Bacillus firmus como agente de control biológico de Phytophtora Capsici Leo.

En
Jitomate (Lycopersicon esculentum Mill)

Julián Yesid Morales Galindo

Andrés David Moreno Fonseca

Lady Marcela Rodríguez Romero

Roger Alexander Viasus Rodríguez

Resumen

El estudio se basó en el aislamiento de cepas de la bacteria Bacillus Firmus para el control

biológico de Phytophtora Capsici Leo, como alternativa al uso de productos agroquímicos que
tienen un efecto dañino tanto en el ambiente como en el mismo rendimiento y calidad del cultivo.
Se hicieron pruebas para analizar el comportamiento de dichas cepas para el tratamiento del
hongo en la variedad de jitomates “Rio grande”, y su influencia en el desarrollo y crecimiento de
las plántulas y semillas, bajo condiciones controladas de laboratorio, alterando distintas
variables que pudiesen influir en el desarrollo de los ensayos como el tipo de suelo, cantidad de
nutrientes, temperatura, entre otros. Para lo anterior también se realizó una categorización de
las cepas, dependiendo de sus características, tipo de metabolismo y condiciones óptimas de
cultivo, y conjuntamente se usó una especie de Pseudomona y elementos testigos, para
corroborar cambios en los ensayos y resultados de cada uno de ellos.

Metodología

Primer ensayo: Inhibición de crecimiento de Phytophtora Capsici por aislamiento de

Bacillus

En el centro de una placa con PDA, se sembró un empaste de micelio con de Phytophtora
Capsici; posteriormente, alrededor del centro aproximadamente a 25 mm a la redonda, se
sembraron 8 puntos con los distintos tipos de cepas. Con lo anterior, se realizaron 5 tratamientos
con 10 repeticiones cada uno, bajo las siguientes relaciones:

 B2 Vs Phytophtora Capsici:
 B3 Vs Phytophtora Capsici
 B10 Vs Phytophtora Capsici
 Pseudomona Syringae Vs Phytophtora Capsici
 Solo Phytophtora Capsici (testigo absoluto)

Con dichas pruebas se consiguieron los siguientes resultados con respecto al diámetro de la
colonia y la reducción del crecimiento:

Phytophtora Capsici
 Cepa de Bacillus Diámetro de la colonia Reducción del
(mm) crecimiento (%)

B2 43 41

B3 49,1 34

B10 54,2 33,8

Pseudomona 63,6 14,3

Testigo 74,2 0

Segundo ensayo: Valoración del filtrado de las cepas atingencias

Inicialmente se realizó una curva de crecimiento de cada una de las cepas, para determinar las
condiciones óptimas de desarrollo; las cepas se sembraron en un tubo de ensayo con PDA y
se incubaron a 28 °C durante 24 horas, después de las cuales se les agregó a cada uno una
solución de NaCl a 0,15 M; luego se aplicó el procedimiento de conteo en placa cuyo resultado
en todos los tubos fue de 1x108 UFC.

Posteriormente se tomó 1ml de cada tubo y se inoculó en un 1 Litro de Caldo Papa Destroxa,
se incubaron a 28°C con agitación de 170 rpm por 48 Horas; una ez finalizada la incubación se
removieron las células bacterianas por centrifugación a 7000 rpm durante 40 minutos; el
sobrenadante se filtró en papel Wattman No.1, y el filtrado se esterilizó en autoclave a 15 lb de
presión durante 15 minutos, antes de ser utilizado en las pruebas de valoración de la actividad
antagónica. Además se hizo el mismo procedimiento para el cultivo de la Pseudomona Syrigae,
y de Phytophtora Capsici, esta última junto con bioensayos, con el fin de evaluar el
comportamiento del hongo ante el filtrado, lo cual se hizo utilizando el método de difusión en
agar en discos de papel.

Una vez obtenidos estos filtrados, se realizó el mismo procedimiento que en el primer ensayo,
pero en este caso se hicieron 6 tratamientos:

 Filtrado de B2 Vs Phytophtora Capsici

 Filtrado de B3 Vs Phytophtora Capsici
 Filtrado de B10 Vs Phytophtora Capsici
 Filtrado de Pseudomona Vs Phytophtora Capsici
 Filtrado de B2+B3+B10 Vs Phytophtora Capsici (con el fin de evaluar posibles
condiciones de sinergismo)
 Testigo (en donde solo se usó el medio de cultivo)

Con el procedimiento anterior se tuvieron los siguientes resultados:

Phytophtora Capsici
 Filtrado Diámetro de la colonia Reducción del
(mm) crecimiento (%)

B2 64,6 -7,9

B3 73,5 +5,7

B10 66,8 -3,48

B2+B3+B10 74,2 +6,8

Pseudomona 76,2 +9,6

Testigo 69,5 0

Tercer ensayo: Efecto de Bacillus sobre la germinación de semillas de jitomate de la

variedad “Rio Grande”

El cultivo se obtuvo mediante el procedimiento anterior, el cual tenía 3,7x108 UFC; se

desinfestaron las semillas con Hipoclorito de sodio 2%, se lavaron con agua estéril y se
sumergieron en el líquido del tratamiento correspondiente durante 5 minutos; luego se eliminó
el exceso de líquido y se sembraron en semilleros que contenían suelo esterilizado en autoclave,
los cuales estuvieron en el invernadero durante 35 días a una temperatura de 22,5 °C, y
semanalmente a cada planta se le aplicaron 5 ml de los 3 tratamientos correspondientes:

 B2+B3+B10
 Medio de cultivo sin inóculo
 Testigo (Agua estéril)

Cada tratamiento consto de 5 repeticiones con 10 plantes y a los 20 días se registró el

porcentaje de germinación y a los 35 días se extrajeron las plantas para determinar Volumen
de raíz y peso seco.

A partir de los ensayos se tuvieron los siguientes resultados:

Tratamiento Germinación Volumen Raíz Peso seco del follaje

% %y % %y % %y

B 57,4±2,6 60 0,46±8,3 87,5 7,8±1,7 83,9

Mc 37,9±8,1 54 0,37±9 34,4 5,1±2,9 21,2

Testigo 35,9±8,4 0 0,24±3,3 0 4,2±1,9 0

(Agua)
%y. Porcentaje de crecimiento respecto al testigo

Cuarto ensayo: Efecto del cultivo bacteriano en el desarrollo de plantas de jitomate cv

Rio Grande inoculadas con P.capsici

Inicialmente se procedió a recolectar muestras de suelo de una parcela infectada con P.capsici,
el cual luego de una caracterización en laboratorio, arrojó los siguientes resultados, sobre su
composición física y química:

Composición física (%) Características químicas

Arcilla Limo Arena Materia pH Conductividad N P K

Orgánica (mmhos/cm) Total (ppm) (mg/100)
(%)

55,8 30,6 13,9 3,3 7,8 0,7 0,14 25 2,8

Posteriormente, el suelo se mezcló y dividió en dos partes iguales, de las cuales una se
pasteurizó con vapor de agua y la otra no; a la primera se le llamó suelo pasteurizado y al otro
suelo no pasteurizado. Luego, en bolsas negras con 6 kg de tierra, se trasplantaron 4 plántulas
de jitomate de 35 días de edad y dos semanas después se inocularon con 30000 zoosporas (de
P.capsici) por planta; además antes de la inoculación y luego 24 horas después de la misma,
las plantas se inundaron con agua.

Con respecto al tratamiento con el cultivo bacteriano, a algunas se les aplicó una dosis semanal,
mientras que a otros solo una dosis después de la inoculación; y además se tuvo como testigo
de esta prueba, el medio de cultivo Papa Dextrosa sin inocular. En total fueron 12 tratamientos:

- SP(suelo pasteurizado)+Pc+1B(1 sola aplicación de Bacillus)

- SP+Pc+ASB(aplicaciones semanales de Bacillus)
- SP+Pc+ASM(aplicaciones semanales del medio)
- SP+Pc
- SP
- SNP(Suelo no pasteurizado)+Pc+1B
- SNP+Pc+ASB
- SNP+Pc+ASM
- SNP+Pc
- SNP
- SNP+ASB
 - SNP+1B

Cada tratamiento constó de cinco repeticiones con las 4 plantas respectivamente, las cuales se
mantuvieron a una temperatura promedio de 23°C, durante 90 días y se fertilizaron cada 15
días con solución de nitrofoska (4 g/L de agua)

A partir de los contrastes y comparaciones de las combinaciones tratamientos, se obtuvieron

los siguientes resultados:

Contrastes con grupos de tratamientos No. Severida Volumen Peso seco

Plantas d Radical del Follaje
Muertas (cm) (gr)

Xx vs Xy Xx vs Xy Xx vs Xy Xx vs Xy

1) SPx V SNPy 1 vs 0,5 6,3vs 2,7 4 vs 8,4 3,3vs7,9

s
Tratamientos Tratamientos

SP+Pc+1B SNP+Pc+1B

SP+Pc+ASB SNP+Pc+ASB

SP+Pc+ASMC SNP+Pc+ASMC

SP+Pc;SP SNP+Pc;SNP

SNP+ASB;SNP+1B

2) SP+Pc+Bx V SP+Pcy 1,1vs1,2 7,4vs 7,6 3,7vs 2,4 2,8vs1,7

s
Tratamientos Tratamientos

SP+Pc+1B SP+Pc

SP+Pc+ASB

3) SNP+Pc+Bx V SNP+Pcy 0,8vs0,7 4,6vs 4,5 8,37vs10,2 7,3vs13,1

s
Tratamientos Tratamientos

SNP+Pc+1B SNP+Pc

SNP+Pc+ASB
4) SP+Bx V SNP+By 1,1vs0,4 7,4vs 2,3 3,7 vs 10,9 2,8 vs 7,4
s
Tratamientos Tratamientos

SP+Pc+1B SNP+Pc+1B

SP+Pc+ASB SNP+Pc+ASB

SNP+ASB

SNP+1B

5) SP+Pc+Bx V SNP+Pc+Bx 1,1vs.85 7,4vs 4,3 3,7 vs 8,4 2,8 vs 7,2

s

Tratamientos Tratamientos

SP+Pc+1B SNP+Pc+1B

SP+Pc+ASB SNP+Pc+ASB

6) Pc+1Bx V Pc+ASBy 0,9 vs 1 6 vs 5,9 3,9 vs 8,1 3,1 vs 6,9

s

Tratamientos Tratamientos

SP+Pc+1CB SP+Pc+ASB

SNP+Pc+1CB SNP+Pc+ASB

7) SP+Pc+1Bx V SP+Pc+ASBy 1vs1,15 7,3vs 7,4 2,8 vs 4,5 2,4 vs 3,2

s

Tratamientos Tratamientos

SP+Pc+1B SP+Pc+ASCB

8) SNP+Pc+1Bx V SNP+Pc+ASBy 0,8vs0,9 4,8vs 4,3 5 vs 11,7 4 vs 10.6

s

Tratamientos Tratamientos

SNP+Pc+1B SNP+Pc+ASB

9) ASMx V Sin ASMy 1,2vs0,5 7,3 vs 3 4,12 vs 9,3 3,6 vs 7,5

s
Tratamientos Tratamientos
 SP+Pc+ASMC SNP+Pc

SNP+Pc+ASMC SP+Pc

SP

SNP

10) SNP+ASBx V SNPy 0 vs 0 0 vs 0 13,5vs 12,8 7,6 vs 6,7

s

Tratamientos Tratamientos

SNP+ASB SNP
x y.
Indican para cada comparación, la media del grupo de tratamientos del lado izquierdo y
derecho, respectivamente

Quinto ensayo: Caracterización de las cepas B2, B3 y B10 de Bacillus

Se realizaron análisis morfológicos y fisiológicos a través de pruebas bioquímicas para

determinar características básicas de las cepas, cuyos resultados fueron los siguientes:

Cuadro…: Caracterización bioquímica de las cepas B2, B3 y B10 de Bacillus sp.

Prueba B.firmus B2 B3 B10

Tinción de Gram + + + +

Forma de la Elipsoide Elipsoide Elipsoide Elipsoide

espora

Crecimiento - - - -
anaerobio

Prueba Voges - - - -
Proskauer

Utilización de:

D-glucosa + + + +

L-arabinosa - - - -

D-xylosa - - - -
 D-mannitol + + + +

Hidrólisis de + + + +
almidón

Hidrólisis de + + + +
caseína

Reducción d + + +
hidrato

Crecimiento:

En NaCl al 7% + + + +

A 10°C d + + +

A 50°C - d d d

A 55°C - - - -

Utilización de - - - d
citrato

Crecimiento a Nd + + +
pH 5,7

Hemólisis de Nd - - -
sangre

Motilidad Nd + + +

Peptonización Nd + + +
de leche
tornasolada

Hidrólisis de Nd + + +
gelatina

Prueba positiva = +. Negativa = -, no determinada = nd, variable = d (+ o -)

Análisis de datos

En la mayoría de las pruebas se realizó con análisis de varianza ANOVA para distinguir las
diferencias entre los tratamientos y para comparar medias se usó la prueba de Tukey; además,
la prueba sobre el efecto de Bacillus en el crecimiento en el desarrollo de plantas inoculadas
con P.capsici se analizó con SPSS.
Discusión

El uso de Bacillus firmus para esta prueba se basó en el hecho de que este microorganismo
puede ser considerado como bacteria que se encuentran en el suelo (por lo que es bastante
común de encontrar) y que mediante producción de metabolitos favorece el crecimiento de las
plantas o genera una acción inhibitoria sobre plantas dañinas del entorno.

A partir de los resultados ya mencionados, se pudo afirmar que en gran medida las capacidades
que tienen las cepas de Bacillus para inhibir el crecimiento pueden deberse a producción de
enzimas líticas, antibióticos y/o metabolitos que generan cambios en la membrana
citoplasmatica, aunque también se puede deber a la inhibición de germinación por competencia
de nutrientes.

Además con la prueba de los filtrados se observó que dichos filtrados no tuvieron gran efecto
sobre el crecimiento de P.capsici, quizás porque no se alcanzaron los niveles apropiados para
inhibir el crecimiento del patógeno o que se necesitan células vivas para desarrollar la acción
inhibitoria del patógeno, o posiblemente debido a que algunos antibióticos y toxinas pueden
inactivarse debido a la exposición a altas temperaturas, por lo que el filtrado pudo inactivar su
efecto. Lo anterior también pudo verse influenciado por el medio de cultivo, por lo que otro tipo
de medio pudo ser más o menos efectivo para el crecimiento de estos organismos.

Con la prueba de suelos pasteurizados y no pasteurizados, se observó que con los primeros,
es posible que por el tratamiento se hayan modificado propiedades químicas del suelo, así como
la disminución de la porosidad lo cual no permitió el desarrollo de la raíz, además se pudo haber
eliminado algunos microorganismos presentes en el suelo, que pueden servir en procesos de
control biológico de P.capsici.

Por último, la realización del quinto ensayo, fue importante para para identificar las
oportunidades y las limitaciones del uso de estas en procesos de control biológico.