉRREZ

GÓMEZ PÉREZ ANA CECILIA

QBP. EUCARIO ZENTENO VELASCO

TUXTLA GUTIÉRREZ, CHIAPAS DICIEMBRE DE 2012

Practica 1.Esterilización y preparación de medios ……………………………………………………….……………………4-12

Practica 3.morfología colonial y preparación de …………………………………………………………..………………30-34

Practica 5.siembra, observación e identificación ……………………………………………………………………..……42-54

practica 6: esterilización y desecho …………………………………………………………………………..56-62

Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de

Clasificación de los medios de cultivo

 NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o

 LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.

 SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de

 SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la

 COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los

 ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al

 SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las

 Utilización de carbohidratos ----> Producción de ácidos orgánicos ----> Acidificación

I. Psicrófilas: capaces de desarrollarse a 0° C o menos. Su temperatura óptima es alrededor de los

*Técnicas para preparar medios de cultivo

1. Pesar el medio necesario para 210 ml (por equipo). Ponerlo en un matraz.

3. Agitar el matraz hasta disolver

5. Colocamos un tapón de pañalina y cubrimos con papel aluminio.

7. Con ayuda de un trapo, sacar el matraz.

10. Se etiquetan con el tipo de medio, equipo, grupo y fecha de elaboración.

11. Guardar en el refrigerador para utilizarlas en la siguiente práctica.

*Procedimiento simplificado para el uso del autoclave

1. Comprobar el nivel del agua

2. Colocar en su interior el material a esterilizar

4. Abrir la válvula de vapor y encender la fuente de calor

6. Vigilar el manómetro y la válvula de seguridad. Cuando se alcanza la presión requerida, disminuir la

7. Dejar que transcurra el tiempo necesario. Apagar la fuente de calor

8. Esperar que el manómetro descienda a cero, abrir la llave de vapor

9. Esperar 5 minutos y abrir la tapa

Formula aproximada para 1000 ml de agua destilada (suspender 36 gr en 1 lt de agua):

Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones

*Se realizó un ajuste para preparar 210 ml:

El agar Mac Conkey II es una medio selectivo y diferencial para la

(Cuadro 6). BRITANIA, 2011.

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y

Medio universalmente empleado para la diferenciación de entero bacterias, en base a la fermentación

Características del medio

Interpretación de resultados (cuadro 14).

Microorganismo Movilidad Indol Producción de ácido

Características del medio.

 Lisina Hierro Agar (LIA).

En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 °C.

Características del medio. Medio preparado: color violeta.

 Christensen Medio (Urea Agar Base).

En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 °

Microorganismo Actividad ureásica Color del medio

Características del medio.

 Simmons Citrato Agar

Microorganismo Citrato permeasa Color del medio

Características del medio.

 Caja de Petri conteniendo agar nutritivo estéril.

4. Esterilizar el asa flameándola y mientras que se enfría.

5. Esterilizar de nuevo el asa, y repetir el paso 3.

6. Incubar a 37°C por 24-48 horas.

Preparamos 100 mL de lya con ayuda de la información contenida en la etiqueta:

Clasificamos los medios de cultivos con sus correspondientes:

Soya Tripticaseina Citrobacter Problema

2pec Dox Candida “

NOTA: el Penicillium crysogenum no creció.