Microscopía óptica:

instrumentación y
principios

Autor:

Jaime Rodríguez R.,

Compound Microscope, circa 1751

 Microscopio óptico compuesto
Ocular
(adaptador para
Cabezal los ojos)
Revolver
Objetivo
Estativo
Platina móvil
Macrométrico
condensador
Micrométrico
Lente de campo
(fuente luminosa)

Control de
iluminación

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 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Fundamentos técnicos de la microscopía óptica

Óptica (lentes) Iluminación

Aumentos
Campo visual
Resolución Contraste
Profundidad de
campo
Enfoque

5
 Refracción

La luz se dobla en ángulo cuando incide Al igual que un vehículo cambia su

en una superficie dirección cuando entra en un terreno de
gravilla

Pavimento
Aire Cristal suelto

Esta primera
rueda frena

Onda
incidente

La
componente Pavimento Eje
que incide perpendicular
primero consolidado
se ralentiza La onda se comprime y se
primero dobla en el límite del medio
que produce la desaceleración

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 Aumentos y Orientación I
Posición Imagen
Las líneas de puntos son actual aparente
perpendiculares a la
superficie de la lente
Una lente biconvexa
Dirección de curva la luz en la misma
la luz dirección cuando entra
y cuando sale
Frog gastrula, saggital section; arrow indicates
yolk plug
rápido lento rápido

Dirección del Dirección

movimiento aparente

Punto focal abajo

arriba
Objeto Imagen
real proyectada

izquierda derecha

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Aumentos y Orientación II

¿Por qué una lente de aumento simple

no produce una imagen invertida?

Con el objeto más cerca de la lente que del punto focal,

los rayos de luz divergen dando al observador la ilusión
de que está viendo un objeto más grande, más alejado,
pero en la misma orientación..

object

focal
point

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 Aumentos

Aumentos finales
usando una lente
simple (por ejemplo un
estereomicroscopio)

40x 100x 400x

La misma imágen:
usando un
microscopio óptico
compuesto

40x 100x 400x

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Resolución
0.61λ
Resolución (d) =
n sin α
λ = Longitud de onda de la luz; n = índice de refracción

0.2 µm
Escala de
resolución
teórica 5 µm 2 µm

1 µm 0.4 µm

Escala de
resolución
de una 1
µm

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Campo visual y profundidad de campo

Volumen tridimensional Profundidad de campo

Teniendo en cuenta los cambios del aumento a diferentes aumentos

escala = 5 mm
cubreobjeto (#1) 0.15
mm thick

Profundidad de una
Volumen de espacio observado
típica muestra 100x
montada en humedat 40x
40x 0.1 mm
400x

100x 1000x
Grosor del portaobjeto
normal
400x 1 mm

1000x

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 Campo visual e intensidad de la luz
Aumento final 100x 400x 1,000x

Demasiado Correcto correcto Correcto

brillante Demasido
Campo aparente: Demasido
(izquierda) Sin ajustar el brillo oscuro oscuro
(derecha) Después de compensar
con el control de intensidad

Aumento del objetivo

10x 40x 100x

Quantity of
light

Diámetro de
campo real 2 mm 0.5 mm 0.2 mm

Área 3 mm2 0.2 mm2 0.03 mm2

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El contraste y el condensador
Vista superior de un condensador con Apertura del condensador: tres posiciones
selector de filtros

Totalmente
cerrado

Resolucióny
contraste
Vista lateral del condensador optimizados

Totalmente
abierto

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Contraste y variación en el condensador
Tres imágenes de Paramecium caudatum (vacuolas alimentarias con células de levadura)

Contraste bajo Contraste óptimo Alto contraste

A (Izquierda) Bacillus thuringinensis con C

endosporas: (A) campo claro; (B)
Contraste de fases (400x)

(derecha) Pseudopodo de Chaos

B (Pelomyxa) carolinensis: (C) campo D
claro; (D) campo oscuro (100x)

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Enfocando multiples surperficies

objetivo

Esquema no a
escala

Foco inicial por

encima de la
preparación
Preparación

Condensador
abierto para una
mayor claridad
Dirección del
enfoque

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 Observando a través del especimen
Enfocando a través de un filamento de Spirogyra (400x)

Siguiente Siguiente
paso paso

Células superiores enfocadas Cloroplastos enfocados justo Aproximadamente a la

debajo de la pared celular mitad de la célula

Siguiente Siguiente Siguiente

paso paso paso

Enfoque en el centro de la Alcanzando el fondo Cloroplastos enfocados justo

célula encima de la pared celular

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Microscopía con aceite de inmersión

Aumentos en seco Aceite de inmersión

Diffracción La difracción es
severa que minimizada con el
compromete una uso de aceite de
buena inmersión
resolución

A B
A: Bacteria at 400x B: Bacteria at 1000x Con
Aumentos en seco un objetivo de inmersión
mostrando una imagen (Porción central del
borrosa (Resolución campo de visión de A)
pobre)

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Uso del objetivo de inmersión

1 2 3 4

Enfocar en seco con el Mover el revólver y Colocar una gota de Colocar cuidadosamente el
objetivo de mayor dejarlo en una posición aceite de inmersión objetivo de inmersión sobre el
aumento. entre dos objetivos sobre el espécimen espécimen

5
Disposición de aceite sobre el cubreobjetos

Colocación de aceite sobre un frotis (sin cubreobjetos)

La punta del objetivo debe
estar completamente
embebida en el aceite.
Y ya se puede
observar

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Enfoque con un objetivo de inmersión

Correcto – solo es Demasiado cerca –

Demasiado lejos, necesario un buen mover la platina hacia
mover la platina hacia enfoque abajo
arriba

Alto o bajo
correcto
Imagen no visible Imagen no visible

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Ajuste de los oculares
Separación de los ojos Enfoque del ocular
(girar para enfocar)

centro
Totalmente Imagen doble Totalmente
abierto cerrado

Girar para extender el

tubo del ocular

Ajustar para una sola imagen

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 Lentes sucias?
Si ve marcas contra un campo Si las marcas no están en Manchas fuera de foco pueden
vacío, mueva la muestra de la preparación, girar el aparecer en el condesador. Para
izquierda a derecha ocular saberlo

... si se mueven, ... si se mueven ...si alejamos el

las manchas indica que las condensador
están en la marcas están en estas estarán
preparación el ocular mas fuera de foco

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 Comparación de los
distintos tipos de
microscopía óptica

Autor:

Jaime Rodríguez R.,

Ph.D.
Adaptación:

Dave Caprette
 Comparación de los tipos de microscopía óptica
Spirogyra Bacillus Amoeba proteus
Campo
claro

Campo
oscuro
(top) bright field
(bottom) D.I.C.
Contraste 400x
fases

“D.I.C.,”
(off axis
condenser)

100x except as noted 400x 40x

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Microscopía de campo claro

Imagen de la Campo
Objetivo muestra* claro

muestra

platina

Condensador

Control de diafragma Diámetro del

campo visual

Filtro de luz de día

*Volvox (fixed and stained)
Fuente de
iluminación

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Microscopía de campo oscuro

Imagen de la Campo
Objetivo muestra* oscuro

Luz
dispersat muestra

Platina

condensador

Filtro opaco
Diámetro del
campo visual
Filtro luz de día

Fuente *yeast cells in suspension

luminosa

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 Microscopía de contraste de fase
Imagen
proyectada Objetivo Membrana halo
(no se plasmática
esquematizan
Luz alterada todos sus
por la muestra componentes

Luz no Placa de fase

obstaculizada muestra
Platina
plasmagel Vacuola
Condensador allimentaria
plasmasol con
gránulos
Diafragma
anular Muestra: Chaos (pelomyxa) carolinensis
Diafragma visto pseudopodium, 400x
(Fuente de luz no mostrada) desde arriba

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Microscopía Contraste Interdiferencial
(Nomarski)

Polarized light
a
Dirección de la vibración (luz que llega al
observador)

(a) (b) (c)

b
(a) luz blanca (no polarizada)
(b) Filtro polarizador
(c) Luz polarizada Amoeba proteus (100x):
(a) imagen de campo claro; (b)
D.I.C. Efecto obtenido al ajustar el
condensador

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 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Otros ejemplos: Huevo de insecto con campo claro

© N. Ubero-Pascal

28
Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Huevo de insecto con campo oscuro

© N. Ubero-Pascal

29
 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Huevo de insecto con contraste de fases

© N. Ubero-Pascal

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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Detalle de un huevo de insecto con contraste de fases

© N. Ubero-Pascal

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Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Huevo de insecto con contraste interdiferencial (DIC) Nomarski

© N. Ubero-Pascal

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 Técnicas de microscopía aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesión 2 Máster en Ciencias Forenses

Créditos de las Ilustraciones / Pictures copyright

• Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia: Dirección web: http://ocw.um.es/
• Logo encabezamiento. Autor: Musarumana: Dirección web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Microscopio_gif.jpg
• Diapositivas 3-4 y 6-27 adaptadas de las presentaciones de D.R. Caprette: “Light Microscopy: Instrumentation and Principles” y “Light Microscopy: comparison of
optics”, publicadas on line en BioEd Online. Disponible en la página web: http://www.bioedonline.org/presentations/index.cfm#presentation32
• Las figuras A, B, C y D de las páginas 29 a32 son de Nicolás Ubero

Nicolás Ubero Pascal 33