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Protocolo de investigación
PRESENTA:
LOPEZ QUIROZ DELMAR ERNESTO
CONTENIDO
1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 3
2 ANTECEDENTES ................................................................................................................................ 4
2.1 Familia Theophrastaceae .......................................................................................................... 4
2.1.1 Genero Bonellia ...................................................................................................................... 5
2.1.2 Bonellia macrocarpa .............................................................................................................. 5
2.2 Cultivo de células vegetales ...................................................................................................... 6
2.3 Raíces transformadas ................................................................................................................ 6
2.4 Metabolitos ............................................................................................................................... 7
2.4.3 Metabolitos secundarios ........................................................................................................ 7
2.5 Bonediol .................................................................................................................................... 8
2.6 Cultivo de células vegetales en biorreactor .............................................................................. 8
2.7 Agitación y estrés hidrodinámico .............................................................................................. 9
2.8 Biorreactor Airlift. ..................................................................................................................... 9
2.9 Vectores de oxigeno ................................................................................................................ 10
3 JUSTIFICACIÓN................................................................................................................................ 12
4 OBJETIVOS ...................................................................................................................................... 12
4.1 Objetivo general ...................................................................................................................... 12
4.2 Objetivos específicos ............................................................................................................... 13
5 MATERIALES Y METODOS............................................................................................................... 14
5.1 Material vegetal ...................................................................................................................... 14
5.2 Medio de cultivo Murashige y Skoog ..........................................Error! Bookmark not defined.
5.2.1 Sales principales (macronutrientes) .....................................Error! Bookmark not defined.
5.2.2 Sales menores (micronutrientes) .........................................Error! Bookmark not defined.
5.2.3 Vitaminas ..............................................................................Error! Bookmark not defined.
5.3 Establecimiento de crecimiento y cinética en matraz agitado de raíces transformadas ....... 14
5.3.1 Establecimiento de crecimiento y cinetica en matraz agitado de raíces transofrmadas con
vectores de oxigeno ...................................................................................................................... 14
5.4 Caracterización hidrodinámica del airlift ................................................................................ 14
5.4.1 Determinación del tiempo terminal de mezclado ............................................................... 15
5.4.2 Determinación del coeficiente de retención de gas (Eg) ...................................................... 15
5.4.3 Determinación del diámetro de burbuja (db) ....................................................................... 15
5.4.4 Determinación del área interfacial de contacto gas-líquido (a´) ......................................... 15
5.4.5 Determinación teórica del coeficiente volumétrico de transferencia de oxigeno .............. 15
5.5 Establecimiento de crecimiento y producción cinética en biorreactor airlift de raíces
transformadas ............................................................................................................................... 16
2
5.5.1 Establecimiento de crecimiento y producción cinética en biorreactor airlift de raíces
transformadas con vectores de oxigeno ....................................................................................... 16
6.0 METODOS ANALITICOS................................................................................................................ 17
6.1 Identificación y cuantificación de bonediol de raíces transformadas..................................... 17
6.3 Cuantificación de sustrato....................................................................................................... 17
Referencias ........................................................................................................................................ 17
Cronograma de activdes ............................................................................................................... 20
1 INTRODUCCIÓN
El potencial que ofrecen las plantas como fuente de productos de interés industrial es
enorme ya que en estas se sintetizan una gran variedad de compuestos químicos. Sin
embargo, solamente se ha estudiado un porcentaje reducido de todas las especies
existentes del planeta (Talou, Alvarez, & Giulietti, 1994)
La transformación genética de especies vegetales es un mecanismo que actualmente es
ampliamente utilizado dentro del campo del Fitomejoramiento. Este mecanismo permite
insertar genes foráneos dentro de una célula de un tejido vegetal receptor para la
3
generación de plantas genéticamente modificadas, conocidas también como plantas
transgénicas (Blanco, Valverde, & Gómez, 2003).
La transformación de las raíces tiene fundamentalmente dos aplicaciones: la producción de
biomasa con alta velocidad de crecimiento, capaces de sintetizar metabolitos secundarios
de utilidad y por otra parte representa una valiosa herramienta para la estimulación de la
rizogénesis en especies recalcitrantes (Torres, 2017).
Las raíces transformados son organismos heterótrofos y que realizan el proceso de
respiración, por lo que necesitan del oxígeno para la generación de energía así como para
procesos metabólicos por lo cual es uno de los grandes retos al realizar el escalamiento de
cultivos de raíces transformadas es el oxígeno que debe estar presente en el medio debido
a que se encuentra muy limitado ya que existe una resistencia a la transferencia de masa
de la fase liquida a la fase solida lo cual afecta al crecimiento de las raíces (Smita & Ashok,
2012)
Al igual que todos los tejidos vegetales, las raíces responden al ambiente, especialmente
O2, CO2 y etileno. El oxígeno es el menos solubles de los tres gases y su solubilidad disminuye
con el aumento de la temperatura y los otros componentes de un medio de cultivo.
Comparado con el caso de células, la estructura compleja de las raíces proporciona muchas
barreras para transporte de gas, resultando en condiciones de agotamiento de oxígeno
disuelto (Yu & Doran, 1994)
2 ANTECEDENTES
4
Theophrastaceae se encuentran en la parte norte del Neotrópico, y están particularmente
bien representados en Mesoamérica y el área del Caribe (Ståhl & Källersjö, 2004; Tellez &
Dávila, 1997).
5
Figura 1 Hojas y flores de Bonellia macrocarpa (Ståhl & Källersjö, 2004)
6
2.4 Metabolitos
Cuando se habla de metabolitos se refiere a aquellas sustancias o extractos que se obtienen
a traces de plantas los cuales sintetiza para su desarrollo, mantenimiento y crecimiento. Los
metabolitos pueden ser clasificados desde la naturaliza química de los componentes como
orgánicos e inorgánicos. (Kuklinski, 2000)
Los metabolitos que se acumulan principalmente en el tejido (intracelular) presentan un
desafío para el proceso de extracción ya que el tejido debe ser homogenizado para que el
metabolito pueda ser extraído y purificado partiendo de una solución compleja. Por otro
lado, los metabolitos que se acumulan en el medio (extracelular) se encuentran en un medio
químicamente menos complejo (Cuadro 1).
Las regulaciones de las rutas metabólicas básicas son aquellas que dan origen al
metabolismo secundario de las plantas, dando lugar a una serie de compuestos que puedes
ser responsables de colores, sabores, aromas, actividad medicinal o venenosa. Estos
metabolitos se pueden acumular dentro de las células o ser expulsado al medio que rodea
a la planta.
7
2.5 Bonediol
Cammal et al (2011), reportaron la estructura de un nuevo alquil catecol asignado como 4-
metoxi-3-undecil-benceno-1,2-diol y nombrado como bonediol (Fig.2). Este fue el primer
reporte realizado para el aislado de este compuesto en Bonellia macrocarpa
8
Existe una serie de biorreactores usados generalmente para el cultivo de plantas (Fig.
3), el de tanque agitado es el más utilizado para los cultivos de células vegetales, aunque
también se han realizado cultivos en airlift y reactores de columna de burbujas.
Figura 3 Esquemas de reactores más utilizados para el cultivo de tejidos vegetales a. Tanque agitado b. airlift c.
Columna burbujeante d. Spray e. Reactor burbuja tipo balón f. Reactor de imerion temporal g. Reactor de imersión
tempral de raices h. Tambor (Ozlem & Aynur, 2010)
9
con el gas y se le denomina zona ascendente o riser, a la otra zona se denomina descendente o
downcomer. La división de las zonas conduce a una diferencia de densidades entre ambas regiones
con lo cual se origina la recirculación del medio en el reactor, la separación de estas dos zonas son
las que hacen que sean efecticos en la suspensión de células y en la transferencia de oxigeno (Choi,
Chisti, & Moo., 1996)
Los biorreactores tipo airlift presentan ventajas de diseño para el crecimiento de células vegetales,
ya que combina una buena transferencia de masa con alto contenido de partículas sólidas, mezclado
eficiente, esfuerzo de corte relativamente bajo, consumo menor de energía y diseño (Sajc, Grubisic,
& Novakovi, 2000)
La primera aplicación de los biorreactores airlift, data de principios de los años 50. La utilización de
este tipo de biorreactores requiere de un diseño para procesos en particular, a diferencia de los
biorreactores de tanque agitado que pueden ser adaptados para cada proceso y alterar las
condiciones sin mucha dificultad, en cambio los biorreactores tipo airlift no ofrecen muchas
posibilidades de variar las condiciones de trabajo. (Martíez, 2007)
Por lo general el aire suministrado al reactor es suficiente para actuar como la una fuente de
moviente del liquido (Doran, 1995; Lee, 2002)
Figura 4 Principales configuraciones de reactores airlift (a) Airlift de tubos concéntricos (b) Airlift de cilindro
seccionado (c) Airlift de recirculación externa (Chisti & Moo-Young, 2002)
10
transferencia de oxigeno de la fase gaseosa a las células vegetales sin la necesidad para el suministro
de energía extra. Por lo que un enfoque prometedor para resolver el problema de la transferencia
de oxigeno son los vectores que pueden actuar como agentes que disminuyen la tensión superficial
del agua e incrementar el área de contacto para la transferencia de la fase gaseosa . (Shiru, Mingxia,
Prihardi, Z Yongzoo, & Mitsuyazu, 1997) a través de algunos estudios se ha observado que la adición
de una solución no acuosa puede inducir un aumento significativo de la tasa de transferencia del
oxígeno del aire a las células sin requerir de un incremento en la agitación de la mezcla. Por lo cual
los vectores de oxigeno son una buena opción para mejorar la disponibilidad del oxígeno al tejido el
efecto de diferentes vectores de oxigeno se encuentra en el rango del 1 al 4% (v/v) (Shiru, Mingxia,
Prihardi, Z Yongzoo, & Mitsuyazu, 1997; Smita & Ashok, 2012)
11
3 JUSTIFICACIÓN
A través de una búsqueda iniciada el mes de agosto del año 2017 en el portal Scopus sobre
el tema de cultivo de raíces transformadas se logra observar una tendencia de incremento
en el interés científico sobre este tema. Sin embargo, pocas especies de plantas han sido
estudiadas, de las cuales la mayoría tiene la capacidad de producir compuestos de interés
de nivel industrial para diversos sectores.
Por el momento no existe ningún reporte sobre trabajos realizados para raíces
transformadas de Bonellia macrocarpa para ninguna condición propuesta en este trabajo,
además de que actualmente se han realizo estudios sobre las propiedades medicinales de
compuestos producidos por Bonellia macrocarpa. Cammal Fuentes y col. en 2011 usaron
bonediol sobre líneas celulares tumorales donde mostró una cierta actividad y selectividad
sobre las células cancerosas.
Las raíces transformadas se han considerado como una matriz biológica para varias
funciones biotecnológicas durante las últimas tres décadas dado que son competentes para
un crecimiento virtualmente infinito bajo condiciones de crecimiento controlado
(Mehrotra, 2015).
Existe poca información sobre la influencia del oxígeno para la producción de biomasa y/o
metabolitos en cultivo de raíces y a la fecha no existe ningún reporte sobre el oxígeno como
sustrato limitante sobre la producción de biomasa y bonediol en Bonellia macrocarpa.
4 OBJETIVOS
12
Estudiar el efecto del oxígeno disuelto sobre el crecimiento celular y la producción de
Bonediol en cultivo de raíces transformadas de Bonellia macrocarpa en biorreactor airlift.
13
5 MATERIALES Y METODOS
5.1 Material vegetal
Se emplearán raíces transformadas de Bonellia macrocarpa del laboratorio de cultivo de
tejidos vegetales del instituto tecnológico de Tuxtla Gutiérrez resultados del trabajo de
investigación del M.C. Luis Alberto Ramírez Inducción a raíces transformadas de Bonellia
macrocarpa (Cavanilles) Ståhl & Källersjö mediante Agrobacterium rhizogenes.
14
5.4.1 Determinación del tiempo terminal de mezclado
Contenido el reactor el volumen de operación (Vop) y operando con un flujo constante de aire (Fa) el
tiempo terminal de mezclado es el tiempo que transcurre desde la adición instantánea (pulso) de
una alícuota de ácido (o de azul de metileno) hasta la estabilización del pH del medio (o la
homogenización del color del medio), medido con ayuda de un electrodo de pH (Chun-Chong, Wen-
Teng, & Shih-Yuan, 2003)
Donde:
ni= número de veces que se presenta un diámetro determinado.
dbi= valor del diámetro de las burbujas (cm).
Para determinar los diámetros, el reactor se pondrá en operación con agua coloreada con azul de
metileno a gastos de aire de 1 a 8 LPM y se tomaran fotografías digitales del reactor operando a
dichas velocidades del gas. A estas fotografías se les realizara un análisis con un software
especializado (Freehand 10). (López E. G., 2004).
𝐴𝑑 −2
𝑘𝐿𝑎 = 0.76 (1 + ) 𝑈𝐺𝑅 0.8
𝐴𝑟
15
𝐴𝑑 −12 𝑃𝑔 0.8
𝑘𝐿𝑎 = 0.00055(1 + )
𝐴𝑟 𝑉
Donde:
𝑈𝐺𝑅 2
𝑃𝑔 = 𝑄𝑔 𝜌𝑔 (𝑅𝑇𝑙𝑛(1 − 𝛼) + )
2
𝑃𝑡𝑜𝑝 = 𝑃𝑎𝑡𝑚 + 𝑃 𝑖𝑛
16
6.0 METODOS ANALITICOS
6.1 Identificación y cuantificación de benediol de raíces transformadas
Se realizará la extracción utilizando el método propuesto por Caamal Fuentes et al (2011) usando 3
g de raíces transformadas secas con maceración a temperatura ambiente con MeOH (3 x 150 ml)
durante 24 h. El sobrenadante será filtrado al vacío por medio de un evaporador rotatorio para
obtener un extracto seco. El extracto seco será suspendido en 10 ml de MeOH para análisis
posteriores. Se utilizará un equipo HPLC modelo Flexar (Perkin Elmer, Shelton CT, EE. UU.). Las
muestras se inyectarán en una columna ZORBAX ODS (5 μm x 250 mm x 4,6 mm) (Agilent
Technologies). Las fases móviles serán agua desionizada con 0.05% de ácido fórmico (A) y
acetonitrilo con 0.05% de ácido fórmico a 60/40 (v / v) (B) y el gradiente programado será el
siguiente: inicia con 30% A, cambio de 30% a 5% A en 5 min y constante 5% A durante 15 min más.
Una post-ejecución de 1 min de 100% B para limpiar la columna entre análisis. El flujo constante
suministrado será de 0,8 ml/min y se inyectaran 20 μL de las muestras del auto muestreador.
La curva de calibración para la cuantificación se comparó con el patrón de Bonediol, que se aisló,
purificó y caracterizó previamente por análisis espectral (UV, IR, 1D y 2D NMR, y MS)
REFERENCIAS
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17
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Yu, S., & Doran, P. M. (1994). Oxygen Requirements and Mass Transfer. Biotechnology and
Bioengineering, 880-887.
19
Cronograma de actividades
2018 2019
Noviembr
eDiciembr
Octubre
Febrero
Febrero
Agosto
Agosto
Marzo
Marzo
Enero
eEnero
Mayo
Mayo
Junio
Junio
Abril
Abril
Julio
Julio
Sept
Actividades
Revisión
bibliográfica
Estandarizaci
ón de
técnicas
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz sin
vectores
Preparación
de
estándares
Definición de
diseño
experimental
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz con
vector
(Tween 80)
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz con
vector
(Peróxido)
Establecimie
nto de
cultivo en
matraz con
ambos
vectores
20
Análisis de
resultados y
caculo de
parámetros
cinéticos
Caracterizaci
ón del
biorreactor
obtención de
parámetros
cinéticos en
biorreactor
Análisis de
resultados y
caculo de
parámetros
cinéticos
Redacción de
artículo y
tesis
21