Manual Microbiología II

Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología II
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA II

1ª. EDICION
MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

Manual de Prácticas del Laboratorio de Microbiología II 2
Miguel Angel Aguayo López

Rector
Ramón A. Cedillo Nakay

Secretario General
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
Francisco I. Lepe Aguayo
Director General de Educación Superior
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO
José Gerardo Cerrato Oseguera
Delegado Regional No. 4
Carlos Eduardo Monroy Galindo

Director General de Planeación y Desarrollo Institucional
Daniel Jaramillo Cano

MANUAL DEdel
Director PRACTICAS
Plantel
LABORATORIO DE
Mario Alberto MICROBIOLOGIA
Gaitán Hinojosa II
OCTAVO del
Coordinador SEMESTRE
PE de QFB
Joel Vázquez Galindo
Coordinador Académico del PE de IQA
1ª.Valentín
EDICION – 2009
Ibarra Galván
Coordinador Académico del PE de IQM
Ana Lilia Peraza Campos
Coordinadora Académico del Programa de Posgrado
Patricia Campos Pulido

Asesora
ESTUDIA Pedagógica
- LUCHA-TRABAJA
Ma. Rosario Moreno Véjar

Secretaria Administrativa
MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

Miguel Ángel Aguayo López

Rector
Ramón A. Cedillo Nakay

Secretario General
Juan Calos Yánez Velazco

Coordinador General de Docencia
Carlos Eduardo Monroy Galindo

Director General de Educación Superior
José Gerardo Cerrato Oseguera

Delegado Regional No. 4
Martha Alicia Magaña Echeverría

Director General de Planeación y Desarrollo Institucional
Daniel Jaramillo Cano

Director del Plantel
Mario Alberto Gaitán Hinojosa

Coordinador del PE de QFB
Patricia Campos Pulido

Asesora Pedagógica
Juan Carlos Morales Ramírez

Secretario Administrativo
Mario Alberto Gaitán Hinojosa

Profesor de la Materia
INDICE
No. DE
NOMBRE DE LA PRACTICA PAGINA
PRACTICA
DIRECTORIO 3
INDICE 4
PRESENTACIÓN 6
Consideraciones Generales para su Protección
8
Personal
Medidas de Bioseguridad 11
Elementos propuestos para que se Integren a una
13
Práctica
Control de Calidad 16
Toma, Menejo Y Transporte de Muestras 19
1 Preparación de Medios de Cultivo 29
2 Obtención de Bacterias en Cultivo Puro 32
Prueba de Susceptibilidad a los Antimicrobianos
3 (Antibiograma) 36
4 Diagnóstico de Infecciones de Nasofaringe y Faringe 44
5 Estudio Bacteriológico del Esputo 48
6 Hemocultivo 57
Diagnóstico bacteriológico de las Vías Urinarias
7 (urocultivo) 67
Diagnóstico de las Enfermedades Bacterianas del
8 Aparato Gastrointestinal (Coprocultivo). 76
Infecciones del Aparato Genital (Exudados Vaginales,
9 Uretrales y Prostáticos) 90
10 Líquido Cefalorraquídeo y Otros Líquidos de Derrame 96
BIBLIOGRAFIA 103
ANEXO I. Tinciones 104
ANEXO II. Pruebas de Identificación Bacteriana 106
Anexo III. Medios de Cultivo 112
NOMBRE DEL ALUMNO(s)

Y NUMERO DE CUENTA
FACULTAD
AÑO
GRUPO
SEMESTRE
PRACTICAS APROBADAS
PROMEDIO
MAESTRO
PRESENTACION
El manual de Microbiología II está enfocado a la Bacteriología Médica

Diagnóstica y conjunta el esfuerzo académico y científico de los
integrantes de la academia de Análisis Clínicos, con la intención de
ofrecer un texto útil con una función de referencia y adecuada a las
condiciones de trabajo de los estudiantes de la carrera de Químico
Farmacéutico Biólogo.
Este manual está dirigido a los estudiantes que optan por el área de la
Bacteriología Médica Diagnóstica de la carrera de QFB donde se imparte
dentro de su currícula la asignatura de Microbiología II, Microbiología
Médica o Bacteriología Médica. Además, puede servir como una fuente
de información y consulta para estudiantes de otras áreas de la salud,
para químicos, médicos e infectólogos.
El manual está organizado de tal manera que cada práctica incluye una
introducción actualizada de los temas que desarrolla, haciendo énfasis
sobre el aspecto diagnóstico de laboratorio. También se plantea un
objetivo, el material mínimo y se hace una descripción metodológica que
permite el correcto aislamiento, identificación y diagnóstico de las
especies bacterianas más comunes de interés médico.
Consideramos que este manual va a servir de guía a los estudiantes en

lo referente al trabajo bacteriológico que se desarrolla en el laboratorio
de microbiología, así mismo es útil para aprender y comprender la
importancia de la toma de muestra y su siembra en medios de cultivo
adecuados; el aislamiento, identificación y caracterización de las
bacterias. Estos resultados son fundamentales para determinar el patrón
de susceptibilidad a los antimicrobianos y para interpretar la importancia
de las bacterias aisladas.
En virtud de que este manual esta dirigido a estudiantes de las ciencias

de la salud y manejarán microorganismos en la realización de las
prácticas experimentales, es de vital importancia incluir al principio
recomendaciones generales relacionadas con los lineamientos
generales del laboratorio y los principales procedimientos que deberá de
aprender, así como las medidas de bioseguridad indispensables para
que sean capaces de manipular los microorganismos en forma
adecuada sin comprometer su seguridad ni la de sus compañeros.
El manual de prácticas está compuesto de 10 experimentos. Estas 10

prácticas están priorizadas para realizarse de acuerdo al programa
teórico de la materia de Microbiología II que se lleva a cabo en el octavo
semestre de la carrera de Químico Farmacéutico Biólogo en la Facultad
de Ciencias Químicas dependiente de la Universidad de Colima.
Cada parte experimental contempla los objetivos y competencias, una

introducción para una mejor comprensión del tema a tratar, material y
reactivos a utilizarse así como el procedimiento para la realización de la
práctica, complementándose con figuras, cuadros, cuestionario y
bibliografía recomendada.
Como parte complementaria del manual de Microbiología se presentan

en forma de anexos, la preparación de tinciones (Anexo I), pruebas de
identificación bacteriana (Anexo II) y preparación de medios de cultivo
(Anexo III) indispensables para la elaboración de cada una de la
prácticas.
Finalmente, considero que el manual será una herramienta

indispensable tanto para maestros del área como alumnos para
complementar el contenido teórico de la materia, ya que fue elaborado
de acuerdo al material y reactivos de laboratorio que se disponen en un
almacén común del área de la salud, la infraestructura del laboratorio de
Microbiología y a la programación semestral del curso con 4 horas
prácticas por semana.
M. en C. Mario Alberto Gaitán Hinojosa

Coordinador del PE de QFB.
CONSIDERACIONES GENERALES PARA SU PROTECCION

PERSONAL
1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas para el trabajo

correcto del laboratorio.
2. Todas las muestras de especímenes biológicos deben considerarse

potencialmente peligrosos.
3. Todos los alumnos deben usar permanentemente una bata de

laboratorio limpia y abotonada durante el tiempo que esté en el interior
del laboratorio.
4. Está absolutamente prohibido: fumar, ingerir líquidos (agua, refresco,

etc.) o comer dentro del laboratorio así como ponerse cosméticos ni
tocarse la cara con las manos o algún otro objeto.
5. No deberá sacar del laboratorio equipo, cepas o medios de cultivo

contaminados.
6. No poner ropa o libros sobre la mesa de trabajo, ni guardar material de

laboratorio (cultivos) en las bolsas de las batas.
7. Los membretes o etiquetas deben ser humedecidos con agua y no con

la lengua. El asa y porta-asa deben ser esterilizados en la flama antes y
después de su utilización. Calentar el asa verticalmente (no
horizontalmente). Si esta cubierta con algún material, séquese al lado de
la flama antes de esterilizarla para evitar el chisporroteo del material y su
diseminación.
8. Al inicio y al final de la práctica limpiar y descontaminar las mesas de

trabajo y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el
material infectado. Colocar todo el equipo en su sitio.
9. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón antiséptico y

abundante agua una vez terminada la práctica, incluso si sale antes de
la terminación de la misma por breves momentos.
10. No se permite la visita personal de personas ajenas a la práctica ya que

puede ocasionar distracción del estudiante poniendo en riesgo la
seguridad en el trabajo que se realiza.
PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO
1. Comprobar que las llaves del gas y del agua estén cerradas antes de
salir del laboratorio.
2. En caso de cualquier accidente personal (herida personal o incendio) o

del material de trabajo, notifíquese inmediatamente al maestro o al
instructor. En caso de derrame de caldos o medios de cultivo debe
primero conservar la calma y colocar servilletas o toallas de papel sobre

el material derramado para evitar su dispersión y verter abundante
solución desinfectante sobre las toallas como cloro, yodo, fenol o benzal
en cualquier sitio o implemento que accidentalmente se haya
contaminado. Dejarlo actuar por lo menos 30 minutos, retirar las toallas y
tirarlas en el contenedor destinado a la eliminación de material
contaminado.
3. No se debe pipetear con la boca. Usar siempre pipetas automáticas o

micropipetas.
4. Todos los procedimientos se deben efectuar con cuidado para no formar

aerosoles o contaminar áreas limpias. De preferencia hay que trabajar
en una campana de flujo laminar.
5. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente con un

desinfectante después de trabajar con muestras clínicas, material
contaminado y animales infectados.
6. Todo el material sucio debe ser manejado con guantes.
7. Hay que separar las pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados

del resto de material sucio y colocarlos en un contenedor punzocortante.
8. A todo el material contaminado de desecho se le deben quitar etiquetas

y cintas adhesivas; se colocan en bolsas rojas para que no derramen los
caldos o el agar fundido y se colocan en un carro para su transporte al
área de esterilización.
9. Las pipetas contaminadas se sumergen en una solución de hipoclorito

de sodio durante 30 minutos.
10. procurar no producir “salpicaduras” con la muestra obtenida. Debe

limpiarse y desinfectarse cualquier superficie contaminada por algún
espécimen biológico.
PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA
La sangre y los líquidos corporales de los pacientes o estudiantes deben

considerarse infecciosos.
1. Todas las muestras de sangre y líquidos corporales deben guardarse en
un recipiente adecuado con tapón para evitar su derrame durante el
transporte. Hay que tener precaución cuando se recoja cada muestra
para evitar la contaminación del exterior del recipiente y de la etiqueta
que acompaña la muestra.
2. Todas las personas que analicen sangre y muestras de líquidos
corporales deben llevar guantes. Ante la posibilidad de un posible
contacto de la mucosa con sangre o líquidos corporales del paciente, es
necesario el uso de mascarilla y gafas protectoras. Hay que cambiarse

de guantes y lavarse las manos después de tomar la muestra.
3. En análisis rutinarios, como estudios histológicos y anatomopatológicos
o cultivos microbiológicos, no es necesario utilizar una cabina de
seguridad. Sin embargo, estas cabinas deben emplearse cuando
realicen análisis de muestras con una posibilidad importante de generar
aerosoles, por ejemplo en una agitación intensa.
4. Hay que utilizar pipetas automáticas para manipular todos los líquidos en
el laboratorio. No se debe pipetear con la boca.
5. Hay que limitar el uso de las jeringas y agujas a situaciones en las que
no haya otra alternativa, y siempre hay que seguir las recomendaciones
generales para evitar lesiones con agujas.
6. Hay que descontaminar todas las superficies de trabajo con un
germicida químico apropiado después de un derrame de sangre y otros
líquidos corporales y cuando se haya finalizado el trabajo.
7. Los materiales contaminados empleados en las pruebas de laboratorio
deben limpiarse y descontaminarse antes de ser reprocesados, o bien,
guardarlos en bolsas y eliminarlos de acuerdo con la norma para
residuos infecciosos.
8. El equipo de laboratorio que se haya contaminado con sangre u otros
líquidos corporales deben descontaminarse y limpiarse.
9. Todas las personas deben lavarse las manos después de finalizar las
actividades de laboratorio y quitarse la bata antes de dejar el laboratorio.
10. No se debe comer, beber ni fumar en el área de trabajo.
Fuente: Morbidity and mortality weekly report, 36 5S-10S, 1987, Center for
Disease Control and prevention Guidelines.
Material indispensable que deberá traer el estudiante por sesión.
1. Bata blanca de laboratorio.

2. La práctica a realizarse.
MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
Las medidas de bioseguridad que deben seguirse en un laboratorio de

Microbiología y que deben considerarse las más importantes se describen a
continuación:
1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas mencionadas

anteriormente como observaciones generales en la hoja anterior, reglas
establecidas para el trabajo correcto del laboratorio.
2. Se debe verificar diariamente la temperatura de la incubadora y de la
estufa bacteriológica y del estado de los aparatos que se utilizan en el
laboratorio.
3. Hay que usar permanentemente la bata de laboratorio. Debe estar
expresamente prohibido el consumo de alimentos y bebidas, así como
fumar y aplicarse cosméticos.
4. Antes y después de la jornada de trabajo, limpie y descontamine las
mesas y el equipo que vaya a estar o haya estado en contacto con el
material infectado.
5. No se debe utilizar el TELEFONO CELULAR dentro de las prácticas de
laboratorio.
6. No guardar alimentos en el refrigerador de sustancias contaminantes o
químicos.
7. No se debe pipetear con la boca. Use siempre pipetas automáticas o
propipetas.
8. Todos los procedimientos se deben realizar con cuidado para no formar
aerosoles o contaminar áreas limpias. De preferencia hay que trabajar
en una campana de flujo laminar.
9. Emplee mascarillas y cubrebocas durante procedimientos que puedan
generar salpicaduras –aerosoles- de sangre u otros líquidos corporales.
10. Evite deambular con los elementos de protección personal por fuera de
su sitio de trabajo.
11. Utilice un par de guantes desechables.
12. Absténgase de tocar con las manos enguantadas alguna parte del
cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el
procedimiento.
13. Evite accidentes y avise de inmediato si esto ocurre. Debe limpiarse con
soluciones de yodo, cloro, fenol o benzal cualquier sitio o implemento
que accidentalmente se haya contaminado. En caso de derrame de
sangre u otros líquidos corporales sobre superficies de trabajo, cubra
con papel u otro material absorbente; luego vierta hipoclorito de sodio al
6% (o cualquier otro desinfectante indicado) sobre el mismo y sobre la
superficie circundante, dejando actuar durante 30 minutos; después
limpie nuevamente la superficie con desinfectante a la misma
concentración y realice limpieza con agua y jabón. El personal
encargado de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes,
cubreboca y bata.
14. En caso de ruptura de material de vidrio contaminado con sangre u otro
líquido corporal, los vidrios deben recogerse con escoba y recogedor,
nunca con las manos.
15. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente son jabón
germicida o desinfectante después de trabajar con muestras clínicas,
material contaminado y animales infectados.
16. Todo el material sucio debe manejarse con guantes.
17. Hay que separar las pipetas, cajas de petri y tubos de rosca
contaminados del resto de material sucio.
18. Colocarlas cubreobjetos y portaobjetos en el contenedor de
punzocortantes.
19. Absténgase de doblar o partir manualmente cualquier material
punzocortante.
20. A todo el material contaminado de desecho se le debe quitar etiquetas,
cintas adhesivas o despintarlos; se colocan en cubetas con solución
desinfectante (cloro diluido), después de ser esterilizado para su
posterior lavado. El material contaminado como agar se colocan en las
bolsas rojas que lo identifique con el símbolo de RPBI y se depositan en
el congelador del área temporal para RPBI.
21. Las pipetas contaminadas se sumergen una solución de hipoclorito de
sodio durante 30 minutos.
22. En caso de accidente con material punzocortante reportar
inmediatamente al maestro.
ELEMENTOS PROPUESTOS PARA QUE INTEGREN A UNA PRÁCTICA
1. Portada de presentación
2. Número de la práctica
3. Titulo
4. Objetivo de la práctica
5. Materiales (equipos, sustancias, aparatos, implementos, etc.)
6. Introducción teórica
7. Procedimiento o desarrollo
8. Cuestionario
9. Observaciones
10. Resultados
11. Discusiones
12. Conclusiones
13. Bibliografía
14. Vo. Bo.
15. Lugar y fecha
Explicación detallada sobre cada uno de los posibles elementos:
Portada de presentación con los siguientes datos:

 Nombre de la institución: Universidad de Colima
 Nombre de la facultad: Facultad de Ciencias Químicas
 Nombre de la carrera: Químico Farmacéutico Biólogo
 Nombre y número de la práctica
 Nombre del alumno
 Manual de prácticas de (Nombre de la Materia)
 Semestre
 Catedrático
 Fecha de elaboración.
Número: Es él numero consecutivo que le corresponde a cada una de las
prácticas
Titulo: Se refiere al nombre que se le asignará a la práctica y que tiene la
función de indicarnos de forma sintética en que consistirá el trabajo práctico
que se va a realizar.
Objetivo: En éste elemento se van a especificar claramente las acciones,
habilidades, actitudes y destrezas que se pretende que adquiera o desarrollen
los alumnos con la realización de la práctica, y que sin duda serán factor
importante en su formación profesional.
Materiales: Es un listado de todos los elementos materiales necesarios que se
van a utilizar en la realización de la práctica, como son: sustancias químicas,
implementos y consumibles así como, equipos específicos y aparatos
especiales con sus respectivas características.
Introducción teórica: Comprende una breve descripción teórica sobre el tema

en particular del que se va a realizar la práctica correspondiente, así como su
relación con algunos otros temas de la forma más concisa posible. Tratando de
mostrar un panorama o marco referencial que le da sustento sobre la actividad
a realizar.
Procedimiento o desarrollo: Debe contener una serie de indicaciones o pasos

secuenciados para poder realizar la práctica de la mejor manera posible sin
descuidar todas las observaciones, sugerencias, esquemas, comentarios o
notas pertinentes sobre los pasos o partes del procedimiento a realizar de ser
necesarios.
Cuestionario: Se integre con una serie de preguntas relacionadas con la

introducción teórica, además preguntas sobre las observaciones y los
resultados obtenidos de la realización de la práctica. Se integran dos tipos de
preguntas: preguntas de complementación y por último, preguntas de opción
múltiple, en las cuales se tenga que reflexionar; para contestar ésta última,
cada pregunta puede incluir una o varias opciones como respuestas. Deben
responder el cuestionario ya que es parte de la evaluación de la práctica.
Observaciones: En este elemento se incluyen todos los dibujos, comentarios a
situaciones importantes que resultaron decisivas durante la realización de la
práctica.
Resultados: Es el producto final que se obtiene de realizar adecuadamente el
trabajo de una práctica, y pueden ser todos los cálculos, tablas, gráficas o
esquemas, programas, comentarios, dibujos etc., que deben servir como
evidencias de la realización del trabajo práctico y de las competencias
adquiridas o desarrolladas.
Discusiones: En este apartado, el cual es uno de los más importantes para la
evaluación de la práctica, el estudiante tendrá que investigar las observaciones
realizadas en el experimento para justificarlas científicamente.
Conclusiones: Se refiere al punto de vista personal del alumno en el cual
refleja mediante una o varias afirmaciones, la importancia de la realización de
la práctica en la materia correspondiente y en su propia formación como futuro
profesionista.
Bibliografía: Aquí se incluyen todas las referencias bibliográficas,

documentales y direcciones electrónicas de sitios en la página web que se
consultaron para poder contestar las preguntas del cuestionario, o para ampliar
y reforzar los resultados obtenidos.
Evaluación: Dentro del proceso enseñanza aprendizaje la evaluación ocupa un
lugar muy importante por lo que es necesario que en el aprendizaje práctico se
realice para saber si sé esta logrando el objetivo particular de la práctica y el
objetivo respectivo de la materia.
En cuanto a los instrumentos utilizados para la evaluación del trabajo práctico,
se tomarán en cuenta el reporte mismo de la práctica donde debe tener el
cuestionario con todas las respuestas correctamente contestadas, las
observaciones, los resultados, las discusiones y las conclusiones específicas

de cada práctica realizada.
VO.BO. Visto bueno del profesor de la Materia.
Lugar y Fecha: Es el lugar y la fecha de la realización de la práctica
respectiva.
CONTROL DE CALIDAD
1. ALMACENAMIENTO DE CULTIVOS DESHIDRATADOS:

Los medios de cultivo deshidratados son higroscópicos y absorben agua del
exterior (así como la formación de agua dentro de la botella) como
consecuencia de las fluctuaciones de temperatura en el ambiente. Además
favorece el crecimiento bacteriano. Esto puede conducir al consumo de
nutrientes, variaciones de pH y cambios de color en el medio. También la
exposición a la luz puede llevar a cambios importantes o alteraciones en los
constituyentes del medio de cultivo.
Tomando en cuenta los factores antes señalados, los medios de cultivo

deshidratados deben almacenarse siempre en un lugar fresco, protegidos
contra la humedad y la luz. Cuando se requiera abrir un frasco, debe
hacerse en un lugar seco, utilizando condiciones de almacenamiento
adecuadas, los medios elaborados en forma de polvo tienen una vida útil de
al menos un año y los medios en forma granular tienen una duración de al
menos de 3 años.
Para asegurarnos que un medio de cultivo está en buen estado, es

conveniente marcar cada frasco con la fecha en que fue recibido y tomarse
las previsiones necesarias para que la existencia del mismo en almacén
cubra las necesidades del laboratorio por periodos de al menos 6 meses.
De esta manera controlaremos su vida útil y evitaremos que se nos
deterioren durante el almacenamiento. El material que ha sufrido cambios
sustanciales, tales como hidratación y endurecimiento, debe descartarse.
2. RECONSTITUCION O REHIDRATACION
El grado de disolución del medio deshidratado, así como la eficacia del
medio de cultivo ya preparado dependen en gran medida del procedimiento
empleado en la rehidratación. Debe emplearse siempre agua recién
destilada o completamente desmineralizada y matraces con un volumen, al
menos, dos veces mayor a la cantidad del medio que se va a preparar.
Siempre se agrega la cantidad adecuada del medio deshidratado a la mitad
del volumen de agua requerido, se mezcla vigorosamente hasta obtener
una suspensión homogénea y luego, se agrega el resto del agua
asegurándose que cualquier partícula de medio adherida a la pared del
matraz sea lavada en el proceso.
Se ajusta el pH del medio al valor que establece la casa fabricante. Para

este propósito, se utilizan soluciones de NaOH y HCl 0.1N y un
potenciómetro debidamente calibrado. En el caso de que no se disponga de
éste y para medios que no tengan colorantes o indicadores pueden
utilizarse las tiras de pH.
Si un medio de cultivo contiene agar, gelatina o cistina, es indispensable

calentarlo en un baño de agua hirviendo y agitarlo frecuentemente hasta
lograr su disolución completa. Esta se logra cuando no se observen
partículas adheridas a las paredes del matraz y el medio disuelto se
observe homogéneo.
Una vez logrado el propósito anterior, debe suspenderse el calentamiento,

ya que un exceso del mismo puede ocasionar deterioro de algunos
constituyentes del medio, tomándolo inadecuado. Si el medio debe ser
distribuido en tubos (TSI, citrato, etc.) debe agitarse frecuentemente para
asegurar una distribución homogénea del mismo en cada tubo. Los medios
que no contienen agar, gelatina o cistina se solubilizan sin necesidad de
calentarlos.
3. ESTERILIZACION
El medio de cultivo una vez disuelto (y distribuido en tubos si fuera
necesario) debe someterse al proceso de esterilización, excepto aquellos
que no lo requieran (agar SS, por ejemplo.) Debe seguirse las instrucciones
en cuanto a tiempo y temperatura para asegurarse la obtención de medios
de cultivo útiles. Debe tenerse en cuenta que la presión varía de acuerdo
con la altura y por no es un factor constante. De tal manera que son el
tiempo y la temperatura los parámetros que deben tomarse en
consideración en el proceso de autoclaveado.
4. DISTRIBUCION DEL MEDIO EN PLACAS

El medio esterilizado debe enfriarse a 45º-50ºC en un baño maría ajustado
a esa temperatura para evitar la formación de agua de condensación. Debe
ser vertido en las placas evitando la formación de burbujas. En caso de que
éstas se presenten, pueden ser eliminadas por calentamiento en la
superficie del medio con la ayuda de la llama del mechero. Durante el
vaciado, los componentes del medio deben estar uniformemente
distribuidos, por lo que es necesario agitarlos con frecuencia. Si el medio de
cultivo se ha enfriado a 45-50ºC, el agua de condensación que puede
formarse en las placas será poca y por tanto, pueden mantenerse cerradas
para evitar contaminación.
Debe guardarse una pequeña cantidad del medio para determinar el pH
después de autoclaveado. Si el valor no es el indicado para el medio,
Descártelo.
5. PRUEBA DE ESTERILIDAD
Para cada lote que se prepare debe tomarse una muestra de un 10% y
someterla a control de esterilidad a 35ºC por 24 horas. Este procedimiento
dará una idea sobre la contaminación obtenida en la preparación del medio.
Esto a su vez permitirá determinar si se deben tomar medidas más
rigurosas en la limpieza y desinfección del sitio en que se preparan los
medios de cultivo y en el procedimiento de distribución del medio.
6. ALMACENAMIENTO DEL MEDIO PREPARADO

El medio de cultivo reconstituido tiene una vida útil limitada. Si no se emplea
de inmediato, debe almacenarse bajo condiciones apropiadas para
garantizar su utilidad durante un periodo de tiempo. El almacenamiento a
4ºC es el mejor para la mayoría de los medios. Sin embargo, aquellos que
contienen tioglicolato es indispensable mantenerlos a temperatura ambiente
para que mantengan su viabilidad.
Los medios deben mantenerse en sitios oscuros, ya que la luz puede

afectar alguno de sus componentes. Para evitar la desecación pueden
guardarse en bolsas plásticas bien cerradas. Las placas de petri
almacenadas de esta forma deben colocarse con el fondo hacia arriba.
Dado que los medios almacenados en refrigeración cuando pasan a

temperatura ambiente tienden a formar agua de condensación en la
superficie, se recomienda poner las placas en la incubadora a 35ºC por un
periodo de 2 horas, colocándolas conj el fondo hacia arriba. De esta manera
se obtendrá una superficie seca.
CONTROL DE CALIDAD EN TINCIONES Y PRUEBAS DE

IDENTIFICACION
Para determinar que los reactivos empleados tanto en tinciones como en

pruebas de identificación bacteriana funcionen adecuadamente, deben
utilizarse bacterias que muestren las diferentes características distintivas
para cada prueba o tinción.
Para ello, deben hacerse controles diarios con las cepas bacterianas de
referencia y seguir estrictamente las indicaciones en cuanto al
almacenamiento de reactivos, inoculación de medios, períodos de
incubación, metodología para efectuar las pruebas y tiempo de lectura de
las mismas.
TOMA, MANEJO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS
OBJETIVO:
Proporcionar a los estudiantes las bases para la toma, manejo correcto y
transporte de muestras clínicas para su análisis microbiológico de tal manera
que las muestras que se analicen tenga las condiciones idénticas a las que
tenía en el momento del muestreo.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todo tipo de muestras para cultivo
independientemente de su origen: saliva, esputo, expectoración, tejidos,
órganos, sangre, orina, excremento o secreciones adyacentes.
DEFINICIONES:
Muestra: Recolección de material orgánico representativo de algún proceso
infeccioso independientemente de su ubicación. La muestra debe ser de buena
calidad y de cantidad suficiente.
Toma de muestra: Es el primero de una cadena de pasos para el diagnóstico
bacteriológico, para decidir la correcta recolección para su cultivo en el
aislamiento de microorganismos responsables de enfermedades infecciosas.
Transporte de la muestra: Recipientes estériles para la recolección de muestras
los cuales ayudan a mantener la humedad e impedir la desecación y muerte de
las bacterias. Facilita la viabilidad de los microorganismos.
INTRODUCCION:
La recogida de la muestra forma parte de la responsabilidad del químico al

asegurarse de que la recogida de las muestras sea correcta. Las muestras
recogidas de forma inadecuada pueden dar lugar a datos que causen
confusión, con errores en el diagnóstico o empleo innecesario de antibióticos.
Por lo anterior se enlistan algunos conceptos básicos para la correcta
recolección de las muestras.
 La muestra para cultivo debe ser material del verdadero sitio de

infección y debe recogerse con un mínimo de contaminación de tejidos,
órganos o secreciones adyacentes.
 Establecer periodos óptimos para la recolección de muestras a fin de

tener la mejor oportunidad de aislar los microorganismos causantes.
 Obtener suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo las técnicas

de cultivo solicitadas.
 Utilizar dispositivos de recolección, recipientes para las muestras y

medios de cultivos adecuados para asegurar el óptimo aislamiento de
los microorganismos.
 Siempre que sea posible, obtener las muestras antes de la

administración de antibióticos.
 El envase recolector de la muestra debe estar correctamente rotulado.

Toma de Muestras:
La toma de la muestra con hisopo con punta de algodón y mango rígido de
madera o plástico se realiza cuando el proceso infeccioso es en piel o
membranas mucosas. Las muestras de uretra y de conjuntiva se realiza con
hisopo de alambre flexible y punta de algodón o de alginato de calcio. Por
punción cuando se trata de una enfermedad infecciosa no expuesta. Hay
muestras que se emiten voluntariamente como la orina y las expectoraciones.
Transporte de las Muestras.

Las muestras para ser enviadas al laboratorio deben de colocarse en un medio
de transporte, el cual tiene como propósito mantener la viabilidad de las
bacterias presentes en las muestras e impedir su multiplicación. Se han
diseñado diferentes medios de transporte, el que más se utiliza es el de Stuart.
Algunos medios pueden utilizarse como de transporte y a la vez de
enriquecimiento. (Cuadro 1).
Cuadro No.1 Medios de Transporte de Uso en la Bacteriología Médica

Diagnóstica.
MEDIO PROPOSITO MEDIO PROPOSITO
STUART Aerobios y anaerobios CARBON ACTIVADO S. pyogenes

Facultativos CAS B. pertussis
REGAN-LOWE B. pertussis
STUART Anaerobios 2SP Chlamydia
REDUCIDO estrictos
CARY-BLAIR Shigella y TRANSGROWN* N. gonorrhoeae

Campylobacter
AMIES PIKE S. pyogenes
GLICEROL SOLN. CALDO UREA H. pylori
SALINA CAMPYTIO C. jejuni
AMIES Y DOUGLAS SP4 Micoplasma
HAJNA
* = Medios de transporte y enriquecimiento.
Adaptado de: Hernández Méndez JT.
La orina, las expectoraciones y el material de absceso, se pueden colocar en

frascos estériles de boca ancha. Los líquidos corporales como el Líquido
Cefalorraquídeo en tubos estériles de 13 X 100 mm. (la sangre se coloca en
frascos para hemocultivo diseñados ex profeso). Los trozos de tejido se pueden
colocar en frascos estériles.
MATERIALES:
Para la toma de muestras es necesario contar con el equipo y envases
adecuados a la naturaleza y estado físico de la muestra. Todo el material
utilizado en la toma de muestras para análisis bacteriológico, debe haber sido
previamente esterilizado (121ºC por 20 minutos), y ha de conservarse estéril
hasta el momento de su uso.
Contar con el material disponible para la toma de muestras microbiológicas:

 Frascos desechables estériles para orina y copro.

 Abatelenguas estériles.
 Hisopos de algodón estériles.
 Hisopos de alambre flexibles con punta de alginato de calcio.
 Portaobjetos.
 Medios de transporte de Stuart.
 Medio de transporte de AMIES.
 Medio de transporte de Cary-Blair.
 Torundas de algodón.
 Frascos de Hemocultivo.
 Caldo de Todd-Hewitt.
 Papelería.
 Bata.
 Cubre bocas.
 Medios de cultivo preparados.
 Tubos de 13 X100 mm. Con tapón de rosca estériles.
Todos los abatalenguas con sus respectivos hisopos para la toma de muestras
debe estar envuelto en forma individual previamente esterilizados y provistos
de un medio de identificación.
PRECAUCIONES PARA LA TOMA DE MUESTRAS.

La toma de la muestra debe hacerse con rapidez pero cuidadosamente. Los
recipientes para la toma de muestras deben abrirse únicamente al momento
de introducir la muestra y cerrar de inmediato. No tocar el exterior de los
envases y evitar que la tapa se contamine.
No deberá tomarse la muestra donde las condiciones atmosféricas o de polvo
puedan dar lugar a contaminación de la muestra.
TOMA DE MUESTRA.
Los métodos para la toma de la muestra dependerán del tipo de muestra de
que se trate y de la finalidad del examen. La toma de muestra con fines de
análisis bacteriológico se realiza en condiciones asépticas evitando así que se
produzca contaminación durante su obtención.
Las muestras asépticas se recogen y entregan al laboratorio en condiciones

idénticas a las que tenían en el momento del muestreo, de forma que se
asegure que los resultados del análisis bacteriológico reflejen con precisión el
estado real del producto. Las muestras se deberán tomar al inicio del cuadro
clínico, ANTES DE INICIAR EL TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO.
HISOPADO NASOFARINGEO Y DE GARGANTA.
La flora microbiana usual de garganta, faringe y nariz consiste en

estreptococos alfa hemolíticos, especies de Neisseria, Staphylococcus
epidermidis, S. aureus, S. pneumoniae, varias especies de Haemophilus,
difteroides y numerosas especies de bacterias anaerobias. En la mayoría de
los casos, las muestras de garganta se recogen a fín de aislar estreptococos β-
hemolíticos del grupo “A” que causan faringitis.
Para el hisopado FARÍNGEO correcto se debe dirigir hacia la cavidad oral

abierta un foco de luz brillante por sobre el hombro de la persona que obtiene
la muestra, de modo que el hisopo pueda ser guiado hacia la faringe posterior.
Se instruye al paciente para que respire profundo y la lengua se hace
descender suavemente con un abatelengua. El hisopo de desliza entonces
entre los pilares tonsilares y por detrás de la úvula (amígdalas, parte posterior
de la mucosa faríngea, cualquier mancha blanca o ulceración que se encuentre
en la zona de las amígdalas), cuidado de no tocar las paredes laterales de la
cavidad bucal, la lengua, zona periodontal o la mucosa de los carrillos. La
emisión de un “ahh” por parte del paciente sirve para elevar la úvula y ayuda a
reducir el reflejo de la náusea. El hisopo se debe pasar rápidamente de un lado
a otro de la faringe posterior a fin de obtener una muestra adecuada. Una vez
recogida la muestra, el hisopo se debe colocar inmediatamente en un medio de
transporte. Enseguida se vuelve a instruir al paciente para hacerle un doble
hisopado, uno para colocarlo en un caldo de Todd-Hewitt (al cual se le rompe la
parte superior del hisopo de madera que estuvo en contacto con la mano del
operador) y el otro hisopo para microscopía.
Para el exudado nasofaríngeo se utiliza un hisopo que no sea de

algodón sino de alginato de calcio, nylon o dacrón con mango flexible (alambre
de aluminio o plástico) para no lastimar al paciente. Se introduce el hisopo por
una de las narinas hasta aproximadamente 10 cm., cuidando de tocar solo el
extremo posterior del mango y evitarse tocar los cornetes. En caso de topar
con alguno de ellos sacar el hisopo y repetir la introducción. Una vez tocando el
fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo y se retira con cuidado
para que no se contamine.
Si la muestra no puede procesarse inmediatamente en el laboratorio o no se
puede trabajar dentro de las siguientes 4 horas, deberá depositarse en un
medio de transporte (Amies o Stuart).
MUESTRAS DE ORINA.
Las bacterias que con mayor frecuencia se aislan de la orina de

pacientes ambulatorios con infección urinaria son: Escherichia coli,
Staphylococcus saprophyticus, Proteus spp., Klebsiella spp., Streptococcus
faecalis y Streptococcus pyogenes. En los pacientes hospitalizados infectados
intranosocomialmente se aisla con frecuencia E. coli, S. epidermidis, Klebsiella
spp.y Enterobacter spp. Con muy poca frecuencia se ha descrito otros agentes
patógenos como Gardnerella vaginalis, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa.
Para lograr que el cultivo de orina realmente sea veraz requiere que las
muestras sean obtenidas en condiciones óptimas. Ya que la uretra está
contaminada por bacterias, especialmente cerca de su orificio externo, es
importante hacer una desinfección local antes de tomar la muestra para
eliminar la contaminación.
Para el óptimo aislamiento de bacterias del tracto urinario, y a fin de reducir la

contaminación potencial, es imperativo prestar cuidadosa atención a la correcta
recolección de muestras de orina. Para obtener mejores resultados, la
recolección de muestras de los pacientes hospitalizados o internados deberá

estar supervisada por una enfermera.
La muestra para cultivo de orina puede ser por cateterismo, punción

suprapúbica, muestra limpia o de medio chorro. Esta última exige las siguientes
condiciones:
a) Para una correcta recolección de muestra de orina de los
pacientes, se debe lavar la zona peri-uretral y el peritoneo con
jabón neutro y enjuagar bien con solución salina estéril, benzal o
agua.
b) Se prefiere la obtención de la primera orina de la mañana o
tener como mínimo 2 horas de retención urinaria. En pacientes
hospitalizados durante la evacuación se debe mantener los labios
separados y recoger los primeros pocos mililitros de orina en un
orinal a fin de eliminar por arrastre las bacterias de la uretra.
c) Se recoge entonces la porción media de la micción en un
frasco estéril especial para orina, de boca ancha, tapón de rosca,
transparente y recoger una cantidad de 15 a 20 ml de orina de
medio chorro. En niños recién nacidos la muestra de orina se
obtiene en una bolsa de plástico estéril desechable la cual se
adhiere a los genitales externos. En pacientes ambulatorios se
lava las genitales externos y se desecha el primer chorro que
salga. La orina se recoge en un frasco limpio y estéril con tapón
de rosca.
d) El tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su
proceso, no debe de exceder de 2 horas; sino se puede procesar
al recibirla, se puede refrigerar hasta por 12 horas.
Transporte y Almacenamiento.
La orina es un excelente medio de cultivo y las bacterias se multiplican
rápidamente si la muestra se deja a temperatura ambiente durante un tiempo
relativamente corto.
Las muestras de orina deben transportarse al laboratorio inmediatamente
después de su obtención y procesarse en no más de 2 horas o bien deben
refrigerarse a 4°C, ya que la cuenta bacteriana permanece constante durante
24 horas. Si no se siguen estas instrucciones losa resultados son erróneos.
SECRECION URETRAL
Toma de muestra: efectuar presión suave sobre la uretra, eliminar la secreción,
luego exprimir desde atrás con fuerza y recoger la secreción con dos hisopos
estériles, uno para el frotis y el otro para el cultivo (Thayer-Martin o Agar
Chocolate). Si la secreción es escasa introducir en la uretra un hisopo fino y
raspar la pared uretral con delicadeza. Hacer de inmediato el frotis para
coloración de Gram e inocular los medios de cultivo. Si se va a transportar
colocarlo en medio de transporte de Stuart, Amies o Cary-Blair. Si no se puede
sembrar de inmediato hacer frotis y mantener el hisopo en un medio de
transporte.
SECRECION VAGINAL
Toma de muestra: colocar a la paciente en posición ginecológica, introducir el

espéculo, tomar la muestra con dos hisopos del endocervix y vagina; se
recomienda que sea tomado por el médico. El hisopo debe ser estéril e
impregnado con solución salina fisiológica estéril al 0.85%. Hacer de inmediato
un frotis al Gram y hacer un examen directo al fresco, colocando una gota de
solución salina en un portaobjetos y suspender en ella la secreción vaginal;
cubrir con el cubreobjetos y buscar Tricomonas vaginalis o levaduras. Si el
examen en fresco no se puede hacer de inmediato, colocar el hisopo en 0.5 ml
de solución salina, en refrigeración no más de 2 horas. En la coloración de
Gram reportar vaginosis bacteriana si hay predominio de bacilos
Gramnegativos.
TOMA DE MUESTRA PARA COPROCULTIVO.

Las vías gastrointestinales son el hábitat natural de una extensa variedad de
microorganismos, incluyendo las bacterias. La mayoría de las bacterias de la
flora entérica residente corresponden a miembros de la familia
Enterobacteriaceae (Proteus, E. coli, Serratia, Erwinia, etc.) aunque también
son abundantes Streptococcus faecalis (Enterococos), varias especies de
Staphylococcus y muchas especies anaerobias de los géneros Clostridium,
Peptococcus, Bacteroides, etc. Desde luego de extraordinaria importancia son
las Enterobacterias patógenas como Shigella, Salmonella, Campylobacter,
Yersinia y ciertas cepas de Escherichia, así como Vibrio y Helicobacter que
pertenecen a otras familias.
El estudio de las bacterias responsables de cuadros clínicos gastrointestinales
se realiza fundamentalmente mediante el cultivo de materia fecal
(coprocultivo). Las muestras se deberán obtener al inicio del cuadro clínico,
ANTES DE INICIAR EL TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO.
Las muestras de heces se toman directamente en un frasco limpio estéril de

boca ancha y con tapa hermética. Si la muestra se toma en el mismo
laboratorio donde se va a realizar el aislamiento no se requiere utilizar un
medio de transporte de Cary-Blair, solo que hay que sembrarlo de inmediato.
El hisopo y el medio de Cary-Blair vienen juntos en un paquete estéril. Basta
tomar un solo hisopo, cuando se sospecha de una enterobacteria, pero si se
supone de la participación de Vibrio cholerae son necesarios dos hisopos.
Se abre el paquete, se saca el hisopo y se introduce por vía anal más allá del
esfínter con un movimiento circular para obtener el material de la mucosa
rectal.
El hisopo se coloca en el tubo con el medio de transporte y se tapa bien.
El tubo se etiqueta con pluma de tinta negra, incluyendo los datos del nombre,
edad, sexo del paciente y número de muestra.
MUESTRAS DE EXPECTORACION
Las infecciones de las vías respiratorias inferiores son una causa importante
demorbilidad y mortalidad en todo el mundo. Aunque la causa más frecuente es
la tuberculosis, hay diversos cuadros agudos principalmente de etiología
bacteriana que especialmente inciden en individuos muy jóvenes o muy viejos.
En casos de neumonía aguda hay que buscar Streptococcus pneumoniae
principalmente, aunque nunca hay que descartar otros agentes como Klebsiella
pneumoniae o Haemophilus influenzae. Las muestras se deberán obtener al
inicio del cuadro clínico, ANTES DE INICIAR EL TRATAMIENTO

ANTIMICROBIANO.
El esputo debe ser tomado en la mañana al despertarse el paciente. Para

ayudar al enfermo a toser y expectorar puede usarse propilénglicol o solución
salina hipertónica o solución salina isotónica para efectuar nebulizaciones.
La muestra se recoge en un frasco estéril de boca ancha, con capacidad de 30
– 50 ml., de material transparente y de preferencia de plástico combustible y de
boca ancha y tapa de rosca.
La muestra debe contar con características óptimas de calidad (representativa

de la lesión y de cantidad suficiente). El frasco se rotula con una etiqueta de
identificación de la muestra, con todos los datos relevantes del caso, nombre
completo, edad, sexo, fecha, diagnóstico presuntivo, etc. A su arribo al
laboratorio o en caso de realizarlo en el laboratorio, la muestra se procesa lo
antes posible y si no es así se conserva refrigerada, con un límite de 2 días.
Para baciloscopía la muestra de mayor rendimiento es la expectoración

especialmente de la mañana, proveniente del árbol bronquial, se le pide al
paciente que inspire profundamente, que retenga en un instante el aire en sus
pulmones y que lo expulse violentamente con un esfuerzo de tos hasta obtener
no menos de 3 esputos.
Para el diagnóstico de M. tuberculosis se requieren dos muestras: la primera se

tomará en el momento de asistir al laboratorio, la segunda será recogida al
despertar la persona (matinal) previo aseo de la boca.
Para control de tratamiento: dos baciloscopías al segundo, cuarto y sexto mes

de tratamiento.
Para control Post-tratamiento, se debe realizar baciloscopías a los 12 y 24

meses de finalizado el tratamiento.
Al recibir la muestra se debe observar la cantidad y la calidad, tapar bien el

recipiente y marcarlos en el cuerpo del recipiente, no en la tapa.
MUESTRAS DE HERIDAS.
La superficie de las heridas cutáneas o úlceras están frecuentemente
colonizadas por bacterias del medio ambiente, y las muestras obtenidas por
hisopado no reflejan a menudo la verdadera causa del proceso infeccioso. Por
esa razón, el método más aconsejable para recoger muestras cutáneas para
cultivo es por aspiración del material purulento de las profundidades de la
herida con una aguja estéril y jeringa.
Los bordes de la herida deben descontaminarse tanto como sea posible con
jabón neutro y aplicación ya sea de etanol o alcohol isopropílico al 70%.
Si el material se recoge con jeringa, se puede volver a colocar la funda de la
aguja y procesarse lo más pronto posible (No debe demorar más de 30
minutos).De lo contrario con un hisopo estéril colocar el material en un medio
de transporte de Stuart.
Si no se puede con jeringa entonces tomar la muestra con hisopo, en donde se
separan suavemente los bordes de la herida con el pulgar e índice de una

mano (usando un guante estéril) introduciendo la punta del hisopo en la
profundidad de la herida con la otra mano, cuidando de no tocar los bordes
cutáneos adyacentes. El hisopo se coloca en un medio de transporte de Stuart.
Se introduce un segundo hisopo para microscopía (tinción de Gram y/o BAAR).
HEMOCULTIVO.
El cultivo de sangre tiene gran importancia en el aislamiento y la identificación

de los agentes responsables de bacteriemias y en el pronóstico de ciertas
infecciones. Casi todos los agentes patógenos conocidos y algunos
considerados inofensivos se han cultivado de sangre.
Los microorganismos que más frecuentemente se aíslan de los cultivos de
sangre son los siguientes:
 Estafilococos (coagulasa positivos y negativos) y Micrococos.
 Bacterias coniformes y otros microorganismos entéricos.
 Pseudomonas spp.
 Estreptococos alfa y beta hemolíticos.
 Neumococos.
 Enterococos.
 Haemophilus influenzae.
 Clostridium perfringens y microorganismos afines.
 Bacteroides fragilis, otros anaerobios Gram-negativos.
 Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae.
 Salmonella spp.
 Brucella ssp.
 Legionella spp.
 Francisella tularensis.
 Leptospira spp.
 Hongos oportunistas: Candida y Torulopsis.
Indicaciones para el hemocultivo: El hemocultivo esta indicado en casos de

fiebre, hipotermia, sensación de enfriamiento, calosfríos, postración,
hipotensión, fiebre prolongada e intermitente con soplo cardiaco perceptible.
Toma de muestra: Se selecciona el sitio para la venipuntura. Es conveniente
seleccionar un lugar diferente para cada toma. Debe evitarse extraer sangre de
catéteres intrarteriales o intravenosos permanentes a menos que la sangre no
pueda obtenerse por venipuntura.
El sitio de venipuntura se limpia vigorosamente con un hisopo de algodón

impregnado de etanol al 70% o con tintura de yodo en alcohol realizando
movimiento concéntrico del centro a la periferia por 30 segundos. Hay que
dejar que seque, sin soplar con la boca y no se debe tocar el sitio después de
que fue desinfectado.
Para la desinfección de las botellas, hay que limpiar el tapón de la botella con
alcohol ó yodo y dejar secar al aire. Se inserta la aguja en la vena y se extrae la
sangre. Se debe mezclar bien para evitar que se coagule. Usar una nueva
aguja si falló la primera vez. Colocar inmediatamente la sangre colectada en la
botella en condiciones estériles.
El volumen de la muestra es crítico ya que la cantidad de organismos en la

mayoría de las bacteriemias es poca, especialmente si el paciente está bajo
tratamiento antimicrobiano. En los niños, la cantidad de organismos es
generalmente mayor que en los adultos, por lo que la cantidad de sangre
requerida es menor.
Volumen recomendado en niños: de 1 a 5 ml. de sangre venosa.
Volumen recomendado en adultos: de 10 a 30 ml. de sangre venosa.
Número e intervalo de cultivos:
a) Sepsis aguda, meningitis, osteomielitis, artritis, neumonía bacteriana
sin tratar o pielonefritis: obtener dos muestras de sangre de dos
lugares distintos antes de iniciar la terapia.
b) Pacientes con endocarditis con terapia antimicrobiana: extraer 2
muestras distintas en 3 días sucesivos.
c) Pacientes bajo terapia antimicrobiana: extraer 6 muestras en
intervalo de 48 horas; obtener las muestras en el momento previo a
la sig. dosificación del antimicrobiano.
d) Fiebre de origen desconocido: abscesos ocultos, fiebre tifoidea,
brucelosis o leptospirosis: obtener 2 muestras diferentes al inicio;
después de 24 a 36 hrs. Obtener 2 muestras más, antes de que se
alcance el pico febril.
e) Sospecha de endocarditis, bacteriemia continua de baja magnitud:
-Aguda: Obtener 3 muestras de 3 sitios distintos durante la 1ª. ó
2ª. hora de evaluación e iniciar terapia.
-Subaguda: Extraer 3 muestras en el primer día (con 30 minutos de
intervalo). Si todas son negativas al día siguiente tomar tres más.
Recomendaciones:
 Usar guantes de hule al manejare cualquier fluido biológico.
 Dentro de lo posible, realizar el trabajo dentro de una campana de
seguridad o en su defecto usar cubrebocas, y gogles o careta.
 Eliminar en forma adecuada todo el material contaminado. Colocar las
jeringas, agujas y otros materiales afilados contaminados en un
punzocortante.
 Hay que tener cuidado extremo al colocar la cubierta protectora a una
jeringa contaminada.
CULTIVO DE SECRECIONES DE OJOS Y OIDOS.
Toma de muestra de ojos: El material supurativo de un ojo infectado se debe

recoger del fondo del saco inferior o del ángulo interno. Se deben realizar
siempre coloraciones directas de Gram del material obtenido a fín de
determinar la presencia y tipo de bacterias en dicho material.
Si se sospecha de una infección por Chlamydia trachomatis (tracoma), se debe
preparar extendidos de raspado de córnea en un portaobjetos, que una vez
secados al aire, se tiñen con colorante de Wright o Giensa y se examina al
microscopio para observar la presencia de inclusiones intracitoplásmicas
características.
Toma de nuestra de oído: Los cultivos del conducto auditivo externo
generalmente no reflejan la causa bacteriana de una otitis media, a menos que

haya habido rotura reciente de la membrana timpánica. Es más recomendable
tomar material supurativo del oído con 2 hisopos estériles de algodón de forma
alternada, uno para el cultivo (el cual se coloca en un medio de transporte de
Stuart si no es procesado con prontitud) y el otro para microscopía.
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y OTROS LIQUIDOS DE DERRAME

Este exámen es uno de los de mayor urgencia dentro del laboratorio
bacteriológico, por lo cual debe examinarse sin demora ya que la enfermedad
es de evolución rápida y de alta mortalidad o de secuelas importantes. Es
básico la identificación del agente causal y su antibiograma. Se necesitan de 1
a 2 ml de muestra en tubos de tapón de rosca estériles, enviarlos al laboratorio
a temperatura ambiente: usualmente se toman dos tubos, uno para
bacteriología y otro para química. Si no es posible, primero procesar
bacteriología y luego remitirlo para química, la muestra debe guardarse en
estufa a 35ºC hasta completar la rutina. Centrifugar la muestra a 3000 rpm por
15 minutos y con el sedimento inocular los medios de cultivo y hacer un frotis
para el Gram y una preparación con tinta china. En caso de líquido pleural y
ascítico se agregan 3 gotas de citrato de sodio al 10% por cada 10 mL y se
conserva en refrigeración si la muestra no se procesará inmediatamente.
PUS
Si las lesiones son cerradas colectar en jeringa gruesa, previa asepsia con
yodo. Si las lesiones son abiertas, lavar primero con agua y jabón y colectar
con bisturí el pus del borde de las lesiones. Colocarlo directamente en los
medios de cultivo o en portaobjetos. Si el pus es abundante colocarlo en un
tubo estéril con tapón de rosca.
BIBLIOGRAFIA.
Giono C. S., Escobar G.A. Zárate A.M. Manual de Técnicas de Laboratorio.
Volumen I. Instituto Nal. de Diagnóstico y Referencias Epidemiológicas
(INDRE). Secretaría de Salud. 1995.
Hérnández M. J., Cano R.E., Giono C.S. BacteriologíaMédica Diagnóstica. 2ª.
Edición. Ediciones Cuellar. Pág. 18-20. (2003).
Koneman, Allen, Dowell y Sommers. Diagnóstico Microbiológico. Editorial
Médica Panamericana. Pág. 15-32. (1991).
Práctica No. 1
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
OBJETIVO:
Preparar medios de cultivo sólidos y líquidos que cumplan adecuadamente con
los controles de calidad (pruebas de esterilidad).
COMPETENCIA:
Que los estudiantes sean capaces de preparar adecuadamente medios de
cultivo líquidos y sólidos, a partir de medios deshidratados, siguiendo las
instrucciones correspondientes.
DEFINICIONES:
Medio de cultivo: sustancias utilizadas para proporcionar alimento (sustancias
nutritivas) para el desarrollo y multiplicación de los microorganismos. Estas
sustancias pueden estar incorporadas en condiciones sólidas, semi-sólidas o
líquidas.
Autótrofos: organismos que pueden desarrollar y multiplicarse en los medios
más simples; ellos solo requieren de o fuentes inorgánicas o dióxido de
carbono como única fuente de carbono.
Heterótrofos: Organismos que pueden crecer y multiplicarse en las sustancias
nutritivas complejas, es decir varían considerablemente en cuanto a sus
necesidades de nutrientes específicas para el desarrollo. Microorganismo
incapaz de utilizar el dióxido de carbono como única fuente de carbono y que
por lo tanto requiere, uno o más componentes orgánicos.
INTRODUCCION:
Los medios de cultivo usados en Bacteriología contienen los nutrientes y
factores físicos y químicos (pH, concentración de iones) necesarios para la
reproducción bacteriana. Existe una gran variedad de medios de cultivo. Los
medios líquidos permiten el crecimiento aislado de grupos de bacterias
(colonias) cuyas características macroscópicas sirven de guía para la
identificación de ciertas bacterias.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de la siguiente manera:

1. Medios Enriquecidos: La adición de componentes como sangre, suero,
extracto de tejidos de animales y plantas al caldo nutritivo o agar, les
proporciona sustancias nutritivas complementarias para que el medio
pueda soportar el crecimiento de los heterótrofos exigentes.
2. Medios Selectivos: La adición al agar nutritivo de ciertas sustancias
químicas específicas, no permitirá el desarrollo de un grupo de
bacterias, sin inhibir al mismo tiempo el crecimiento de otros
organismos. Por ejemplo, el cristal violeta en concentraciones
específicas previene el crecimiento de bacterias Grampositivas sin
afectar el desarrollo de variedades Gramnegativas.
3. Medios Diferenciales: la adición de ciertos reactivos o sustancias
químicas a los medios de cultivo trae como resultado determinado tipo
de crecimiento bacteriano o de cambios, después de la siembra e
incubación del medio, lo cual permite al observador diferenciar distintos
tipos de bacterias. Por ejemplo, si se siembra una mezcla de bacterias
en un medio de agar sangre, algunas de las bacterias pueden hemolizar

(destruir) los glóbulos rojos, mientras que otras no lo hacen.
En la preparación de los medios se deben de seguir los siguientes pasos:

1. Cada ingrediente, o el medio deshidratado completo, se debe disolver en
un volumen adecuado de agua destilada.
2. Se determinará el pH del medio y si es necesario se ajustará.
3. El medio se pondrá en recipientes adecuados como tubos, matraces,
botellas, cajas de petri.
4. Los medios se esterilizan generalmente en autoclaves.
MATERIALES:
 Caldo de Infusión Cerebro Corazón o Caldo Nutritivo.
 Agar Tripticasa soya deshidratado.
 Soporte con malla metálica.
 Matraz erlenmeyer de 250 ml con tapón de algodón o gasa.
 Cajas de petri.
 Abatelenguas de madera
 Balanza granataria
 Agua destilada.
 Probetas de 100 ml
 Tubos de ensayo con tapón de rosca de 13X100 mm
 Mechero Fischer.
 Autoclave de calor húmedo.
PROCEDIMIENTO:
MEDIO DE CULTIVO LÍQUIDO

1. Se pesa el caldo infusión cerebro corazón sobre una balanza granataria
(calibrada previamente). Se observan las especificaciones en el frasco
para preparar 50 ml del caldo.
2. El caldo debe ser pesado sobre un papel especial (papel aluminio) para
que no haga contacto con la superficie de la balanza.
3. Colocar 50 ml de agua destilada en un matraz erlenmyer (el volumen se
mide con una probeta).
4. Agregar el medio deshidratado. Disolver por agitación y medir el pH de
acuerdo al frasco.
5. Calentar hasta que empiece a hervir. Se procede a colocar el medio de
cultivo sobre cada tubo de ensayo con tapón de rosca.
6. Luego esterilizar en la olla de presión (15 libras de presión por 15
minutos).
MEDIOS DE CULTIVO SOLIDOS
1. Pesar el medio de agar soya tripticasa o algún medio sólido, en una

balanza granataria de acuerdo a las instrucciones en el frasco para
preparar 100 ml del medio.
2. El procedimiento es igual a la de los medios líquidos.
DISCUSIONES:
1. Necesidades nutricionales de algunas bacterias: vitaminas, fuente de

energía, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, iones y agua.
2. Definir los grupos llamados fotótrofos y quimiótrofos.
3. Condiciones físicas para el desarrollo: Temperatura, necesidad de
gases, acidez o alcalinidad (pH).
4. Selección de los medios de cultivo y condiciones de incubación.
CUESTIONARIO:
1. ¿Qué necesidades nutricionales en término de sustancias químicas, son
necesarias para el desarrollo y buen funcionamiento de las bacterias?
2. ¿Cuál es la diferencia entre las bacterias fototrópicas y las
quimiotróficas? ¿Entre las autotróficas y las heterotróficas?
3. ¿Cuáles son los ingredientes del caldo nutritivo? ¿Qué tipo de nutriente
puede proveer cada uno de estos ingredientes?
4. ¿Cuáles son las ventajas inherentes al uso de medios de cultivo
sintéticos? ¿Cuáles son las desventajas?
5. ¿Cómo puede medirse o ajustarse el pH en un medio de cultivo?
6. ¿Porqué razón se utiliza el medio de Mueller-Hinton como medio
universal para realizar antibiogramas?
7. Haga un bosquejo de un método adecuado (medio de cultivo y
condiciones de incubación para aislar bacterias heterotróficas,
termofílicas y anaerobias).
8. ¿Qué es un medio de transporte? ¿Cuántos tipos existen?
9. ¿Qué tipo de medios de cultivo es el agar EMB, Sulfito de Bismuto,
Manitol sal Agar y Agar Hektoen?
10. Describa un medio de cultivo cuyo pH sea mayor de 8? ¿Para qué se
utiliza?
Bibliografía Consultada:
REFERENCIA:
1. Zinsser, Joklik, Amos, Wilfret.-(1996). Microbiología. 20ª. Ed. Médica
Panamericana.
2. Davis, Dubelcco, Eisen, Ginsberg, Wood.(2000). Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. España.
3. Koneman, Allen, Dowell (1996). Diagnóstico Microbiológico (atlas).
Editorial Panamericana.
4. Lynch, S.S. Rápale, Mellor (1997). Métodos de Laboratorio. Vol. I y II.
Editorial Interamericana.
5. Lennette EH, Ballows A, Hausler WJ, Shadomy HJ. 1987. Manual de
Microbiología Clínica. 4a. ed. Panamericana. Buenos Aires.
6. Anónimo. Manual DIFCO. 1984. 10ava. Ed. Gráficas Letra. Madrid.
Vo.Bo.
Práctica No.2
OBTENCION DE BACTERIAS EN CULTIVO PURO
OBJETIVOS:
1. Que el alumno obtenga cultivos puros de bacterias Grampositivas y
Gramnegativas, a partir de una muestra con flora mixta.
2. Que utilice medios de cultivos selectivos y diferenciales e interprete los
resultados que obtenga en esos medios.
3. Que constate por observación macroscópica y microscópica si obtuvo
cultivo puro.
COMPETENCIA:
Que el estudiante sea capaz de obtener un cultivo puro a través de
procedimientos de laboratorio para su posterior identificación.
DEFINICIONES:
Cultivo: Las bacterias u otros microorganismos que se desarrollan en medios
de laboratorio. Población de microorganismos desarrollados en un medio.
Cultivo Axénico: Órgano de una especie en particular que se desarrolla en un
medio libre de otros organismos vivos.
Cultivo Puro: Aquel que solo contiene una especie de microoganismos.
Cepario: Especies de microorganismos que se mantienen en el laboratorio para
diversos estudios posteriores.
INTRODUCCION:
Un paso fundamental para el diagnóstico bacteriológico es el aislamiento de
bacterias en cultivo puro. Luego por procedimiento de laboratorio de naturaleza
variada (pruebas bioquímicas, coloraciones, serología, etc.) se procede a su
identificación. Por lo tanto es de gran importancia poder realizar las técnicas
para obtención de cultivos puros a partir de una flora mixta.
El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las

bacterias y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el
manejo del laboratorio. A pesar de esto, para determinar las características de
especies concretas de bacterias, es imperativo que el organismo se desarrolle
y se aísle en el laboratorio como cultivo puro. Existe gran variedad de técnicas
por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden
ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro.
Métodos para aislar cultivos puros: Para la técnica de siembra por estrías o
siembra por difusión en placa, con una asa bacteriológica, se pasa una porción
de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecha a base de agar y se
siembra en el medio por estrías o por difusión. Para sembrar por difusión en
placa, por lo común se usa una varilla de cristal estéril para esparcir la muestra.
Esta operación hace posible adelgazar la muestra de tal manera que en la
superficie del agar quedan las bacterias separadas unas de otras. Cabe
suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola célula, y por
tanto, un cultivo puro.
En la técnica de la placa vertida, su principio es la dilución (adelgazamiento) de

la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesitan hacer diluciones

en más de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce
la magnitud de la población bacteriana de la muestra antes de manejarla. El
medio se mantiene al estado líquido a una temperatura de 45ºC para permitir
que el inóculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado, el
medio se pone en cajas de petri, se deja solidificar y después se incuba. Como
algunos microorganismos quedan atrapados dentro del agar, se observarán
colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando éste solidifica.
Las técnicas de siembra por estrías (o por diseminación) y la de placa vertida

para aislar cierta clase de bacterias, puede mejorarse con medios de cultivo
selectivos o diferenciales.
PARTE I
MATERIALES:
 Una suspensión de heces 1:1000
 3 Placa de Agar Soya Tripticasa
 1 Placa de Agar Mac Conkey
 1 Placa de Agar Sangre.
PROCEDIMIENTO:
1. Sembrar una placa de Agar soya tripticasa, Mac Conkey y Agar sangre
con la suspensión de heces utilizando el método de estrías para
extenderlo.
2. Incubar todas las placas a 35ºC ± 2ºC, por 24 horas.
Fig. 2-1 Técnica de siembra por estrías.
PARTE II
MATERIALES:
 Colorante para tinción de Gram
 Portaobjetos
 Microscopio bimocular
 Mechero Fischer
PROCEDIMIENTO:
1. Observar el número y tipo de colonias que hayan crecido en las placas

de Agar soya tripticasa, Mac Conkey y Agar sangre. Notar las diferencias
que hay entre el crecimiento de todas las placas, interpretar los
resultados.
2. Hacer frotis de colonias diferentes obtenidas en el medio de Mac Conkey
y Agar sangre, colorearlos por el método de Gram. Observar al
microscopio y anotar los resultados.
3. En base a los resultados de los frotis seleccionar una colonia formada
por bacterias grampositivas y resembrarlas en el medio de agar soya
tripticasa, incubarlas a 35ºC ± 2ºC, por 24 horas. Hace lo mismo con
una colonia Gramnegativa.
4. De cada una de las placas sembradas tomar 3 colonias aisladas, hacer
frotis y teñir por Gram. Observar al microscopio e indicar si obtuvo
cultivos puros.
DISCUSION
A) Método de Estrías (fundamento y objetivo).
B) Análisis de cada medio de cultivo: nombre, función, clasificación,
composición (sustratos, nutrientes e inhibidores).
C) Descripción de colonias.
D) Análisis de los resultados.
E) Discutir morfología observada.
Fig.2-2 Morfología Bacteriana.
CUESTIONARIO:
1. Diferencias de significado de los términos cultivo puro, axénico y cultivo
mixto.
2. Compare varias de las técnicas para aislar microorganismos en cultivos
puros.
3. Supóngase que un cultivo puro se aisló con una técnica aceptable. ¿Qué
se tendrá que hacer para determinar que lo que se aisló es

verdaderamente un cultivo puro?
4. Describa algunas técnicas para mantener un cepario viable.
5. ¿Qué técnicas se usan para preservar microorganismos en cultivos
puros? ¿Cuáles son las ventajas de cada método?
6. ¿Cuál será el aspecto de desarrollo en un tubo de caldo nutritivo que se
sembró con microoganismos: a) aerobios estrictos b) anaerobios
facultativos c) anaerobios estrictos?
7. ¿Qué aspectos distintivos se deben observar para establecer las
características coloniales de una especie?
REFERENCIA:
1. Zinsser, Joklik, Amos, Wilfret.-(1996). Microbiología. 20ª. Ed. Médica
Panamericana.
2. Davis, Dubelcco, Eisen, Ginsberg, Wood.(2000). Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. España.
4. Lynch, S.S. Rápale, Mellor (1997). Métodos de Laboratorio. Vol. I y II.
Editorial Interamericana.
5. American Type Culture Collection: Catalog of Strain. 12ava. Ed.
Rockville, Md.
6. Lennette EH, Ballows A, Hausler WJ, Shadomy HJ. 1987. Manual de
Microbiología Clínica. 4a. ed. Panamericana. Buenos Aires.
Vo.bo.
Práctica No.3
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS

(ANTIBIOGRAMA)
OBJETIVOS:
 Verificar la prueba estandarizada de susceptibilidad bacteriana a los
antimicrobianos por el método de difusión en agar (método de KIRBY
BAUER).
 Reconocer la importancia de adherirse a las normas estandarizadas
recomendadas para obtener resultados confiables y reproducibles.
 Analizar las posibles fuentes de error inherentes al método e indicar la
forma de evitarlas.
COMPETENCIA:
Que el estudiante sea capaz de realizar la prueba de susceptibilidad a los
diferentes antimicrobianos y determine a que antibiótico es sensible o
resistente la bacteria.
DEFINICIONES:
Antibiograma: prueba de sensibilidad de las bacterias a los distintos
antibióticos, a través del cual se determina su sensibilidad o resistencia.
Antibiótico: Sustancia química producida por microorganismos o modificadas
químicamente que tienen la capacidad, en soluciones diluidas, de inhibir el
crecimiento o de matar otros microorganismos.
Bactericida: Antibiótico que actúa matando a las bacterias.
Bacteriostático: El que inhibe el crecimiento o reproducción de las bacterias.
Susceptible: Cuando los microorganismos responsables de una infección son
inhibidos por concentraciones de antibióticos obtenidos con un régimen usual
de dosificación.
Resistente: Si los microorganismos que causan la infección, toleran
concentraciones de antibióticos superiores a los que pueden obtenerse en la
sangre por medio de un régimen usual de dosificación.
Intermedio: Hoy en día se considera como prueba errática, que por lo tanto
debe de repetirse, ya que realmente se trata de una población bacteriana
resistente.
INTRODUCCION:
La prueba de susceptibilidad sirve para determinar in Vitro a que antibióticos es
susceptible o resistente una determinada cepa bacteriana aislada del paciente.
Este método permite al médico escoger el antibiótico más adecuado con base
científica proporcionada por el laboratorio y así poder dar un buen tratamiento.
Básicamente hay dos técnicas para verificar estas pruebas: dilución en tubo y
difusión en agar. La técnica del disco sobre el agar, se adapta a las
necesidades y fines de la práctica diaria en el laboratorio. Además las pruebas
de susceptibilidad constituyen una ayuda invaluable para la elección de los
agentes antimicrobianos más apropiados para el tratamiento de las
enfermedades infecciosas.
Los antimicrobianos se pueden clasificar de acuerdo con diferentes

propiedades:
 Estructura química
 Acción antimicrobiana
 Espectro de acción
 Mecanismo de acción
 Uso terapéutico
La estructura química es el criterio más usual de clasificación. La acción

antimicrobiana hace referencia al efecto bactericida o bacteriostático del
fármaco. En el segundo caso, las defensas del huésped cooperan a resolver la
infección. Entre los primeros, están los betalactámicos, aminoglucósidos y
quinolonas; entre los segundos, las tetraciclinas y los macrólidos.
El espectro de acción de un antimicrobiano está constituido por el conjunto de

microorganismos frente a los cuales es activo: los de espectro corto actúan
sobre una determinada especie o género (cloxacilina sobre estafilococos), los
de amplio espectro son eficaces frente a un amplio grupo de patógenos
(ampicilina).
Los mecanismos de acción de los antimicrobianos son muy variados: sobre la

pared celular inhibiendo su síntesis (betalactámicos), sobre la membrana
citoplásmica alterándola (polimixinas), sobre la síntesis proteica por
interferencia (aminoglucósidos), sobre los ácidos nucleicos impidiendo su
replicación (quinolonas), sobre el metabolismo actuando como análogos
metabólicos por inhibición competitiva (sulfamidas).
La toxicidad y uso terapéutico no conduce a ninguna clasificación didáctica:

muy tóxicos, inocuos, para infecciones urinarias, etc.
El antibiograma es un método de estudio in Vitro del comportamiento de los

antimicrobianos frente a los agentes infecciosos. Tiene como finalidad
proporcionar información útil para la iniciación y marcha de la terapéutica
antiinfecciosa. Con los resultados obtenidos en el antibiograma clasificamos las
bacterias en: sensibles, moderadamente sensibles y resistentes, a un
determinado antimicrobiano.
La información que proporciona el antibiograma es valiosa, aunque no basta

para el establecimiento de una terapia adecuada si se considera aisladamente
y se aplica sin tener en cuenta las peculiaridades del antimicrobiano, las
características clínicas del proceso infeccioso y las del propio paciente.
Para la realización de antibiogramas es imprescindible partir de cultivos puros

si se quieren obtener resultados fiables. Será necesario seleccionar entre las
técnicas propuestas las de más fácil estandarización, sencillez de ejecución y
resultados más exactos. Los factores que pueden influir en los resultados son
muy variados, aunque la técnica se realice con esmero; las condiciones
metodológicas, por buenas que sean, nunca serán superponibles a las del
organismo humano.
Las técnicas para ensayo de susceptibilidad a antimicrobianos deben ser las

recomendadas por los organismos internacionales: Federation of Drugs and

Food (FDA), Internacional Committee for Susceptibility Test (ICS), Nacional
Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), Center for Disease
Control (CDC). Se proponen tres técnicas: una de difusión en medio sólido, con
discos de carga constante (Kirby-Bauer), y dos de dilución, en medio sólido y
líquido, respectivamente, en las cuales se utiliza una gama de concentraciones
variables del antimicrobiano, con el fin de determinar la concentración mínima
inhibitoria (CMI) o de menor concentración del antimicrobiano capaz de inhibir
el crecimiento bacteriano en unas determinadas condiciones.
Por medio de la técnica de Kirby-Bauer modificada se obtienen resultados

confiables, reproducibles y de gran utilidad clínica siempre y cuando se sigan al
pie de la letra las instrucciones.
Es una técnica relativamente sencilla y siempre debe de efectuarse con el Agar
de Mueller-Hinton. El grosor de la caja, concentración del inóculo, humedad,
temperatura y otros factores deben estar perfectamente estandarizados para
que los resultados puedan ser comparables entre los diversos laboratorios. Es
muy importante tomar en cuenta que esta técnica solo sirve para efectuar el
antibiograma de las siguientes bacterias aeróbicas o facultativas de crecimiento
rápido:
1. Staphylococcus aureus y otras especies patógenas.
2. Estreptococo β hemolítico.
3. Streptococcus pneumoniae.
4. Enterobacterias.
5. Pseudomonas spp. y Burkholderia
6. Vibrio cholerae y otras especies.
El antibiograma para Haemophilus spp y Neisseria spp debe hacerse en Agar

Mueller-Hinton con 5% de sangre de carnero.
Para preparar el Agar de Mueller-Hinton debe seguirse las siguientes

indicaciones:
1. Las cajas de petri deben tener un tamaño estándar (100 mm de
diámetro), deben llenarse con aproximadamente 25 ml de agar líquido
ya autoclaveado, a manera de obtener un medio de 4 mm de grueso.
2. Deben guardarse en refrigeración dentro de bolsas plásticas selladas
(de 2 a 8ºC) por no más de 7 días.
3. El pH del medio debe ser de 7.2 a 7.4
4. De cada lote de medio, incubar de 2-5 cajas por 24 horas a 37ºC para
comprobar su esterilidad.
ALMACENAMIENTO DE LOS DISCOS CON ANTIBIOTICOS

Almacenar los discos de acuerdo con las siguientes instrucciones para que no
pierden su potencial:
1. Congelar (idealmente a -20ºC) los discos de penicilina, ampicilina,
carbenicilina y cefalosporinas. Descongelar periódicamente solo los
discos que serán usados durante la semana. Descongelarlos por lo
menos 2 horas antes de usarlos.
2. Los discos del resto de los antibióticos pueden almacenarse refrigerados
sin congelación. De preferencia con un desecante.
PROCEDIMIENTO:
1. Con el asa flameada y fría tomar 4 a 5 colonias bien aisladas y de igual
morfología del cultivo. Debe trasladarse siempre a un cultivo puro.
2. Inocular un tubo con 4 ml de caldo Mueller-Hinton para bacterias
Gramnegativas y caldo Infusión Cerebro Corazón para bacterias
Grampositivas.
3. Incubar el caldo de 2 a 5 horas a 37ºC, hasta que aparezca una ligera
turbidez.
4. Ajustar la turbidez del caldo, con la turbidez del tubo estándar de Mac
Farland 0.5; si el caldo es más turbio que el estándar, agregar más caldo
o solución salina estéril.
5. Luego inocular la caja presecada de agar Mueller-Hinton así: introducir
un hisopo estéril en el caldo, exprimir bien el hisopo presionándolo
ligeramente contra las paredes del tubo, arriba del nivel del caldo.
6. Con el hisopo exprimido sembrar la caja en 4 direcciones opuestas
sobre toda la superficie, cerca del mechero encendido.
7. Dejar secar la caja de 3 a 5 minutos; pero no más de 15 minutos, con la
tapadera cerrada.
8. Con pinzas estériles, colocar los discos impregnados de antibióticos a
manera que queden lo más separados entre sí. Escoger los antibióticos
a colocar dependiendo de la bacteria aislada.
9. Invertir las cajas e incubarlas por 16 a 18 horas. Nunca usar jarro con
candela (excepto para estreptococo β hemolítico, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus spp y Neisseria spp.).
INTERPRETACION DE RESULTADOS
1. Después de 16 a 18 horas de incubación, examinar con buena luz las
cajas ya con crecimiento.
2. Medir en milímetros el diámetro de los halos de inhibición completa con
una regleta por detrás de la caja de petri.
3. En caso de sulfonamidas, puede ocurrir crecimiento dentro del halo, el
cual no debe de tomarse en cuenta.
4. Transformar las medidas de los diámetros de los halos de inhibición en
milímetros, hacer las lecturas de acuerdo a tablas actualizadas.
INTERPRETACIÓN DE LOS DIÁMETROS DE LAS ZONAS

DE
INHIBICIÓN (mm) PARA MIEMBROS DE LA FAMILIA
ENTEROBACTERIACEAE
DISCUSION:
1. Características del medio de cultivo.
2. principio del Método de Difusión.
3. Elaboración del reporte.
4. Definir Antibiótico. Quimioterapéutico.
5. otros controles: inóculo, discos, siembra e incubación.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el medio de cultivo recomendado para la realización del
antibiograma por la técnica de difusión de Kirby-Bauer?
2. ¿Mediante que técnica se determina la CMI en las pruebas de
susceptibilidad a antimicrobianos?
3. ¿Cuál es la diferencia de una cepa sensible a una moderadamente
sensible a un determinado antimicrobiano?
4. ¿Cuáles son los mecanismos mediante los cuáles las bacterias se
vuelven resistentes?
5. Explique la metodología para realizar un antibiograma a partir de una
colonia aislada de un medo de cultivo.
6. Explique el método de dilución en caldo en placa de microtitulación.
7. Algunas bacterias no son adecuadas para someterlas a pruebas de
susceptibilidad, como por ejemplo: a) Chlamydia trachomatis b)
Treponema pallidum c) Mycobacterium leprae d) M. tuberculosis e)
Legionella pneumophila.
8. la escala de Mac Farland consiste en soluciones crecientes de: a)
hipoclorito sódico y carbonato cálcico b) sulfato cálcico y sulfato bárico c)
fosfato insoluble y agua d) cloruro bárico y ácido sulfúrico e) carbonato
cálcico y agua.
9. Cuál de estos antimicrobianos no es del grupo de los betalactámicos: a)
piperacilina b) ticarcilina c) teicoplanina d) oxacilina e) cefmetazol
10. El ácido clavulánico es: a) una quinolona derivada del ácido pipemídico
b) una betalactamasa c) un inhibidor de betalactamasas d) un
potenciador de betalactamasas e) una quinolona no fluorada.
REFERENCIAS:
1. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS).
1983. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Test for
Bacteria that Grow Aerobically. Tentative Standard. M7-T. NCCLS.
Villanova.
2. National Committee for Clinical Laboratory Standards

(NCCLS).1982. Second Supplement to the performance Standard
for Antimicrobial Susceptibility Test. M2-A2S2. NCCLS. Villanova.
3. García Martos P, MT Fernández del Barrio, F Paredes Salido.
1997. Microbiología Clínica Aplicada. 3ª. ed. Díaz de Santos S.A.
Madrid.
5. Lennette EH, Ballows A, Hausler WJ, Shadomy HJ. 1987. Manual
de Microbiología Clínica. 4a. ed. Panamericana. Buenos Aires.
Vo.Bo.
Práctica No.4
DIAGNOSTICO DE INFECCIONES DE NASOFARINGE Y FARINGE
OBJETIVO:
1. Colectar muestras de exudado faríngeo en forma adecuada y cuando
sea conveniente la estudie para la técnica del examen directo con la
coloración de Gram.
2. Observar los microorganismos presentes en las preparaciones
anteriores y determinar cuales pudieran ser patógenos para la faringe.
Escribir el reporte correspondiente.
3. Inocular los medios de cultivo apropiados con las muestras colectadas
de sus compañeros.
4. Identificar los posibles microorganismos patógenos aislados en los
medios de cultivo y realizar pruebas especiales para su identificación.
COMPETENCIA:
Determinar e interpretar adecuadamente los aislamientos bacteriológicos
obtenidos de los cultivos de los exudados faríngeos y nasofaríngeos.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas las muestras obtenidas para cultivo
de secreciones faríngeas y nasofaríngeas.
DEFINICIONES:
Muestra: Recolección de material orgánico representativo de algún proceso
infeccioso independientemente de su ubicación. La muestra debe ser de buena
calidad y de cantidad suficiente.
Toma de muestra: Es el primero de una cadena de pasos para el diagnóstico
bacteriológico, para decidir la correcta recolección para su cultivo en el
aislamiento de microorganismos responsables de enfermedades infecciosas.
Transporte de la muestra: Recipientes estériles para la recolección de muestras
los cuales ayudan a mantener la humedad e impedir la desecación y muerte de
las bacterias. Facilita la viabilidad de los microorganismos.
Orofaringe: Parte inferior de la inferior situado entre el paladar blando y el
borde superior de la epiglotis.
INTRODUCCION:
La biota normal en las vías respiratorias con frecuencia está constituida por
bacterias raramente patógenas como estreptococos no hemolíticos, especies
de los géneros Micrococcus, Corynebacterium, Staphylococcus coagulasa
Negativos, Neisserias diferentes a Neisseria gonorrhoeae y Neisseria
meningitidis, Lactobacillus, Veillonella y espiroquetas; mientras que los posibles
patógenos son: Acinetobacter, Streptococcus grupo viridans, estreptococos
beta hemolíticos principalmente Streptococcus pyogenes, Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae, Neisseria
meningitidis, Cryptococcus neoformans, Micoplasma, Haemophilus influenzae,
Haemophilus parainfluenzae, Moraxella catarrhalis, Candida albicans, virus
Herpes Simple, especies de Enterobacterias, Mycobacterium, Pseudomonas,
Hongos filamentosos, Eikenella corrodens, Bacteroides, Peptostreptococcus y
Actinomyces.
Los patógenos definidos del conducto respiratorio son: C. diphtheriae

toxigénico, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Micoplasma
pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Bordetella
pertussis, especies de Legionella, Pneumocystis carinni, Streptococcus
pyogenes y Haemophilus influenzae.
El examen microscópico de la secreción respiratoria teñido por el Gram tiene

valor diagnóstico para evaluar la respuesta inflamatoria. En la Angina de
Vincent sirve para observar las estructuras fusoespirilares; también podrá ser
útil en la observación de lesiones seudomembranosas lo que ayudará a
diferenciar la difteria de otros padecimientos. La microscopía también es útil en
infecciones producidas por hongos incluyendo las levaduras en preparaciones
con KOH al 10%.
MUESTRA:
La muestra debe tomarse siempre antes de iniciar algún tratamiento con
antibióticos. Además si el paciente ya comió se recomienda dejar pasar unas
dos horas para que se vuelva formar la secreción deglutida.
Localizar el fondo de la garganta y en las amígdalas (que se encuentran a los

lados), observar las siguientes lesiones:
 Inflamación (enrojecimiento)
 Pus (secreción blanquecina o amarillenta)
 Úlceras blanquecinas.
PROCEDIMIENTO:
Exudado Faríngeo.
Por medio de un abatelenguas exponer los órganos orofaríngeos y con un
hisopo estéril raspar ligeramente las amígdalas y faringe, escogiendo
preferentemente las zonas inflamadas o membranosas, con movimientos
semicirculares de derecha a izquierda.
Exudado nasofaríngeo. Introducir un hisopo de alambre largo o de alginato a

través de una de las fosas nasales y tocar con la pared posterior de la
nasofaringe.Hacer dos frotis y teñir por: Gram y BAAR (cuando sea solicitado).
Observar al microscopio.
Trabajo con las Muestras.

1. Sembrar en los siguientes medios: Gelosa sangre de carnero al 5%,
Agar de Sal y Manitol, Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB) y Gelosa
Chocolate e incubar a 37° C durante 24 horas (La gelosa sangre y
chocolate se incubará en atmósfera de CO 2 por 24-48 horas). Para
proveer de CO2 si no se cuenta con incubadora especial, se recomienda
utilizar un frasco de vidrio (de Mayonesa) colocándole en el interior un
algodón humedecido con agua y una vela. En niños menores de 2 años
o de guardería utilizar además de los cultivos anteriores Agar Hemina
Bacitracina Extracto de Levadura (GHBEL) para H. influenzae ó GC con
polienriquecimiento.
2. Observar morfología colonial y hacer tinción de Gram.
3. Identificar las cepas aisladas mediante pruebas bioquímicas y/o
serología. En caso de aislar un microorganismo patógeno diferente de
S. pyogenes ó S. pneumoniae, realizar sensibilidad a los antibióticos.
4. Si el interés es aislar e identificar estreptococos beta hemolíticos se
descarga el hisopo con el exudado en un caldo de Todd-Hewitt e
incubar a 37° C por 4 horas. Posteriormente sembrarlo en el medio de
Gelosa sangre de carnero al 5% e incubarlo a 37°C por 24 horas en la
jarra con vela. Identificar colonias beta hemolíticas.
INTERPRETACION:
Para interpretar correctamente los crecimientos de los cultivos de
exudados faríngeos, v tomar en cuenta lo siguiente:
INFORME DE RESULTADOS:
1. Aislamiento de Biota Normal.
2. Abundantes Estreptococos Beta hemolíticos probablemente del grupo
“A” (si es sensible al disco de Bacitracina 0.04 U).
3. Biota Normal con predominio de: Haemophilus influenzae, S.
pneumoniae ó de Staphylococcus aureus.
4. Cultivo único de Staphylococcus aureus.
5. Cultivo único de otros microorganismos (anotar género y especie).
CUESTIONARIO:
1. ¿Cómo se realiza la identificación de Streptococcus pyogenes aislado de
garganta?
2. Mencione algunas técnicas rápidas comercializadas para el diagnóstico
de Streptococcus pyogenes.
3. Mencione las bacterias patógenas que son necesario aislar e identificar
en un exudado faríngeo.
4. ¿El hisopado con dacrón o alginato de calcio en un exudado
nasofaringeo se utiliza para aislar que agente etiológico?
5. En portadores sanos de Neisseria meningitidis el microorganismo se

localiza a nivel de: a) la boca b) la nasofaringe c) la faringe d) los
bronquis e) el LCR.
6. Algunas de estas especies de neisserias se suelen encontrar en un
exudado faríngeo en situaciones normales: a) Neisseria sicca b)
Neisseria flavescens c) Neisseria gonorrhoeae d) Neisseria mucosa e)
Neisseria meningitidis.
7. La etiología de la angina fusoespirilar es mixta, causada por: a)
Bacteroides fragilis y Treponema vicentii b) Fusobacterium necrophorum
y Treponema vicentii c) Streptococcus pyogenes y Treponema vicentii d)
Streptococcus pyogenes y Veillonella parvula e) Streptococcus
pyogenes y Streptococcus pneumoniae.
8. De un paciente con epiglotitis aguda aislamos: a) Streptococcus
pneumoniae b) Haemophilus influenzae c) Corynebacterium diphtheriae
d) Staphylococcus aureus e) Streptococcus pyogenes.
9. La Flora normal de la orofaringe no incluye: a) Streptococcus
pneumoniae b) Streptococcus pyogenes c) Streptococcus salivarius d)
Haemophilus influenzae e) Neisseria mucosa.
10. El aislamiento de Neisseria meningitidis de nasofaringe suele indicar: a)
infección localizada b) infección diseminada c) meningitis meningocócica
d) estado de portador nasofaringeo e) desplazamiento de la flora normal.
DISCUSION:
1. Reporte preliminar.
2. Toma de muestra.
3. Cultivo. Medios utilizados. Inoculación. Lectura e interpretación.
4. Subcultivo. Identificación. Antobiograma.
5. Reporte final.
REFERENCIA:
Barón EJ and Finegold SM. Bailey-Scott´s. Diagnostic Microbiology. 8 th. Ed.
P223-237.
Stollerman GH. 1962. The Role of Selective throat culture for beta hemolytic
streptococci in the diagnosis of acute pharyngitis. Am. J. Clin. Pathol. 37:36-
40.
Hérnández M. J., Cano R.E., Giono C.S. Bacteriología médica diagnóstica.
2ª. Edición. Ediciones Cuellar. Pág. 339 - 342. (2003).
Vo.Bo.
Práctica No. 5
ESTUDIO BACTERIOLOGICO DE ESPUTO
OBJETIVO:
Efectuar el estudio microbiológico del esputo para aislar e identificar los
probables agentes etiológicos de IRA de las vías respiratorias bajas.
COMPETENCIA:
El estudiante será capaz de realizar el diagnóstico oportuno de una Infección
Respiratoria a través del procedimiento bacteriológico y citológico del esputo.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas las muestras obtenidas para cultivo
de secreciones bronquiales.
DEFINICIONES:
IRA: Infecciones respiratorias agudas. Aquellos procesos infecciosos menores
de 15 días de evolución que afectan vías respiratorias superiores: oído, nariz,
garganta, laringe, tráquea; y vías respiratorias inferiores: bronquios,
bronquiolos y pulmones.
INTRODUCCION:
Las infecciones respiratorias agudas (IRA) constituyen una de las principales
causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. El análisis de la distribución de
las distintas categorías de IRA señálan que la neumonía es la más grave y
constituye una de las principales causas de defunción.
Actualmente hay 2,000 millones de casos de IRA a nivel mundial en donde 1/50
adquieren neumonía y fallecen del 10 – 20%. El diagnóstico y manejo oportuno
de los casos ha demostrado que puede disminuir la mortalidad. La figura No. 5-
1 señala que las IRAs pueden ser no complicadas o complicadas o sea graves.
Los principales agentes etiológicos suelen ser virus asociados con bacterias y
también se reconoce que pueden ser producidas por hongos y parásitos. Los
microorganismos que se aíslan con mayor frecuencia de procesos infecciosos
de vías respiratorias son: Streptococcus pneumoniae, Haemophillus influenzae,
Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans y otras levaduras. Moraxella
catarrhalis que durante mucho tiempo se aceptó como un residente normal de
farínge, actualmente se considera como un patógeno potencial causante de
otitis media, bronquitis aguda y enfermedad pulmonar obstructiva crónica y es
productor de beta lactamasas, razones por la que debe buscarse en muestras
obtenidas por lavado bronquioalveolar o cepillado bronquial o en pacientes
comprometidos. En el cuadro No. 5-1 se presentan los diferentes cuadros
clínicos y los agentes etiológicos más frecuentes.
En niños, hay que considerar la edad como factor predisponerte, así como el
bajo peso al nacer porque estos microorganismos cambian en los periodos
neonatal, congénito y posnatal; también después de los primeros 3 meses de

vida hasta los 9 años, en que hay otra gran variedad de agentes etiológicos.
Entre las bacterias: S. pneumoniae, H. influenzae y Bordetella pertussis

ocupan los principales lugares, aunque éstas dos últimas se han frenado por
el uso de vacunas específicas.
INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS ALTAS
NO COMPLICADAS COMPLICADAS
ESTREPTOCOCICA NO ESTREPTOCOCICAS
S  ACENITIS
 EPIGLOTITIS
 INFECCIONES DE VIAS
RESPIRATORIAS BAJAS
 MASTOIDITIS
 OTITIS MEDIA
 ABSCESO RETROFARINGEO
 ABSCESO PERIAMIGDALINO
 SINUSITIS
INFECCIONES DE LAS VIAS RESPIRATORIAS BAJAS
NO COMPLICADAS COMPLICADAS
 BRONQUIOLITIS  ATELECTASIA
 CRUP  EMPIEMA
 NEUMONIA  ABSCESO PULMONAR
 TRAQUEOBRONQUITIS  MEDIATINITIS
 PERICARDITIS
 NEUMONIAS
Tomado de: Giono SC. (16). p402

.
Figura No. 5-1 Clasificación de las Infecciones Respiratorias Agudas.

CUADRO No. 5-1 AGENTES ETIOLOGICOS DE ALGUNOS CUADROS CLINICOS

DE IRA.
AGENTES
RESPIRATORIOS RINOFARINGITIS FARINGITIS BRONQUIOLITIS NEUMONIA
VIRUS Rinovirus Adenovirus Sincicial resp. Sincicial resp.

Adenovirus Influenza Parainfluenza Adenovirus
Coxsackie A,B Enterovirus Adenovirus Parainfluenza
Sincicial resp. Parainfluenza Influenza
Influenza Herpes simple Rinovirus
Sincicial Sarampión
Respiratorio
BACTERIAS S. pyogenes S. pyogenes H. influenzae M. pneumoniae

S. aureus S. aureus M. pneumoniae S. pneumoniae
B. pertussis S. pneumoniae K. pneumoniae
M. pneumoniae M. pneumoniae S. aureus
C. diphtheriae E. coli
P. aeruginosa
Bacteroides spp
Legionella spp.
Fusobacterium
HONGOS (solo son de importancia como causas de neumonías):
Cryptococcus neoformans
Coccidioides immitis
Hisotplasma capsulatum
Blastomyces dermatitidis
Paracoccidiodes
brasiliensis
Aspergillus spp.
Penicillium spp.
Pneumocystis carinni
PARASITOS Paragonimus sp.

Entamoeba hidtolytica
Ascaris lumbricoides
Toxoplasma gondii
Tomado de: Giono SC. (16). p403.
Los cuadros clínicos se clasifican en IRA de vías respiratorias altas e IRA de las
vías respiratorias bajas. Los cuadros clínicos las dividen en IRA graves que
constituyen un problema debido al gran ausentismo de las escuelas y centros
de trabajo; las IRA leves por lo general se atienden en casa y se autolimitan y
el agente etiológico suele ser viral; los catarros tienen gran variedad de virus
respiratorios, aparte del sarampión que se puede prevenir por vacunación y si
no se previene puede ser la causa del 15% de los fallecimientos durante un
brote.
En IRA de vías bajas la más importante es la neumonía, los agentes etiológicos

varían mucho dependiendo de la edad y del estado nutricional e
inmunocompromiso de los pacientes. Figura No. 5-1 y Cuadros No. 5-1 y 5-2.
S. pneumoniae es el agente clásico productor de neumonía lobar por lo general

adquirida en la comunidad, y en adultos causa del 20 – 30% de casos de
enfermedad. En pacientes comprometidos y con tratamiento inmunosupresor
como sucede en transplante de órganos, colagenopatías, cáncer o con SIDA, la
neumonía puede complicar estos cuadros, y poner en riesgo la vida de los
pacientes.
Personas mayores de 65 años con alguna condición predisponerte deben

evaluarse cuidadosamente; por lo general se sugiere IRA de vías respiratorias
bajas, si hay leucocitosis y esputo purulento y/o sanguinolento. Algunas veces
hay falla renal o infección urinaria cuando hay enfermedad sistémica asociada,
tal es el caso de la neumonitis; los pacientes con fibrosis quística suelen tener
infecciones repetidas por lo general asociadas a Pseudomonas aeruginosa
multirresistente. No obstante, la esperanza de vida adulta en este grupo varió
de 8% en 1969 a 33% en 1990; aquí el manejo con antimicrobianos es crucial,
ya que si hay colonización por S. aureus o K. pneumoniae es necesario
erradicarlos antes de que se instale Pseudomonas.
El control de IRA incluye como estrategia principal el diagnóstico oportuno. En

niños la respiración rápida, polipnea, con tiraje, tos o cualquier dificultad
respiratoria puede orientar hacia la necesidad de dar antibióticos, pero antes es
necesario hacer el cultivo de la expectoración o por lo menos un frotis teñido
por Gram para aproximar el diagnóstico.
Si no se va a procesar de forma inmediata se coloca en medio de transporte de

Stuart reducido. Antes de sumergirlo en el medio de transporte, se hacen 3
frotis directos, que se utilizan para determinar la representatividad de la
muestra.
Esputo Sospecha de Tinción de

Lavado bronquial tuberculosis BAAR
Lowesteein- 37°C Investigar

Jensen Micobacterias
Otros 8 sem.
diagnósticos
Exámen en fresco Solo continuar Tinción de Gram, Giemsa y

Clasificar celularidad según con muestras de Ziehl-Neelsen.
Welch y Kelly clase III
AEROBIOSIS
24-48 hr
Gelosa sangre Investigar Staphylococcus y
37 °C Streptococcus
Mac Conkey 24-48 hr Investigar Enterobacterias

37 °C
24-48 hr
Gelosa cetrimida Investigar Pseudomonas
37 °C
Bordet-Gengou Investigar Bordetella
37 °C
8 sem.
Sabouraund Investigar Levaduras
28-30°C
MICROAEROFILIA 5 – 10% CO2

ANAEROBIOSIS
24-48 hr
Gelosa GHBEL Investigar Haemophilus
37°C
Gelosa sangre hemina
manadiona
48-72 hrs
37°C 24-48 hrs.
Thayer - Martin Investigar Neisseria
Investigar anaerobios
37°C
FIGURA No. 5-2 AISLAMIENTO DE AGENTES INFECCIOSOS DE VIAS RESPIRATORIAS

BAJAS
TOMADO DE GIONO CS. (16) p407.

TOMA DE LAS MUESTRAS
El esputo se obtiene de la expectoración, previo enjuagado de la boca con

agua corriente, tomado en la mañana al despertar, en un frasco estéril de boca
ancha. Se pueden cultivar secreciones obtenidas del lavado o cepillado
bronquial. Este último es realizado por el neumólogo.
La selección del esputo se hace directamente en el laboratorio mediante el

estudio microscópico por examen en fresco utilizando los criterios de Glecker y
cols. y la modificación de Welch y Nelly relacionada con los criterios de
Nomarsky, que señalan la importancia del examen en fresco para cultivar solo
aquellos esputos que por su elevado contenido de leucocitos y bajo número de
células epiteliales no deben ser saliva y por lo tanto, representan una muestra
adecuada de vías respiratorias bajas. Cuadro No. 5-4
La tinción de Gram a partir de esputos puede contribuir al diagnóstico si la

muestra es representativa y su valor es indiscutible cuando se buscan los
morfotipos predominantes. La coloración de Ziehl Neelsen se hace
rutinariamente para descartar tuberculosis.
Para el diagnóstico microbiológico se recomienda la observación directa de la

muestra de morfotipos predominantes en una tinción de Gram,
inmunofluorescencia directa y el radioinmunoensayo y la
contrainmunoelectroforesis que permiten la identificación de antígenos y que
facultan al médico para establecer una terapéutca adecuada de inmediata para
casos especiales, mientras se espera el resultado del examen microbiológico.
CUADRO No.5-4 CLASIFICACION DEL ESPUTO SEGÚN WELCH Y KELLY.
CLASE GRUPO CELULAS EPITELIALES LEUCOCITOS
I 0 < 25 < 25
1 > 25 < 10
2 > 25 10 - 25
II 3 > 25 > 25
III 4 10 – 25 > 25
5 < 10 > 25
6 < 25 > 25
TOMADA DE: Giono CS. (16). P406.
MATERIALES:
 Campana de seguridad
 Cubrebocas
 Microscopio binocular
 Caja de petri estéril
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Coloración de Gram
 Coloración de Giemsa
 Coloración de Ziehl-Neelsen
 Agar Sangre de carnero al 5%
 Agar Chocolate.
 Agar EMB
 Agar Mac Conkey
 Agar Cetrimida
 Agar Mueller-Hinton
 Agar Manitol Salado
 Agar Biggy
 Gelosa GHBEL para Haemophilus
 Multidiscos para Grampositivos y Gramnegativos
 Mechero Fischer
 Asa de nicromo.
PROCEDIMIENTO:
1. Todas las muestras de esputo deberán trabajarse en una campana de
seguridad de preferencia emplear cubrebocas.
2. Examinar microscópicamente el esputo para investigar la presencia
de sangre y/o material purulento. Anotar estos datos en la hoja de
resultados antes de procesar el producto.
3. La porción más purulenta o con restos de sangre (hemoptoica) del
esputo se colocan en una caja de petri estéril; a partir de ésta se hace
una preparación en fresco. Una vez puesto el cubreobjetos, se
presiona con el fin de que se distribuya en toda la superficie y se
observa. Hacer además 3 frotis, teñir uno con Gram, otro con Giemsa
y el tercero por Ziehl-Neelsen.
4. Observar todo el portaobjetos para determinar la distribución de las
células tipo. Examinar la preparación por la óptica de Normarsky con
el objetivo seco fuerte (40X). Seleccionar 10 campos representativos
y contar el número de leucocitos (L) y de células epiteliales de
descamación (CE). Determinar el porcentaje de cada célula tipo.
Clasificar el esputo de acuerdo al cuadro No. 5-4 propuesto para la
clasificación según Welch y Nelly.
5. Anotar la clasificación que corresponda al esputo. Las que son de
clase III serán cultivadas de acuerdo al protocolo y se realizará tinción
de Gram al frote.
6. Las clases I y II se rechazarán y por lo tanto no se deben cultivar. Al
médico se le debe notificar el motivo del rechazo y además solicitar
nueva muestra; si esto no es posible o si el médico insiste en que se
procesen, ésta se debe cultivar anotando en la hoja de solicitud el
nombre del médico, así como la decisión que se tomó acerca de
procesar un producto que probablemente sólo sea saliva. Los esputos
que fueron rechazados y reemplazados por otros se les debe
practicar la tinción de Gram y el informe se enviará con la siguiente
nota: “Este esputo no fue aceptado para el cultivo debido a la
presencia de más de 25 células epiteliales por campo microscópico
(400X). Por favor remitir nueva muestra al laboratorio”.
7. Algunas veces hay que procesarlos para baciloscopía y cultivo de

tuberculosis, por lo que se recomienda descartarlos a los 2 días
posteriores a la emisión del resultado.
8. Seguir el protocolo para la selección de cultivos y aislamientos de
agentes patógenos de importancia clínica de acuerdo a la Figura No.
5-2.
9. Se informa de los resultados del cultivo y se les hace susceptibilidad
antimicrobiana de los que se consideran patógenos ya sea por su
predominio en la tinción de Gram o porque se sabe que lo son.
DISCUSION:
1. Reporte preliminar.
2. Toma de muestra.
3. Cultivo. Medios utilizados. Inoculación. Lectura e interpretación.
4. Subcultivo. Identificación. Antobiograma.
5. Reporte final.
CUESTIONARIO:
1. En caso de tuberculosis pulmonar, para el diagnóstico es necesario: a)
obtención del esputo de 3 mañanas b) cultivo del esputo en medio de
lowestein c) tinción de Ziehl-Neelsen d) tinción con aureamina del esputo
e) todas las anteriores.
2. Para cultivar secreciones respiratorias de alta calidad es poco adecuada
la muestra obtenida de: a) lavado broncoalveolar b) aspirado
transtraqueal c) punción transpulmonar d) expectoración e) cepillado
telescópico ocluido.
3. El principal microorganismo productor de neumonía nosocomial es: a)
Escherichia coli b) Staphylococcus aureus c) Streptococcus pneumoniae
d) Klebsiella pneumoniae e) Pseudomonas aeruginosa.
4. El principal microorganismo productor de neumonía en pacientes de la
comunidad es: a) Escherichia coli b) Staphylococcus aureus c)
Streptococcus pneumoniae d) Klebsiella pneumoniae e) Pseudomonas
aeruginosa.
5. En brotes de neumonía nosocomial en unidades de cuidados intensivos,
aparte de Pseudomonas es frecuente: a) Chlamydia pneumoniae b)
Acinetobacter baumannii c) Escherichia coli d) Klebsiella pneumoniae e)
Serratia marcescens.
6. La descontaminación de un esputo para cultivo en medio de Lowestein
se realiza con todo menos: a) laurel sulfato sódico b) ácido sulfúrico c)
hidróxido sódico d) trifeniltetrazolio e) fosfato trisódico.
7. Los pacientes con fibrosis quística pancreática padecen frecuentes
infecciones del tracto respiratorio alto ocasionado por: a) pseudomonas
aeruginosa b) Staphylococcus aureus c) Haemophilus influenzae d)
Streptococcus pneumoniae e) Moraxella catarrhalis.
8. En la valoración microscópica del esputo, en base a su contenido en
leucocitos y células epiteliales, se considera adecuado para el cultivo,
con objetivo de 100X: a) más de 10 leucocitos y menos de 25 células
epiteliales b) más de 25 leucocitos y menos de 25 células epiteliales c)
25 leucocitos y 25 células epiteliales d) 10 leucocitos y 25 células
epiteliales e) menos de 25 leucocitos y más de 25 células epiteliales.
9. En pacientes inmunocompetentes, la presencia de levaduras en una

muestra de esputo indica generalmente: a) neumonía fúngica b) muguet
c) colonización orofaríngea d) esofagitis candidiásica e) estomatitis.
10. La flora normal de la orofarínge no incluye: a) Streptococcus
pneumoniae b) Streptococcus pyogenes c) Streptococcus salivarius d)
Haemophilus influenzae e) Neisseria mucosa.
REFERENCIAS:
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Vo.Bo.
Práctica No. 6
HEMOCULTIVO
OBJETIVOS:
1. Aprender la toma de sangre venosa en condiciones asépticas e
inocularlas en los medios de cultivo apropiados.
2. Reconocer en forma macroscópica los signos visibles de crecimiento
bacteriano de un hemocultivo positivo.
3. Conocer los medios de cultivo necesarios para la inoculación de
muestras de sangre en el laboratorio, así como también los
procedimientos efectuados para la identificación bacteriana.
4. Elaborar el reporte final en base a los microorganismos encontrados, si
los hay.
COMPETENCIA:
El estudiante tendrá la habilidad y los conocimientos para realizar el
diagnóstico microbiológico de las enfermedades febriles empleando el
hemocultivo.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas las muestras obtenidas de sangre
para cultivo que cursen por un estado febril.
DEFINICIONES:
Bacteriemia transitoria: La presencia de bacterias en la sangre sin significado
patológico. Esta aparece después de maniobras dentales, endoscopías,
cateterización urinaria, abscesos, furunculosis, celulitis, heridas contaminadas
por intervención quirúrgica, histerectomía vaginal y deshidratación de heridas
infectadas.
Septicemia: Presencia de microorganismos en la circulación sanguínea con
manifestaciones de toxemia y choque y es sinónimo de Bacteriemia persistente
cuando se trata de bacterias.
Piemia: Es la infección purulenta de la sangre con formación de abscesos por
metástasis.
Fungemia, Viremia y Parasitemia: Indican la presencia en la sangre de hongos,
virus y parásitos respectivamente.
Hemocultivo: Es una muestra de sangre tomada en forma aséptica por punción
venosa inoculada en los medios de cultivo para el desarrollo de
microorganismos.
INTRODUCCION:
La fiebre es un síndrome caracterizado por hipertermia, taquicardia, taquipnea,
quebrantamiento, intranquilidad o estupor. Se acompaña de artralgia, mialgia,
anorexia, sed, elevación de pulso y de la respiración, oliguria, sudoración,
sequedad de las mucosas y en ocasiones síntomas neurológicos diversos.
Generalmente se presenta escalofrío previo a la elevación de la temperatura.
Las enfermedades que presentan fiebre tienen su origen en las infecciones, los
traumatismos, las neoplasias, los accidentes vasculares y las alteraciones
hematopoyéticas, inmunológicas o del metabolismo. El factor común es la
lesión tisular, cuyos productos inducen a transtornos en la termorregulación
cerebral.
En todas las enfermedades infecciosas sistémicas, se presenta fiebre,
condición que aún puede presentarse en otras en donde no hay invasión de los
tejidos. Cuadro 6-1.
Cuadro 6-1. Enfermedades Infecciosas que presentan cuadro febril.
Infecciones piógenas: Sinusitis

Del bajo abdomen Osteomielitis
Diverticulitis Otitis
Apendicitis Neumonías
Enfermedad inflamatoria pélvica Fiebre del arañazo del gato
Infecciones intracraneales Bacteriemia sin foco primario conocido
Infecciones granulomatosas Enfermedades virales
Enfermedades por Rickettsias Enfermedades por Espiroquetas
Enfermedades por Clamidias Parasitosis
Micosis
Tomado de: Rosner MS.(18)
Después de la fagocitosis de los microorganismos por acción de las toxinas o

de los productos de degradación tisular, las células fagocitarias liberan unas
sustancias de naturaleza polipeptídicas conocida como pirógeno endógeno que
induce a cambios en los metabolitos (ácido araquidónico), en los
neurotransmisores y en los iones, que actúan elevando la temperatura corporal.
Se han identificado otros pirógenos endógenos o citocinas pirógenas que son
polipéptidos que derivan de tumores necrosados: el factor de necrosis tumoral;
las interleucinas son pirogénicas principalmente IL-1 y el interferón. La fiebre
por infecciones agudas generalmente es de duración corta; puede presentarse
con un principio brusco, temperaturas altas, síntomas respiratorios, malestar
intenso (mialgias, artralgias, fotofobia, cefalalgia), naúsea, vómito, o diarrea;
hipertrofia rápida de los ganglios y del bazo, signos meningeos, leucocitosis o
leucopenia. En las infecciones crónicas la fiebre es de curso prolongado.
En el hemocultivo la sangre se inocula directamente en un medio líquido o

bifásico, pero en ocasiones la sangre es concentrada y lisada para inocularse
en los medios sólidos. Para el aislamiento de algunos microorganismos se
utilizan métodos especiales de laboratorio, como es el caso de Bordetella,
Leptospira, Mycobacterium, Haemophilus, Streptobacillus, Francisella y
Neisseria.
El hemocultivo es el recurso más útil para determinar el diagnóstico específico

de las infecciones sistémicas, ya que cuando es positivo refleja una infección
activa y conduce a la confirmación del diagnóstico clínico. Sin embargo un solo
cultivo negativo no excluye la posibilidad de la bacteriemia o la septicemia. Así
en los casos de la fiebre tifoidea y la tularemia, los cultivos son positivos
generalmente durante la primera semana, disminuyendo posteriormente y en la
brucelosis crónica son negativos. El cuadro 6-2 da indicaciones clínicas que
recomienda la práctica del hemocultivo.
MUESTRAS DE SANGRE
Adultos: 10 ml. Niños: 3 ml.
METODO MANUAL METODO AUTOMATIZADO

EN MEDIOS LIQUIDOS
Aerobiosis Anaerobiosis
Cambios en el medio Cambios en el medio
Tinción Gram Tinción Gram
Cocobacilos Bacilos Gramnegativos Cocos y bacilos Bacilos pequeños

Gramnegativos Crecimiento rápido Grampositivos pleomórficos Gram (-)
Crecimiento lento (24 – 48 horas)
Gelosa sangre MacConkey Gelosa sangre Agar Hemina

Gelosa soya tripticasa de carnero Bacitracina extracto de
Levadura (GHBEL)
Catalasa
Investigar Brucella Investigar (+) Investigar Investigar Haemophilus

y pseudomonas Enterobacterias Staphylococcus y influenzae tipo b
Listeria (β-hemólisis)
(-)Streptococcus
Figura No. 6-1. Diagnóstico de Laboratorio de las Enfermedades Febriles.
Cuadro No. 6-2. Indicaciones Clínicas Básicas para practicar Hemocultivos
1. Cuando hay septicemia a partir de un foco infeccioso (malestar, temperatura, taquicardia,

escalofrío, postración).
2. Infección crónica diseminada (Gonocóccica o Meningocóccica).
3. Diseminación de infecciones graves: neumonías, absceso hepático o renal, meningitis,
Infección de las vías biliares.
4. Infección intravascular diseminada: endocarditis bacteriana subaguda, endocarditis
bacteriana aguda.
5. Infecciones sistémicas: fiebre tifoidea, brucelosis, fiebres entéricas, leptospirosis.
6. Infecciones iatrogénicas: catéteres, infusiones endovenosas contaminadas.
7. Bacteriemias transitorias por endoscopías, extracciones dentales o traumas pequeñas.
8. Sepsis neonatal o en huéspedes comprometidos con inicio insidioso y de evolución rápida.
Tomada de: Rosner MS (18).
Los mielocultivos, son de utilidad cuando no se aislan los microorganismos de

la sangre en la brucelosis, fiebre tifoidea e histoplasmosis. En la demostración
del microorganismo es de gran importancia el volumen recolectado; se ha
recomendado una cantidad de sangre que está en una relación 1:10 a 1:20 con
el medio líquido utilizado, por lo que deben obtenerse 10 ml en los adultos y 1 a
2 ml en los niños, no obstante algunos métodos como el empleado en el Centro
Médico Beth Israel utiliza 20 ml.
Es conveniente tomar por lo menos tres muestras en el periodo de 24 horas;

con intervalos de 1 hora previa a la aparición de la fiebre, ya que las bacterias
generalmente circulan en la sangre en forma intermitente. Las muestras, deben
de tomarse por triplicado, para incubarse en aerobiosis, anaerobiosis y
atmósfera parcial de dióxido de carbono. Como la fiebre se presenta de forma
intermitente es conveniente tomar 2 ó 3 muestras durante el día.
Los medios de cultivo sólidos deben contener como anticoagulante polianetol

sulfonato de sodio (SPS) que además inhibe parcialmente el efecto de algunos
antibióticos (aminoglucósidos) inactiva a polimorfonucleares y disminuye el
poder bactericida del suero, aunque inhibe el desarrollo de
Peptoestreptococcus anaerobius y de las neisserias patógenas, y algunas
cepas de Haemophilus influenzae, lo que se evita agregando al medio gelatina
en una concentración de 1 a 2%. En el caso de pacientes que han recibido
terapia de antibióticos del tipo de las penicilinas es conveniente agregar a los
medios de cultivo penicilinasas y sacarosa al 10 al 15%, ésta última como
estabilizador osmótico.
Los microorganismos que más frecuentemente se aislan de los cultivos de

sangre son los siguientes: Estafilococos (coagulasa positivo y negativos) y
Micrococos. Bacterias coliformes y otros microorganismos entéricos,
Pseudomonas spp., Estreptococos α y β hemolíticos, Neumococos,
Enterococos, H. influenzae, C. perfringens y microorganismos afines, N.
meningitidis y N. gonorrhoeae, Salmonella spp, Brucella spp, Francisella
tularensis, Listeria monocytogenes, Leptospiras spp, Campylobacter fetus y
vibriones afines, Hongos oportunistas: Candida y torulopsis.
MUESTRA:
La recuperación de las bacterias de la sangre depende de los siguientes
factores:
1. Cantidad de sangre que se cultiva. En niños debe ser al menos 2.5 ml y
en los adultos usualmente 5 ml.
2. La relación entre la sangre y caldo de cultivo debe ser siempre 1:10, es
decir sangre al 10% en caldo, con el objeto de evitar coagulación.
3. La presencia de inhibidores bacterianos en el suero tales como
anticuerpos, complemento o antibióticos.
4. La característica de la bacteria de ser “fastidiosa”, es decir que requiere
de un medio de cultivo enriquecido y complejo.
5. El hemocultivo debe obtenerse siempre antes de iniciar tratamiento con
antibióticos.
6. En algunos casos se justifica obtener varias muestras del paciente, en
tiempo y sitios diferentes, es decir “seriado”.
INSTRUCCIONES PARA LA TOMA DE UN HEMOCULTIVO:

1. Para la desinfección de las botellas, descubrir el tapón de hule
perforable. Hay que limpiar el tapón de la botella con un algodón
empapado en solución de yodo al 3% y alcohol, limpiar bien el tapón
perforable y dejar secar al aire.
2. Se selecciona el sitio para la venipuntura. Colocar la ligadura en el brazo

del paciente, luego palpar la vena y localizar con precisión el sitio donde
se va a puncionar. Es conveniente seleccionar un lugar diferente para
cada toma.
3. Debe evitarse extraer sangre de catéteres intrarteriales o intravenosos
permanentes a menos que la sangre no pueda obtenerse por
venopuntura.
4. El sitio de venopuntura se limpia vigorosamente con un hisopo de
algodón impregnado de tintura de yodo al 3%. Dejar secar y luego
limpiar el sitio de punción con un algodón empapado en alcohol al 70%,
con movimientos circulares en forma de espiral que se inicia en el sitio
de la punción, es decir, dando movimientos concéntricos del centro a la
periferia por 30 segundos. Hay que dejar que seque, sin soplar con la
boca y no se debe tocar el sitio después de que fue desinfectado.
5. Con aguja y jeringa estériles, puncionar la vena y obtener asépticamente
5 ml o más de sangre. Se debe mezclar bien para evitar que se coagule.
Usar una nueva aguja si falló la primera vez.
6. Inyecte en condiciones estériles exactamente 5 ml de sangre en el
frasco que contiene 45 ml de caldo o 10 ml en un frasco con 90 ml de
caldo. En los hemocultivos pediátricos, inyectar 2.5 ml de sangre en 25
ml de caldo.
7. Agitar suavemente las botellas ya inoculadas e incubar a 35ºC.
VOLUMEN DE LA MUESTRA.
Volumen de la muestra es crítico ya que la cantidad de organismos en la
mayoría de las bacteriemias es poca, especialmente si el paciente esta bajo
tratamiento antimicrobiano. En los niños la cantidad de organismos es
generalmente mayor que en los adultos, por lo que la cantidad de sangre
requerida es menor.
Volumen recomendado:
Niños: de 1 a 5 ml. de sangre venosa.
Adultos: de 10 a 30 ml. de sangre venosa.
MATERIALES
 Agar sangre de carnero
 Agar chocolate
 Agar Mac Conkey
 Agar Sal y Manitol
 Agar Base Sangre
 Antisuero polivalente anti-salmonella
 Asa de nicromo
 Mechero Fischer
 Hemocultivo de Ruíz Castañeda
 Yodo al 3%
 Torunda de alcohol al 70%
 Jeringa y aguja desechable estéril
 Jeringa de insulina
 Portaobjetos
 Torniquete
 Bioquímicas para Gramnegativos.
 Multidiscos Grampositivos y Gramnegativos.
PROCEDIMIENTO:
1. Después de colectar la sangre e inocular al medio con anticoagulante,
incubar a 37°C en condiciones aerobias durante siete días, excepto en
casos especiales en los cuales de prolongarse la incubación, por
ejemplo para el aislamiento de Brucella spp.
2. Con mucho cuidado para que el caldo no se agite, hacer una inspección
visual de los frascos contra la luz cuando menos una vez al día durante
3 días y luego 2 a 3 veces por semana hasta completar 21 días para
buscar algunos de los siguientes signos visibles que indican crecimiento
bacteriano, los cuales orientan hacia el tipo de bacteria que está
creciendo:
Cuadro No. 6-3. Signos de crecimiento visible en hemocultivos líquidos causados por organismos encontrados en la
sangre.
3. Si se utiliza el medio de Ruíz-Castañeda inspeccionar los frascos a

diario y buscar colonias en la superficie del agar como señal de un
cultivo positivo.
4. En caso de observar cualquiera de los signos visibles enunciados en el
cuadro 6-3, agitar suavemente, limpiar el tapón perforable con algodón y
alcohol, puncionar con una jeringa de insulina y aguja estéril, y aspirar

una pequeña cantidad de caldo para realizar subcultivos.
5. Para el estudio rutinario se inocula una gota en cada medio de
preferencia en dos cajas, una de gelosa sangre y otra en gelosa
chocolate bajo condiciones anaerobias para incubar en atmósfera parcial
de dióxido de carbono. Si se sospecha de una enterobacteria con
crecimiento en gelosa sangre y chocolate (colonia grande y mucoide)
resembrar en placa de agar EMB o MacConkey. El uso de otros medios
de cultivo se restringe a aquellos casos en que se sospeche de la
presencia de algún organismo fastidioso que no se desarrolle en los
medios mencionados (Figura No. 6-1). Simultáneamente dejar secar dos
gotas del caldo sobre un portaobjetos, colorear con Gram.
6. Observar cuidadosamente el frotis coloreado por Gram con objetivo de
inmersión, pues la observación de las bacterias es la base de su
caracterización. Además, algunas bacterias como Haemophilus
influenzae no produce signos visibles en el caldo.
7. Si se observan cocos Grampositivos esféricos y con tendencia a
agruparse en racimos, inocular una caja de Agar sal manitol, para
facilitar el aislamiento e identificación de Staphylococcus aureus. Si se
observan diplococos o cadenas cortas de cocos Grampositivos
ovalados, aplicar los discos de optoquina y bacitracina sobre la segunda
estría del agar sangre, para aclarar la identificación presuntiva de
Streptococcus pneumoniae y Streptococcus pyogenes.
8. Efectuar subcultivos de los frascos sin crecimiento visible a las 72 horas
para confirmar que se trata de un cultivo negativo. En ausencia de
crecimiento visible se efectúan resiembras a las 48 horas y luego cada
semana hasta completar los 21 días para que se puedan descartar y
considerarse como negativo.
9. Los subcultivos se incuban por 24 a 48 horas a 37°C. A menos que se
sospeche de organismos fastidiosos de crecimiento lento o de muestras
de pacientes que recibieron antibióticos. En este caso se prolonga el
periodo de incubación a 30 a 45 días.
Recomendaciones:
 Usar guantes de hule al manejar cualquier fluido biológico.
 Dentro de lo posible, realizar el trabajo en una campana de
seguridad o en su defecto con cualquier tipo de protección como
cubrebocas y gogles o caretas.
 Eliminar en forma adecuada todo el material contaminado.
Colocar las jeringas, agujas y otros materiales afilados
contaminados en un recipiente de metal o vidrio.
 Hay que tener cuidado extremo al colocar la cubierta protectora a
una jeringa contaminada.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
1. Con 7 días de incubación a 35ºC se recupera el 95% de las bacterias

clínicamente significativas. Si se observa en Mac Conkey el crecimiento
de colonias lactosa-negativa sospechosas de Salmonella typhi, aglutinar
inmediatamente con antisuero polivalente anti-Salmonella. Si hay
aglutinación franca, reportar inmediatamente la presencia de Salmonella

typhi.
2. Algunas bacterias importantes en hemocultivos positivos, son los
siguientes:
 Salmonella typhi
 Escherichia coli
 Streptococcus pneumoniae
 Staphylococcus aureus
 Streptococcus pyogenes
 Pseudomonas aeruginosa
 Haemophilus influenzae
Algunas bacterias que frecuentemente crecen en los hemocultivos como

contaminantes provenientes de la microbiota de la piel son:
 Bacillus spp.
 Corynebacterium spp.
INFORME:
1. Los hemocultivos deben reportarse como negativos si no se observa
crecimiento bacteriano a los 21 días de incubación, NUNCA ANTES.
Reportar así: NEGATIVO A LOS 21 DIAS DE INCUBACION A 35ºC.
2. Si el hemocultivo presenta crecimiento a cualquier tiempo de incubación
reportar cuanto antes la bacteria aislada, identificada si es posible, hasta
especie, aunque la identificación sea presuntiva. Reportar así: SE AISLO
SUSCEPTIBILIDAD PENDIENTE.
3. En el caso de aislamiento e identificación de Streptococcus pneumoniae
o Streptococcus pyogenes de hemocultivo, reportar así: SE AISLO
Streptococcus , se recomienda tratamiento con
penicilina. Si se trata de S. pneumoniae, hacer la prueba de sensibilidad
a la penicilina.
4. Después de interpretar los resultados de la prueba de susceptibilidad
antimicrobiana, enviar otro reporte así:
Se aisló:
Susceptible a:
Resistente a:
Intermedio a:
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuánto tiempo se mantiene en incubación un hemocultivo rutinario
antes de descartarlo como negativo? a) 48 horas b) 72 horas c) una
semana d) 14 días e) 21 días.
2. ¿Cuánto tiempo se incuba un hemocultivo de un paciente con sospecha
de brucelosis? a) una semana b) 14 días c) 21 días d) un mes e) un mes
y medio.
3. ¿Cuántos hemocultivos se extraen a un paciente con fiebre continua? a)
uno b) dos c) tres d) cuatro e) seis
4. ¿Cuál es el momento idóneo para extraer un hemocultivo a un enfermo
bajo tratamiento antimicrobiano obligado? A) en cualquier momento b)
antes de la administración de la dosis c) nunca d) cada 24 horas e)
después de la administración de la dosis.
5. En pacientes con endocarditis bacteriana, para aislar el agente etiológico

son necesarios: a) dos hemocultivos en días consecutivos b) tres
hemocultivos a intervalos de media hora, en 24 horas c) tres
hemocultivos a intervalos de 24 horas d) dos hemocultivos al inicio y fin
del pico febril e) tres hemocultivos a lo largo de 48 horas.
6. En caso de bacteriemia: a) la fiebre es evidente b) el paciente sufre
escalofríos c) la fiebre puede no existir d) la bacteria está en sangre al
elevarse la temperatura e) la bacteria está en sangre al bajar la
temperatura.
7. En caso de brucelosis, el medio de hemocultivo más idóneo para aislar
el agente etiológico es: a) medio de Skirrow b) medio de Rosenow c)
medio con extracto de cerebro-corazón d) Medio de Ruíz Castañeda e)
medio de tripticasa soya.
8. La mortalidad de las septicemias es elevada y depende de: a) la puerta
de entrada b) la edad del paciente c) el estado de las defensas del
organismo d) del agente causal e) todas las respuestas anteriores son
verdaderas.
9. Con respecto al hemocultivo no es correcto: a) si existe fiebre continua,
se extraerán hemocultivos seriados b) debe obtenerse un mínimo de 5
ml de sangre en niños c) en caso de endocarditis, se incubará el
hemocultivo 30 días d) si existe antibioterapia, conviene suspenderla 48-
72 horas antes de la extracción e) si existen picos febriles se extraerá
solamente un hemocultivo en el pico.
10. Señale algunos sistemas de procesamiento automatizado de los
hemocultivos.
11. ¿Cuándo está indicado la práctica del hemocultivo?
DISCUSION:
1.Obtención de la muestra.
2.Medios de cultivo utilizados e incubación.
3.Elaboración de reporte preliminar.
4.Resultado final.
5.Resultado del antibiograma.
REFERENCIAS:
Hérnández M. J., Cano R.E., Giono C.S. Bacteriología médica diagnóstica. 2ª.
Edición. Ediciones Cuellar. Pág. 18-20. (2003).
Barlett RC, Ellner PD, Washigton JA. 1974. Blood Culture. Cumitech I. J.C.
Sherris (Ed). ASM Press. USA.
Baron EJ, Finegold SM. 1990. Diagnostic Microbiology. The CV Mosby, Co.
Baltimore. Pag 49 – 62.
Calderón Jaimes E. 1977. Conceptos Clínicos de Infectología. 4a. Ed. E.
Méndez Cervantes. México, pag. 333-335.
Dorn GL, Haynes JR, Burson GG. 1976. Blood Culture Technique Bases on
Centrifugation, J. Clin. Microbiol. 3(3):251-257.
Koneman EW, Allen DS, Dowell B and Sommers HH. 1979. Color Atlas anr
textbook of Diagnostic Microbiology. Lippincott, Co. USA. Pag 111-151.
Strand CL, Shulman JA. 1988. Bloodstream Infections. Laboratory Detection
and Clinical Considerations. ASCP. Chicago.
Difco Manual 1985. Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology.
10th. Ed. DIFCO Laboratories. Detroit USA. P857.
Gibbs B and Akinner FA. 1966. Identification Methods for Microbiologist.
Academic Press. London England. P35.
Graber ChD. 1970. Rapid Diagnostic Methods in Medical Microbiolgy. Ed.
Williams and Wilkins. Baltimore USA. P82.
Isenberg HD, Washington JA, Ballows A and Sonnerwith AC. 1985. Collection,
Handling and processing of specimens. In: Lennette EH, Ballows A, Hausler
WJ. Manual of Clinical Microbiology. 4 th. Ed. P73-96. ASM Press. Washington
DC.
Vo.Bo.
Práctica No. 7
DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO DE LAS VIAS URINARIAS

UROCULTIVO
OBJETIVOS:
1. Aprender a tomar una muestra limpia de orina y a dar indicaciones sobre
dicho procedimiento.
2. Realizar examen directo con coloración de Gram de las muestras de
orina proporcionadas. Observar los resultados, los interprete y hacer elv
reporte preliminar.
3. Verificar el recuento de bacterias en las muestras por el método del asa
calibrada, sembrar en placas e interpretar los resultados.
4. Identificar los posibles microorganismos patógenos e Interpretar los
resultados.
COMPETENCIA:
El estudiante tendrá la habilidad y los conocimientos para realizar el
diagnóstico bacteriológico cuantitativo de las infecciones de las vías urinarias.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas las muestras de orina para cultivo
que cursen por un estado de infección de vías urinarias.
DEFINICIONES:
Piuria: presencia de leucocitos en la orina.
Hematuria: Presencia de sangre en la muestra de orina.
Infección de vías urinarias: Presencia de bacterias, piuria y en algunas
ocasiones hematuria.
Chorro medio: recolección de orina de la parte media de la micción.
Pielonefritis: es una inflamación de uno o ambos riñones dañando las neuronas
y la pelvis renal.
Glomerulonefritis o enfermedad de Bright: es una inflamación del riñón que
afecta al glomérulo.
Infección del tracto urinario (ITU): cuando la orina está turbia por la presencia
de bacterias, leucocitos o hematíes.
INTRODUCCION:
El sistema urinario está constituido por los riñones, los uréteres, la vejiga
urinaria y la uretra y su función más importante es ayudar a mantener la
homeostasis corporal al eliminar los desechos circulares a través del riñón en
forma de orina, los uréteres transportan la orina de los riñones hacia la vejiga
en donde se almacena hasta que se expulsa del cuerpo.
Las vías urinarias normalmente son estériles por encima del nivel de la uretra
distal. Los microorganismos que infectan las vías urinarias altas son
comensales localizados en áreas vecinas. En esta colonización intervienen
varios factores predisponentes que pueden ser de origen local o general. Los
primeros incluyen la contaminación fecal del meato urinario, el cateterismo, la
patología urinaria congénita o adquirida y el reflujo vesical. Entre los factores
generales están la diabetes mellitas, la agammaglobulinemia, el embarazo y la
terapia con fármacos de amplio espectro.
Las bacterias que con mayor frecuencia se aislan de la orina de pacientes

ambulatorios con infección urinaria son Escherichia coli (80%), Staphylococcus
saprophyticus, Proteus spp, Klebsiella spp, Enterococcus faecalis y
Streptococcus pyogenes. En los pacientes hospitalizados infectados
intranosocomialmente se aisla con frecuencia E. coli, S. epidermidis, Klebsiella
spp y Enterobacter spp. Con muy poca frecuencia se han descrito a otros
agentes patógenos como Mycobacterium spp, Salmonella typhi, Haemophilus
influenzae, Leptospira, Gardnerella vaginalis, Tricomonas vaginalis,
Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Las infecciones mixtas
causadas por dos o más especies bacterianas son raras, por lo que el
crecimiento con varios tipos de colonias indican contaminación. La
demostración de piuria y bacteriuria, son ambas de gran importancia para
establecer el diagnóstico de infección urinaria.
Cuando la orina está turbia debido a la presencia de leucocitos (piuria), en

ocasiones de eritrocitos (hematuria) y/o bacterias, se dice que existe una
infección de las vías urinarias (ITU). La bacteriuria puede ser asintomática o
presentarse como una enfermedad aguda ó crónica.
La ITU tiene tres presentaciones clínicas: las infecciones de las vías urinarias
bajas (cistitis) que es una infección de la vejiga y afecta principalmente a la
mucosa y a la submucosa; las infecciones de las vías urinarias altas que
afectan riñón causando pielitis que es una infección de la pelvis renal y sus
cálices y, la pielonefritis que es una inflamación de uno o ambos riñones
dañando las nefronas y la pelvis renal, y las infecciones de uretra (uretritis). La
glomerulonefritis o enfermedad de Bright es una inflamación del riñón que
afecta al glomérulo y es debida a una reacción alérgica a la toxina que
producen los estreptococos los cuales han infectado unos días antes otra parte
del organismo, en especial la garganta; la orina presenta eritrocitos y proteínas.
La ITU agudas son más comúnes en las mujeres que en los hombres.
Los síntomas que se asocian con la ITU incluyen ardor al orinar (disuria),
urgencia orinaria, formación excesiva de orina (poliuria), dolor púbico y de
espalda, orina turbia, escalofríos, fiebre, náuseas, vómitos, y en los hombres es
común la presencia de secreción uretral.
Las ITU pueden ocurrir de “novo” o como infecciones recurrentes, las que se
presentan como recaídas si no son causadas por el mismo microorganismo; y
las reinfecciones que son causadas por microorganismos diferentes al que se
aisló en los cultivos anteriores.
RECOMENDACIONES GENERALES
1. La muestra de elección para hacer el diagnóstico es la primera orina de

la mañana. En el caso de la mujer, debe observarse especial cuidado en
la toma de la muestra, ya que sus genitales están expuestos, por lo tanto
hay una abundante colonización de bacterias. Proceder de la siguiente
manera:
En las mujeres se les indica que se coloquen sobre la tasa del inodoro
con las piernas abiertas. Con los dedos ìndices y medio de la mano
derecha izquierda debe separarse los labios genitales mayores. Indicarle

que deben lavarse el área periuretral y el perineo, utilizando una gasa
estéril humedecida con agua y jabón, usando movimientos de adelante
hacia atrás, posteriormente se limpiará el área con una gasa estéril
humedecida con agua, solución salina estéril o benzal; la recolección de
la orina debe hacerse separando los labios mayores con una mano, la
otra mano sostiene el frasco donde se deposita la muestra. Tapar el
frasco rápidamente.
2. A los varones se les indica que se limpien el meato urinario con una
gasa estéril humedecida con agua destilada o solución salina estéril
inmediatamente antes de la micción.
3. En ambos sexos, la muestra debe tomarse por el método del “chorro

medio”, que consiste en que el paciente debe desechar la primera
porción de la orina y recibir la parte media del chorro en un frasco de
boca ancha estéril.
4. En algunos pacientes como en el recién nacido, niños y ancianos la

toma por este método puede dificultarse, por lo que la muestra puede
recibirse en una bolsa de plástico estéril; en los niños tener la
precaución de introducir todo el pene en el orificio del llenado y en las
niñas que el agujero de la bolsa quede pegado al centro por donde
saldrá la orina; en niños desinfectar bien con jabón desinfectante o
neutro no irritante, todo el pene y el área genital. En las niñas desinfectar
bien los labios mayores y el área genital que los rodea. Quitar bien el
jabón con gasa y agua estéril, luego secar finalmente con una gasa
estéril seca. Las muestras tomadas en estas condiciones fácilmente se
contaminan con biota fecal debido a lo anterior, en un resultado positivo
debe considerarse la posibilidad de una contaminación.
5. Si no es posible inocular el Urocultivo antes de una hora de obtenida la

muestra, refrigerarla (no congelar). La muestra conservada en
refrigeración se mantiene en buenas condiciones para ser inoculada, por
un máximo de 24 horas.
El método de laboratorio de elección para el diagnóstico de las ITU es la

siembra, aislamiento, cuantificación e identificación de la bacteria.
El diagnóstico de laboratorio está basado en los siguientes criterios:

A. Eisemberg y Alexander (1953) y Bernard y Store (1953)
consideran como agentes causales aquel microorganismo que se aisla
repetidas veces, en urocultivos sucesivos.
B. Otro criterio es considerar como responsable a las
bacterias aisladas de las muestras de orina, que presentan 5 o más
leucocitos por campo siempre que se haga la observación de una gota de
orina homogeinizada por agitación y observada con objetivo a seco fuerte.
C. En un frote teñido por Gram y observado con el objetivo de
inmersión, la presencia de una o más bacterias nos da una correlación de
que en la orina existen 100,000 UFC/ml. ó más y cuando hay piuria se
observa cuando menos un leucocito por campo. En orinas con menos de

10,000 UFC/ml. el frote no revela ni bacterias, ni leucocitos. La presencia de
células epiteliales y flora bacteriana vaginal indica que la orina ha sido mal
tomada y por lo tanto deberá repetirse.
D. De acuerdo con el llamado “Criterio de Kass” un número de
bacterias mayor o igual a 100,000 UFC/ml (Unidades formadoras de
colonias por mililitro de orina) se considera infección verdadera, es decir, es
un recuento significativo.
Kass y Sanford (1957) proponen que cuentas menores a 100,000 UFC/ml
podrían corresponder a infecciones en las vías superiores en pacientes que
han recibido antimicrobianos, o en aquellos cuya orina está muy diluida por
la terapia hidratante; por último, cuentas menores de 10,000 UFC/ml se
toman como contaminantes. La centrifugación de orina y el cultivo del
sedimento NO se recomiendan en absoluto.
MATERIALES:
 Placas de Agar Sangre
 Placas de Agar Mac Conkey
 Placas de Agar EMB
 Placas de Agar Bilis Rojo Violeta
 Agar Cuenta Estándar
 Asa Calibrada de 10 µl
 Micropipeta de 10-100 µl
 Micropipeta de 1000 µl
 Puntillas amarillas y azules para micropipeta estériles.
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
 Tubos de vidrio de 13 X 100 mm
 Mechero fischer.
 Tubos de 16X150 mm con 9.9 ml de solución salina estéril.
 Varillas de Hockey estériles.
PROCEDIMIENTO:
1. Anotar las características de la orina, agitar el frasco, y sembrar la orina

en tres medios de cultivo según la técnica del asa calibrada. Los medios
de cultivo a utilizar son:
a) Agar sangre de carnero al 5% donde crecen la mayoría de los
microorganismos.
b) Agar Mac Conkey y EMB: crecen solo los bacilos Gramnegativos
aerobios (Enterobacterias) pues es selectivo y diferencial.
2. Para sembrar usar una asa calibrada de platino de 10 µl, abrir el frasco
delante del mechero. Introducir verticalmente el asa flameada y fría en la
orina, justamente por debajo de la superficie.
3. Inocular primero el agar sangre deslizando el asa una sola vez a lo largo
de la caja de petri pasando por el centro. Flamear e inocular de igual
forma el medio de EMB y Mac Conkey.
4. Inmediatamente estriar el inóculo de orina, en las 3 cajas, haciendo

estrías tupidas y perpendiculares a la estría dejada por el asa calibrada.
5. Inmediatamente incubar el agar sangre a 35ºC en jarro de boca ancha

con un trozo de papel húmedo o algodón y una vela encendida, cerrar
bien.
6. Incubar el agar EMB y Mac Conkey en aerobiosis sin jarro en la

incubadora a 35ºC.
7. Finalmente, llenar un tubo de 13 X 100 mm limpio de orina, centrifugar a

3,000 rpm durante 5 minutos, decantar el sobrenadante y con el
sedimento colocar una gota en un portaobjetos al cual se le colca un
cubreobjetos para observar al microscopio bacterias, leucocitos y
eritrocitos.
8. A otro portaobjetos colocar otra gota del sedimento de orina, distribuir en

el centro del mismo, dejar secar, fijar con metanol absoluto y colorear
con la tinción de Gram. Observar la morfología bacteriana.
INTERPRETACION
1. Después de incubar las cajas durante 18-24 horas interpretar los

resultados de las cajas simultáneamente y con buena luz.
2. Contar el número de colonias que desarrollan en las cajas en Agar

sangre de carnero, EMB y Mac Conkey y multiplicar por 100,
tomando en consideración que se toman 10 l. de orina. Realizar el
diagnóstico siguiendo el procedimiento descrito en la figura 7-1.
3. Recuentos mayores de 100,000 UFC/ml de orina, cepa pura:

identificarlo con bioquímica, hacer sensibilidad y reportarlo.
Método de dilución con pipeta:

1. Se colocan 0.1 ml de orina en 9.9 ml de solución salina (dilución 10 2) y
se homogeiniza el tubo perfectamente.
2. Con una pipeta estéril se toman 0.1 ml de esta dilución y se transfiere a
un segundo tubo conteniendo 9.9 ml de solución salina (dilución 10 4).
3. Se toman 0.1 ml de cada uno de los tubos y se depositan en placas de
medio de cultivo seleccionados.
4. La suspensión bacteriana se extiende con una varilla de vidrio estéril, se
incuba a 37 grados centígrados de 18-24 horas, se cuentan las colonias
y se calculan las UFC/ml de acuerdo con el factor de dilución
correspondiente.
Método de Vaciado en placa (método de referencia):

1. Se coloca 1 ml de cada una de las diluciones arriba mencionadas
dentro de cajas de petri estériles.
2. Cuidadosamente se agrega el medio de cultivo fundido (agar cuenta
estándar) y enfriado a 45 grados centígrados, se rota suavemente la
placa para que se homogenice perfectamente y se deja solidificar el

medio.
3. Se incuban las placas a 37 grados centígrados de 18-24 horas y se
cuentan las colonias.
4. Considerando el factor de dilución se calculan las UFC/ml presentes
en la muestra de orina.
Si de acuerdo al criterio de Kass y Sanford el número de bacterias es
mayor a 100,000 UFC/ml., se procede a identificar al microorganismo
por los métodos usuales y realizar el antibiograma.
Informar el número de bacterias por mililitro, asimismo el
microorganismo que se identificó y su comportamiento frente a los
antimicrobianos probados.
Si la cuenta se encuentra entre 10,000 y 90,000 UFC/ml solicitar una
nueva muestra con el propósito de repetir el diagnóstico. Las orinas que
al término de la incubación no resulten con crecimiento bacteriano, se
reportan como SIN DESARROLLO DE BACTERIAS.
Cuadro No. 7-1 Criterios establecidos para reportar una probable ITU.
Muestras de orina (5-10 ml)

TINCION DE GRAM
CUANTIFICACION
BACTERIANA:
Sembrar por:
 Asa calibrada
 Dilución con pipeta.
 Vaciado en placa
 Extensión en placa
Placas de Agar sangre Placas de Agar EMB

de carnero al 5% ó McConkey
37C/24-48 h.
(5-10% CO2) 37C/24-48h.
Contar las UFC/ml. Contar las UFC/ml.
> 100,000 UFC/ml. > 100,000 UFC/ml.
Deben ser identificadas. Deben ser identificadas.

Buscar Grampositivas: Buscar Gramnegativas:
Staphylococcus Enterobacterias
Streptococcus Pseudomonas
Seleccionar colonias y
Tinción de Gram sembrar en:
Prueba de la catalasa  MIO
Prueba de la coagulasa  LIA
 TSI
 Agar citrato
37C/24-48 h.
Leer resultados y realizar:

 Prueba de oxidasa
ANTIBIOGRAMA
 Prueba de catalasa
Tomado de: Giono SC. (10). p106

Figura No. 7-1 PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE ORINA.
CUESTIONARIO:
1. Citar las técnicas de recogida de orina para cultivo: a) micción
espontánea b) cateterismo vesical c) punción suprapúbica d)

directamente en placa de cultivo e) todas las anteriores.
2. El tiempo máximo de realización de un urocultivo tras la recogida de la
orina por micción y sin refrigerar es de: a) 12 horas b) 3 horas c) menos
de 1 hora d) menos de 30 minutos e) debe realizarse inmediatamente.
3. Con respecto al urocultivo es incorrecto: a) la orina matinal es la más
adecuada b) la bolsa colectora debe cambiarse cada 30 minutos c) para
cultivo es mejor recoger toda la orina de 24 horas d) la orina debe
cultivarse antes de una hora tras su obtención e) la refrigeración de 6-12
horas conserva la orina.
4. En niños con problemas de micción, la técnica más adecuada para
recolección de orina es: a) micción espontánea tras ingesta de líquidos
b) bolsa colectora c) bolsa colectora y estimulación del reflejo de Pérez
d) punción-aspiración suprapúbica e) escobillaje uretral.
5. Para el cultivo de orina se prefiere: a) la primera orina de la mañana
completa b) la porción final de la primera micción c) la primera parte de
la orina de la mañana d) la porción intermedia de la primera micción e)
una micción tras ingesta de líquido.
6. ¿Cuáles son los dos microorganismos más frecuentes en infecciones del
tracto urinario? A) Staphylococcus aureus b) Streptococcus faecalis c)
Escherichia coli d) Pseudomonas aeruginosa e) Proteus mirabilis.
7. Según el criterio de Kass, para considerar una orina infectada debe
mostrar un recuento bacteriano: a) superior a 1’000,000 de bacterias por
litro b) superior a 100,000 bacterias por litro c) igual o superior a 500,000
bacterias por mililitro d) igual o superior a 100,000 bacterias por mililitro
e) entre 50,000 y 100,000 bacterias por mililitro.
8. Se entiende por infección urinaria primaria: a) la que se da por primera
vez en la vida b) la que se presenta sin antecedente previo
desencadenante c) la que cursa de forma asintomática d) la que
presenta un foco desencadenante e) todas las respuestas anteriores son
válidas.
9. Clínicamente, una infección urinaria puede cursar como: a) febril
monosintomática b) shock bacteriémico c) síndrome miccional d)
bacteriuria asintomática e) todas las respuestas son válidas.
10. La máxima incidencia de infecciones urinarias polimicrobianas
corresponden a) niñas recién nacidas b) pacientes con sonda
permanente c) pacientes con infecciones urinarias de repetición d)
pacientes diabéticos e) embarazadas.
11. La infección urinaria favorece la litiasis, y viceversa, especialmente en el
caso de microorganismos: a) indolígenos b) productores de
betagalactosidasa c) Grampositivos d) Urealíticos e) Gramnegativos.
12. En cuanto al sexo, la infección del tracto urinario es más frecuente en: a)
niños en la edad infantil b) niñas menores de 3 años c) mujeres en la
edad media de la vida d) hombre en la edad adulta e) hombres en la
tercera edad.
DISCUSIONES:
1. Muestra de orina. Obtención, cantidad y procesamiento.
2. Detección de bacterias por la coloración de Gram en orina no

centrifugada. Aplicación.
3. Utilidad de usar agar sangre, EMB y Mac Conkey y tinción de Gram.
4. Cultivo. Inóculo. Uso del asa calibrada. Siembras en los medios de
cultivo.
5. Diferenciar los métodos de:
 Asa calibrada
 Dilución con pipeta.
 Vaciado en placa
6. Extensión en placa
7. Uso del factor y reporte.
REFERENCIAS
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Medical Microbiology. A Short Course. Wiley-Liss Inc. New York, USA.
p111-112, 301-302, 349, 378, 397-399.
2. Barry LA, PB Smith and M Turck. 1975. Cumitech No.2. Laboratory
Diagnosis of Urinary Tract Infections. ASM Press. Washington, DC.
USA.
3. Enciclopedia Familiar de la Salud. 1979. Promesa. p712.
4. Forbes BA, DF Sahm and AS Weissfeld. 1999. Bailey and Scott`s
Diagnostic Microbiology. 10th. Ed. The CV Mosby Company. pp350-
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5. Kass EH and SH Zinder. 1957. Bacteriuria and the Diagnostic of
Infections of the Unrinary Tract. Arch. Inter. Med. 100:709-714.
6. Kunin MC. 1994. Unrinary Tract Infections in Females. Clin. Infect. Dis.
18:1-12.
7. Kumate J.,G Gutiérrez, O Muñoz y JI Santos. 1994. Manual de
Infectología Clínica. 14ava. Ed. Méndez Editores. México. pp327-362.
8. Maskell R. 1985. Infecciones de Vías Urinarias. Editorial Científica.
PLM.
9. Pérez Miravete A y H Sánchez Manitas. 1962.Vnuestras experiencias
con el método cuantitativo de Kass en el diagnóstico de las infecciones
de las vías urinarias. Rev. Lat. Microb. 5(2):65-79.
10. Giono C. S., Escobar G.A. Zárate A.M. Manual de Técnicas de
Laboratorio. Volumen I. Instituto Nal. de Diagnóstico y Referencias
Epidemiológicas (INDRE). Secretaría de Salud. 1995.
11. Hérnández M. J., Cano R.E., Giono C.S. Bacteriología médica
diagnóstica. 2ª. Edición. Ediciones Cuellar. Pág. 18-20. (2003).
12. Koneman, Allen, Dowell y Sommers. Diagnóstico Microbiológico.
Editorial Médica Panamericana. Pág. 15-32. (1991).
Vo.Bo.
Práctica No. 8
DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES BACTERIANAS DEL APARATO

GASTROINTESTINAL (COPROCULTIVO)
OBJETIVOS:
1. Realizar el aislamiento e identificación de bacterias enteropatógenas y
vibrios a partir de materia fecal procedente de pacientes con diarrea.
2. Observar y describir la morfología de las Enterobacterias aisladas de la
muestra de heces.
3. Utilizar un medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de
bacterias entéricas y sepa interpretar los resultados obtenidos.
4. Utilizar medios diferenciales para evaluar la actividad bioquímica de las
bacterias que aisle e interprete los resultados obtenidos.
5. Realizar pruebas serológicas para la identificación de las principales
enterobacterias patógenas.
6. Elaborar su reporte final en base a los resultados obtenidos utilizando
las tablas de referencia para la identificación de la Familia
Enterobacteriaceae.
COMPETENCIA:
El estudiante tendrá la habilidad y los conocimientos para demostrar por medio
del cultivo, la presencia de bacterias enteropatógenas, es decir que infectan el
intestino penetrando o no su mucosa. Esto causa diarrea, dolor abdominal,
fiebre y a veces la muerte.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas las muestras fecales para cultivo
que cursen por un estado de infección bacteriana gastrointestinal.
INTRODUCCION:
Las enfermedades infecciosas del aparato gastrointestinal representan una de
las principales causas de mortalidad y morbilidad infantil por la diarrea aguda
de niños menores de 5 años (28,36).
En el tercer mundo, los cuadros diarreicos constituyen un problema serio ya
que se presentan asociados a desnutrición, de manera que se establece un
círculo vicioso para el niño enfermo; así las cifras por diarrea y/o sus
complicaciones se calculan en cuatro millones de muertos por año. (15)
La terapia de rehidratación oral para el tratamiento de las diarreas se considera

efectiva; no obstante, la forma de administrarla, el acceso limitado en áreas
rurales, la falta de educación de los padres y la carencia de servicios de
atención primaria para los niños enfermos, hacen imperativa la implementación
de programas para erradicar la diarrea eficientemente (5).
La patogénesis de la diarrea involucra a varios microorganismos como agentes

causales, pertenecientes en su mayoría a la familia Enterobacteriaceae, entre
los que destacan: Salmonella, Shigella, Yersinia y Escherichia coli (cuadro 8-1)
(9,33). La diarrea se puede clasificar de acuerdo con el mecanismo de
patogenicidad; por ejemplo, la diarrea líquida o secretora se asocia con la
producción de enterotoxinas y la diarrea con moco y sangre (disentería) se
relaciona con la presencia de microorganismos invasivos. La diarrea del viajero
se refiere a este grupo como factor de riesgo (4,19).

E. coli forma parte de la biota normal, sin embargo las cepas patógenas se
clasifican de acuerdo con su mecanismo de patogenicidad en seis grupos (35):
1. Enteropatógena (EPEC)
2. Enterohemorrágica (EHEC)
3. Enterotoxigénica (ETEC)
4. Enteroagregativa (EaggEC)
5. Enteroadherente (DAEC)
Difusa
6. Enteroinvasiva (EIEC)
Campylobacter y Helicobacter (18,19) se incluyen como causantes de

enfermedad en el aparato gastrointestinal; al igual que Vibrio, Aeromonas y
Plesiomonas (13). Dada la importancia del cólera a partir de su reaparición en
México en Junio de 1991, se incluye en la figura 8-1.
MUESTRA:
Para efectuar un coprocultivo pueden inocularse las siguientes muestras:
 Heces frescas (la mejor muestra).
 Hisopo rectal (cuando no se obtienen heces)
 Material obtenido por proctoscopía.
 Biopsia de mucosa intestinal.
Las muestras deben tomarse antes de iniciar tratamiento con antibióticos. Las
heces deberán procesarse lo más pronto posible, de preferencia de 2-3 horas
de ser emitidas.
El hisopo rectal es una buena toma de muestra (en caso de no ser posible
obtener muestras de heces recientes), porque arranca las bacterias que se
encuentran dentro de la mucosa. En los adultos, introducir con cuidado en el
ano un hisopo estéril 4 cm, dar 3 vueltas a la derecha y 3 vueltas a la izquierda.
En niños, introducir el hisopo 2.5 cm y dar la misma cantidad de vueltas.
Cuando las heces, que se encuentran a 37ºC dentro del intestino, son
colocadas y permanecen a temperatura ambiente (aproximadamente a 20ºC),
el pH baja considerablemente (acidez) y hace que las bacterias, especialmente
Shigella spp pierda su viabilidad (capacidad de reproducirse en cultivo). Por
esta razón si la muestra de heces no se procesa con la velocidad ya indicada,
debe colocarse en un medio de transporte, que evite los cambios bruscos de
pH, por ejemplo Cary-Blair, caldo Hafna GN (gramnegativo) o Glicerol-salino
bufferado (especialmente para Shigella).
Para Salmonella utilizar un caldo de enriquecimiento selectivo como el Caldo

de Selenito y Cistina o bien Caldo Tetrationato para eliminar la flora
contaminante o indeseable.
CUADRO 8-1
AGENTES ETIOLOGICOS DE DIVERSOS SINDROMES DIARREICOS
SINDROMES CARACTERISTICAS AGENTES ETIOLOGICOS

Diarrea aguda líquida Mecanismo no inflamatorio, Rotavirus
Mediado por entrerotoxinas. E.coli enterotoxigénica (ETEC)
E. coli enteropatógena (EPEC)
E. coli enteroadherente (EAEC)
Salmonella spp.
Cryptosporidium
Vibrio cholerae
Clostridium perfringens
Bacillus cereus
Staphylococcus aureus
Vibrio parahaemolyticus
Giardia lamblia
Vírus norwalk
Adenovirus 40,41
Campylobacter jejuni
Campylobacter coli.
Diarrea con sangre Mecanismo inflamatorio por Shigella spp.
invasión del epitelio intestinal, Entamoeba histolytica
denominado usualmente como E.coli enterohemorrágica (EHEC)
disentería. También hay E. coli enteroinvasiva (EIEC)
presencia de moco y leucocitos Campylobacter jejuni
en las heces. Salmonella: enteritidis, choleraesuis
y paratyphi.
Vibrio parahaemolyticus
Yersinia enterocolítica
Trichinella spiralis
Schistosoma japonicum
Balantidium coli
Clostridium difficile
Diarrea crónica/mal Interferencia del agente Giardia lamblia
absorción infeccioso con la actividad Ascaris lumbricoides
normal del tracto intestinal, Necator americanus
pero sin un daño aparente en Strongyloides stercoralis
pacientes no Trichuris trichiura
inmunodeficientes. Cryptosporidium
Isospora belli
Fiebre entérica Mecanismo invasivo con Salmonella typhi
penetración a través de la Yersinia enterocolítica
mucosa intestinal y Campylobacter fetus subspp. Fetus
diseminación hematógena a Salmonella paratyphi A y B
todo el organismo Salmonella choleraesuis
Yersinia pseudotuberculosis
Gastritis o atrofia Colonización del epitelio Helicobacter pylori
gástrica gástrico con ulceración.
Adaptado de: Valdespino JL y Col. Magnitud y trascendencia de las infecciones

gastrointestinales. P3-50. En: Giono S, Escobar A y Valdespino JL. Diagnóstico de laboratorio
de infecciones gastrointestinales. INDRE-SSA, México.
Materia fecal
Sembrar en APA Sembrar en Sembrar en Sembrar en Rotafore Exámenes

MacConkey caldo Campy BAP sis coproparasitos
tetrationato cópicos:
directo,
concentración
100% de las (Richie),
10% de las muestras cuantitativo
muestras Seleccionar Sembrar en Seleccionar (Kato Katz) y
colonias y ASB y VB, colonias y especiales.
Ensayar con el sembrar en TSI, seleccionar sembrar en
reactivo LIA y MIO. colonias y TSI. Hacer
CoA V. ch. O1 sembrar en pruebas de
Sembrar en TCBS TSI, LIA y acetato de
MIO. plomo e
hidrólisis
Reacciones de de hipurato. Identificación
Seleccionar aglutinación con de quistes de
colonias amarillas y sueros anti- protozoarios y
sembrar en TSI, grupos A,B,C y Tipificación de huevos y
LIA, MIO, caldo D de Shigella. de Rotavirus larvas de
peptonado y salmonella helmintos.
Arginina. con sueros
anti-A, B, C1, Campylobacter
E. coli C2, D y E.
Reacción de Yersinia
aglutinación con
suero anti V.
cholerae O1
APA= agua peptonada alcalina, ASB= agar sulfito de bismuto, VB= verde brillante.
 Enviar las cepas al INDRE-SSA para confirmación.
FIGURA 8-1 ESTUDIOS CENTINELA DE DIARREAS EN HOSPITALES PEDIATRICOS.

Adaptado de: Valdespino JL y Col. (36)
Tomado de: Giono-Cerezo S. (12) p205.
Salmonella
Shigella
Escherichia coli
Yersinia enterocolítica 24 h/37oC
Seleccionar colonias para
MacConkey identificar Yersinia
enterocolítica
Materia fecal o
hisopo rectal
Selecciar colonias no
fermentadoras de lactosa
(Salmonella y Shigella). En
lactantes seleccionar
colonias fermentadoras de
lactosa (E. coli, Shigella).
24 h/37oC
48 h/37oC
Sulfito de Bismuto Seleccionar colonias negras
(Salmonella Typhi)
Caldo tetrationato
Seleccionar colonias rojas
Salmonella-Shigella 24 h/37oC con centro rojo
(Salmonella Typhi)
Vibrio
APA pH=9
6 h/37oC
Hisopo rectal
Seleccionar colonias
amarillas (V. cholerae) y
colonias azules (V.
TCBS 18-24 hr parahaemolytcus).
37 °C
Campylobacter jejuni.
48 h/42oC
Materia fecal o hisopo Medio selectivo 5% CO2 Seleccionar colonias para
rectal de Butzler o identificar a Campylobacter
Campy-BAP 10% N2 jejuni.
FIGURA No. 8-2 AISLAMIENTO DE BACTERIAS ENTEROPATOGENAS A PARTIR DE

HECES.
Tomado de: Giono-Cerezo S. (12) p188.
Los agentes etiológicos que producen cuadros diarreicos se presentan en el

cuadro 8-1, agrupados arbitrariamente en: diarrea aguda líquida, diarrea con
sangre, diarrea crónica, síndrome de mala absorción, fiebre entérica y gastritis
o atrofia gástrica (36).
El estudio microbiológico de la materia fecal para el aislamiento e identificación

de bacterias productoras de diarreas se llama “coprocultivo” (12,30) y en
conjunto con el diagnóstico clínico, es un gran apoyo para que los médicos
puedan establecer la terapia correcta y oportunamente a fín de combatir estas
enfermedades. Figura 8-1. (7,8)
Las muestras de heces se recolectan directamente en un frasco limpio y estéril

de boca ancha con tapa hermética, al inicio de la enfermedad y antes de dar
tratamiento antimicrobiano, las cuales tienen que etiquetarse debidamente para
procesar en el laboratorio de inmediato. Cuando es imposible recolectar la
muestra diarreica o cuando se pretende recuperar microorganismos como
Shigella y Campylobacter, es necesario tomar dos hisopos rectales
impregnados de material fecal, los cuales se colocan en un medio de transporte
de Cary-Blair (se puede usar otros medios de transporte como el de Stuart o
Amies) si se van a procesar en un periodo mayor de 2 horas a partir de la toma
(5, 7,12).
Actualmente en el diagnóstico se incluye cólera, además de otros agentes, de

ahí que se requieran dos hisopos. Las muestras para búsqueda de Rotavirus
se manejan aparte, ya que se hace una suspensión en solución salina de
fosfato y se congela hasta su procesamiento (5). El examen
coproparasitoscópico se toma en otro frasco y se envía a la sección de
parasitología. (Figura 8-1). (12)
Hasta hace algunos años la proporción de análisis positivos era de un 10 a un

20% aún en las mejores condiciones del laboratorio; este porcentaje se
incrementa cuando se incluyen en la búsqueda todos los agentes
mencionados, lo que involucra usar varios medios de cultivo selectivos y
diferenciales para su aislamiento primario y la identificación. (6, 12,13,20).
La inoculación en medios de aislamiento primario selectivos y diferenciales se

selecciona de acuerdo a la figura 8-2: la elección depende de los recursos de
laboratorio, del número de muestras que se procesen y del agente que se está
buscando, sobre todo en brotes o en estudios epidemiológicos dirigidos (6,
25,30). Se recomienda el uso de un medio de cultivo diferencial poco inhibitorio
como el MacConkey o el EMB y un medio de enriquecimiento como el caldo
tetrationato de Mueller o caldo tetrationato modificado por Kauffmann (ambos
se reducen con solución de yodo yodurada en el momento de inocularla,
también se puede emplear caldo selenito (7).
La proporción de materia fecal en los medios de enriquecimiento es del 10%

(peso/volumen) y el tiempo de incubación varía de 12 a 18 horas a 37 grados
centígrados, con resiembra en dos placas de medios selectivos y diferenciales
más inhibitorios y altamente selectivos como: el verde brillante o sulfito de
bismuto. El segundo hisopo se emplea para inocular un tubo que contenga 10
ml de agua peptonada alcalina pH 9.0, que sirve para el enriquecimiento de

Vibrio cholerae, este se incuba 8 horas a 37 grados centígrados y se resiembra
en una placa del medio de TCBS (tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa) (Figura 8-2)
(12,13).
Las colonias aisladas por estría cruzada se identifican empleando pruebas

metabólicas en tubos de 13X100 mm, la experiencia permite seleccionar solo
unos cuantos medios que den suficiente información para llegar por lo menos a
la identificación hasta género y/o especie. La figura 8-3 presenta la
diferenciación de algunas enterobacterias cuando se emplea los medios de
LIA, TSI y MIO. El cuadro 8-2 presenta las pruebas comunes de laboratorio
para el estudio de enterobacterias y su lectura (7). El cuadro 8-3 presenten las
reacciones en los medios LIA, TSI y MIO; por lo general estos medios dan más
de una prueba metabólica por tubo (12).
El medio LIA (agar lisina hierro) ayuda a separar la tribu Proteae cuando da la
desaminación oxidativa de la lisina (7).
El TSI (agar de triple azúcar hierro) es muy útil para la identificación; algunos
laboratorio emplean algún medio equivalente al TSI, el KIA (Kligler, doble
azúcar hierro), este último solo contiene glucosa y el TSI contiene además
sacarosa (7).
El medio MIO (agar movilidad indol ornitina) en algunos géneros como

Salmonella distingue Salmonella typhi que no descarboxila la ornitina, en
cambio las otras especies de Salmonella además de Arizona y algunas
especies de Citrobacter si lo hacen. La identificación de las bacterias se hace
de acuerdo a los cuadros 8-2, 8-3 y a la figura 8-3 (2, 6, 9,12).
El cuadro 8-4 presenta algunas pruebas diferenciales de los géneros

Salmonella y Shigella, los cuales son los principales patógenos que se buscan
mediante el coprocultivo (12, 28, 30 37).
La identificación de colonias sospechosas amarillas en el medio de TCBS

sugestivas de Vibrio cholerae se inicia con la prueba de oxidasa y se agrega
además un tubo con medio base de Moeller con arginina para verificar la
descarboxilación; Vibrio cholerae es oxidasa positivo y no descarboxila la
arginina (13).
H2S + + - - -
INDOL + o (-) - o (+) + + -
K/A MOV + o (-) + + o (-) + +
R/A – TSI – o ORN - + + - -
A/A P. vulgaris C. diversus Morganella Providencia P. rettgeri
H2S - - - - +
INDOL - - + + -
A/A MOV + - + o (-) - +
ORN + o (-) - - o (+) - +
Serratia K. pneumoniae E. coli K. oxytoca Salmonella
Enterobacter
K/K
LIA – o – TSI
K/N
H2S + + - - +
INDOL + - + - -
MOV + + + o (-) + + o (-)
K/A ORN + + - o (+) + -
Edwarsiella Salmonella E. coli Enterobacter Salmonella typhi
H2S + - - - -
INDOL - + - + -
MOV + o (-) + o (-) + o (-) + o (-) -
K/A
ORN - o (+) + + + - o (+)
C. freundii C. diversus Enterobacter Morganella Shigella
C. amalonaticus
A/A
o – TSI
K/A
H2S + + - - -
INDOL - + - + o (-) +
MOV + + + o (-) - - o (+)
A/A ORN - o (+) + - + - o (+)
C. freundii C. diversus E. coli Y. enterocolítica E. coli
E. agglomerans
 Y. enterocolítica es móvil a 25ºC pero no a 37ºC.
FIGURA 8-3
AISLAMIENTO DE ENTEROPATOGENOS A PARTIR DE HECES
Adaptado de: Valdespino JL y Col. (36)
PRUEBA MEDIO REACTIVO INCUBACION REACCION REACCION

ADICIONAL 37ºC POSITIVA NEGATIVA
ACETATO Medio de Simmon’s 1 – 4 dìas Azul Verde

con azul de bromofenol
ACIDO
SULFHIDRICO TSI o KLIGLER 18 – 24 hrs Negro Sin cambio
USO DE CITRATO Citrato de Simmon`s 1 – 4 dìas Azul Verde

Citrato de Christensen
CRECIMIENTO Caldo KCN 1 – 4 dìas Crecimiento Sin crecimiento

EN KCN Cianuro de Moeller (turbiedad) (Transparente)
LISINA LIA 1 – 2 dìas Púrpura Amarillo
ORNITINA MIO 24 horas Púrpura Amarillo
LISINA Medio de Moeller con 1 – 10 dìas Violeta a Rojo Amarillo

ORNITINA púrpura de bromocresol
ARGININA con aceite mineral.
FENILALANINA Agar fenilalanina Cloruro 4 – 24 hrs Verde Sin cambio

DESAMINASA Fèrrico al 10%
GLUCOSA TSI o KLIGLER 18 – 24 hrs Glucosa: fondo Rojo

LACTOSA amarillo. Sacarosa
SACAROSA y Lactosa: sup.
amarilla.
FERMENTACION Caldo base rojo de 18 – 24 hrs Superficie Rojo

DE AZUCARES fenol. amarilla.
PRODUCCION Caldo base rojo de 18 – 24 hrs Burbuja de gas Ausencia gas

DE GAS A PARTIR fenol con campana
DE AZUCARES de Durham.
INDOL MIO y SIM Kovac o 1 – 2 dìas Rojo amarillo paja

Ehrlich.
USO DE Caldo malonato con 2 dìas Azul Verde

MALONATO azul de bromocresol
MOVILIDAD MIO y SIM 1 – 2 dìas Turbiedad en Crec. solo en

todo el medio. sitio de punciòn
REDUCCION Caldo nitrato Naftilamida 24 hrs Rojo Amarillo

DE NITRATOS y ac. Sulfanìlico incoloro.
ROJO DE Caldo base RM-VP Rojo de 2 – 5 dìas Rojo Amarillo

METILO metilo
UREASA Caldo urea de Stuart 8 hrs. a 2 dìas Rosa Sin cambio

Urea de Christensen
V–P Caldo base RM-VP Alfa naftol 5% 2 – 3 dìas Rojo Amarillo o

KOH 40% incoloro.
Descarboxilación.  Producción de ácido.

Adaptado de: Giono – Cerezo S. (12) p196-197.
CUADRO 8-2
PRUEBAS COMUNES PARA EL ESTUDIO DE ENTEROBACTERIAS
En caso de aislar Salmonella o Shigella se debe completar la identificación con

antisueros polivalentes y monovalentes específicos (7).
Los serotipos de Salmonella se determinan de acuerdo a la combinación de los

determinantes antigénicos O, H y Vi presentes en las cepas, según el esquema
de Kauffmann-White, aunque varios serotipos se agrupan en serogrupos por
compartir determinantes antigénicos del polisacárido O (7, 22, 33). Shigella se
agrupa en 4 serogrupos y múltiples serotipos por el antígeno O, denominados
A, B, C y D (por ser inmóviles carecen de antígeno H) (7,33).
En vibrio se confirma el estudio con una reacción de aglutinación en presencia

de antisuero polivalente O1 y O139. Si la reacción resultase negativa se
informa como Vibrio cholerae NO: O1 o vibrios no coléricos (5,8,12,13). Las
cepas que se obtengan se deben enviar al Laboratorio de Bacteriología
Entérica del INDRE, a donde debe referirse las cepas para su confirmación
ulterior y para hacer seguimiento epidemiológico (12).
El empleo de métodos inmunológicos para diagnóstico se enfoca

principalmente a la determinación de la inmunidad frente a una infección, por
ejemplo, la determinación de anticuerpos contra S. Typhi en fiebre tifoidea
mediante la reacción de Widal, y/o la prueba de aglutinación en capilar (1).
Otros métodos de uso bastante restringido para la detección de Salmonella en
muestras clínicas y/o ambientales incluyen: coaglutinación. ELISA,
inmunofluorescencia, ensayos inmunomagnéticos e hibridación de DNA (5, 10,
23, 26, 29, 34).
En E. coli más que identificación del agente se realiza la detección de cepas

ETEC por hibridación en fase sólida (Colony Blot). También se utilizan pruebas
de aglutinación, coaglutinación y ELISA para la detección de ETEC y EHEC
(14).
Para la detección de Shigella en heces se ha diseñado ensayos

inmunomagnéticos y PCR con diversos iniciadores para diferentes secuencias
genéticas (11, 21, 27, 29, 32, 38).
La detección directa de Campylobacter en heces, se puede hacer por

aglutinación con partículas de látex, inmunofluorescencia y uso de sondas de
DNA con marcaje radioactivo y/o no radiactivo (17).
En el caso de Vibrio cholerae, la detección de cepas toxigénicas O1 u O139 se

realiza por ELISA con GM1 y PCR con los iniciadores con el locus ctxAB (31).
La detección de cepas O1 en APA (a partir de hisopos rectales, pero no de
muestras ambientales) se realiza por coaglutinación y en México se diseñó el
reactivo CoAVich (16, 31).
MATERIALES:
 Placas de Agar Mac Conkey

 Placas de Agar Salmonella-Shigella
 Placas de Agar XLD
 Placas de Agar Sulfito de Bismuto
 Placas de Agar Hektoen
 Placas de Agar Base Sangre
 Placas de Agar TCBS
 Placas de Agar EMB
 Caldo Selenito Cistina
 Caldo de Tetrationato y yodo
 Caldo peptonado alcalino
 Bioquímicas: TSI, LIA, MIO, Urea, Arginina, RM-VP, Citrato, Malonato,
indol y Fenilalanina.
 Antisuero polivalente para Salmonella y Vibrio.
 Hisopos estériles.
 Asa de nicromo.
 Mechero fischer.
 Lámpara de luz.
 Tiras de oxidasa.
REACTIVOS
 Alfa naftol
 Reactivo de Kovac
 Hidróxido de potasio al 40%
 Indicador rojo de metilo
 Cloruro férrico al 5%
PROCEDIMIENTO
Materia fecal de un niño con diarrea de preferencia menor de 3 años o de un

adulto.
1. Sembrar de acuerdo con las figuras 8-1 y 8-2 en medios parcialmente
inhibitorios para enterobacterias (MacConkey o EMB), descargar el
hisopo (de preferencia que tenga moco, pus y sangre) en un área
pequeña de la placa.
2. El aislamiento de colonias se hace por estría cruzada esterilizando el
asa en cada sección de aislamiento de la placa y separando la estría.
3. Inocule los medios de enriquecimiento, uno para enterobacterias y otro
para vibrio con un inóculo pesado o bien, deje el hisopo dentro del medio
durante la incubación y resiembre con asa después de incubar a 37
grados centígrados durante 12 a 18 horas.
4. A partir de los medios de enriquecimiento se siembran dos placas con
medio inhibitorios: sulfito de bismuto, XLD, S-S, Hektoen o verde
brillante. El primero se puede incubar por 48 horas.
INTERPRETACION DE RESULTADOS
1. Después de incubadas, observar cuidadosamente las placas. Debe

contarse de preferencia con una lámpara de luz que ilumine las cajas por
detrás y observarlas. Marcar por detrás con un círculo con plumón indeleble
(Sharpie) de punto fino cada tipo diferente de colonias sospechosas así:
primero Mac Conkey escoger colonias lactosa negativas (incoloras). Si el
paciente es un niño menor de un año, se marcarán colonias típicas de
Escherichia coli (roja o rosa, brillante y de bordes lisos pero no mucosa).
2. Examinar el S-S de la misma forma, en este medio el crecimiento será más
escaso ya que es más inhibidor. Marcar por detrás una colonia lactosa-
negativo (incoloras), o incluyendo una colonia con centro negro (sulfuro de
hidrógeno) si la hay. Si inocula Hektoen, marcar una colonia pequeña verde
azulado (lactosa-negativo).
3. Con las colonias previamente marcadas realizar biomasa de cada una de
ellas en Agar Base Sangre, usando una asa flameada y fría. Incubar 18
horas a 35ºC. Con cuidado tome biomasa e inocule un tubo de 13X100 mm
de TSI flameando la boca del tubo, luego pinche el medio en el centro y
hasta el fondo a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo,
retire el asa sin salir del tubo de TSI y estríe rápido y parejo en la superficie
inclinada. Flamear y con el asa inocule los siguientes medios flameando el
asa para cada uno de ellos: LIA, MIO, RM-VP, Arginina, Urea, Malonato,
Citrato, Caldo Indol y Fenilalanina.
4. Incube a 35ºC la gradilla que contiene las bioquímicas. Deben permanecer
en incubación de 18-24 horas. Los tapones de rosca deben quedar
ligeramente flojos para permitir la entrada de oxígeno.
5. Si no hace biomasa, las pruebas metabólicas de identificación se deben
sembrar a partir de una sola colonia aislada, con el alambre de punta,
seleccionada de acuerdo con la figura 8-2, con esto se evitan confusiones y
se leen los resultados válidos de acuerdo al cuadro 8-2.
6. Después de incubar 24 horas a 37 grados centígrados, leer los resultados y
comparar cuidadosamente con los cuadros 8-3, 8-4 y la figura 8-3. Anote los
resultados.
7. Si identificó bioquímicamente Vibrio, Salmonella y/o Shigella proceda a
realizar las pruebas serológicas con los antisueros específicos.
8. Complete haciendo la respectiva sensibilidad (Antibiograma).
CUESTIONARIO:
1. Mencione los mecanismos de los microorganismos para producir
enfermedades transmitidas por alimentos y agua.
2. ¿Qué medidas deben practicarse en una comunidad para controlar o
prevenir infecciones intestinales?
3. Explique que se entiende por portador de las enfermedades infecciosas
del tubo digestivo.
4. Describa la composición y aplicación de los medios de cultivo selectivos
y diferenciales utilizados en la práctica.
5. Analice un esquema reciente de clasificación de Salmonella.
6. Diferencie los caldos de enriquecimiento selectivos y no selectivos
utilizados para Salmonella. ¿Cuándo se utilizan cada uno de ellos?
7. ¿Con que finalidad se le adiciona yodo al caldo tetrationato?
8. ¿Desde el punto de vista de bioseguridad, como eliminarías las

muestras fecales después de analizarlas de tal manera que no sean un
riesgo para la salud pública?
9. ¿Cómo se agrupan convenientemente los aislamientos clínicos de
Escherichia coli?
10. Explique como realizaría la toma de muestra por hisopado rectal para el
diagnóstico bacteriológico de cólera.
DISCUSIONES
1. Definir coprocultivo. Casos especiales (niños menores de 5 años e
inmunodeprimidos) como tomar las muestras.
2. Muestras clínicas: ¿Cómo se toman? ¿Cuándo se indican? Cuidados en
el manejo. Procesamiento.
3. Medios de cultivo: consistencia, composición, aplicación e importancia.
4. Reporte preliminar. Importancia, indicación, como se hace, como se
reporta.
5. Análisis del resultado del cultivo.
6. Siembra de medios diferenciales. Lectura, incubación e interpretación.
7. Antibiograma. Importancia. Antibióticos recomendados por la
Organización Mundial de la Salud y NCCLS.
8. Uso de tablas para identificación bacteriana. Reporte.
REFERENCIAS:
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serodiagnóstico de la fiebre tifoidea. p235-242. En: Giono S, A Escobar y
JL Valdespino. Diagnóstico de Laboratorio de Infecciones
Gastrointestinales. INDRE-SSA, México.
2. Appelbaun PC, RR Arthur, ME Parker, GL Shugar and P. Charache.
1982. Comparison of three methods for identification of
Enterobacteriaceae. Eur. J. Clin. Microbiol. (2):76-78.
3. Brigmon RL, SG Zam, G Bitton and SR Farrah. 1992. Detection of
salmonella enteritidis in environmental samples by monoclonal antibody-
based ELISA. J. Inmunol. Methods 152:135-142.
4. Broor SL, AK Singal. 1989. Traveler´s diarrhea:I Definition etiology and
epidemiology. Trop. Gastroenterol. (India). 10 (4):194-200.
5. Diarrhoeal Disease Control. CDD-WHO 1991. Evaluación de los
programas nacionales de control de enfermedades diarreicas. Bol.
Quincenal Cólera/diarreas infecciosas. 1 (13):6-10.
6. Ediciones Científicas. 1987. Síndromes Diarreicos. La Prensa Médica
Mexicana, S.A. México p1-108.
7. Swing WH. 1986. Edwards and Ewing´s Identification of
Enterobacteriaceae. 4th. Ed. Elsevier, Sc. Pub. Co.,N.Y.
8. Farmer JJ and MT Kelly. 1991. Enterobacteriaceae, p360-383. In:Ballows
A, WJ Hausler, KL Herrmann, HD Isenberg and HJ Shadomy (Eds).
Manual of Clinical Microbiology. 5th. Ed. ASM Press, Washington, DC.
USA.
9. Farmer JJ. 1985. Biochemical identification of new species and
biogroups of enterobacteriaceae isolated fron clinical specimens. J. Clin.
Microbiol. 21:46-76.
10. Fitts R, M Diamond, C Hamilton and M Neri. 1983. DNA-DNA
hibridization assay for detection of salmonella spp. in foods.Appl.
Environ. Microbiol. 46: 1146-1151.
11. Hérnández M. J., Cano R.E., Giono C.S. Bacteriología médica
diagnóstica. 2ª. Edición. Ediciones Cuellar. Pág. 18-20. (2003).
12. Koneman, Allen, Dowell y Sommers. Diagnóstico Microbiológico.
Editorial Médica Panamericana. Pág. 15-32. (1991).
Vo.Bo.
Práctica No.9
INFECCIONES DEL APARATO GENITAL
EXUDADOS VAGINALES, URETRALES Y PROSTATICOS
OBJETIVOS:
1. Realizar el examen directo de la secreción uretral utilizando la
coloración de Gram.
2. Elaborar el reporte preliminar.
3. Cultivar las muestras en los medios de cultivo adecuados y seguir la
marcha bacteriológica correspondiente para la identificación del
microorganismo causante de la infección.
4. Realizar la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
5. Elaborar el reporte final.
COMPETENCIA:
El estudiante tendrá la habilidad y los conocimientos para realizar el estudio
microscópico y bacteriológico de las secreciones uretrales que infectan los
órganos genitales femeninos y masculinos, mediante la utilización de medios
enriquecidos, selectivos, diferenciales, así como el uso de pruebas bioquímicas
para su identificación.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas las muestras de exudados uretrales
para cultivo que cursen por un estado de infección de transmisión sexual,
causando cervicitis, uretritis y prostatitis, entre otros.
DEFINICIONES:
Secreción uretral: Presencia de exudado semilíquida, cremosa, producto de la
inflamación proveniente de la uretra genital masculino y femenina.
Cervicitis purulenta: Inflamación del cuello uterino con presencia de exudado
purulento.
Uretritis: Inflamación de la uretra.
Prostatitis: Inflamación de la próstata.
Enfermedad pélvica inflamatoria: Cualquiera de las infecciones que afectan a la
pelvis ascendente incluyendo la parte superior del aparato genital femenino por
encima del cuello uterino.
Leucorrea: Flujo blanquecino y viscoso procedente de la vagina y de la cavidad
uterina.
INTRODUCCION:
El aparato genital masculino y el femenino contienen epitelio transicional,
columnar y escamoso; tales características lo hacen adecuado para la
colonización de bacterias, levaduras y protozoarios; algunos de estos pasan a
formar parte de lo que se considera biota normal. En la uretra se encuentras
estafilococos coagulasa negativos, las corinebacterias y bacterias anaerobias.
La vulva y el pene, especialmente el área que cubre el prepucio pueden tener
Mycobacterium smegmatis además de otras bacterias Grampositivas. La biota
de los genitales femeninos varía con el pH y la concentración de estrógenos
que a su vez dependen de la edad. En mujeres prepúberes y posmenopaúsicas
predominan los microorganismos que tienen su asiento en la piel como los

estafilococos y las corinebacterias, mientras que, las mujeres de edad
reproductiva pueden albergar grandes cantidades de Enterobacterias,
estreptococos y estafilococos; así como bacterias anaerobias esporuladas,
lactobacilos y cocos. Muchas mujeres son portadoras de estreptococos beta
hemolítico del grupo B, el cual en determinadas circunstancias infecta al
neonato durante el paso por el canal del parto, dando origen a una enfermedad
sistémica. (2)
Las levaduras pueden recuperarse en forma transitoria del canal vaginal, sin
embargo, no se le considera como parte de la biota normal. Los lactobacilos
son los organismos predominantes en la vagina de personas sanas.
La infección de los genitales en las mujeres de edad no fértil, son con
frecuencia resultado de la irritación de un cuerpo extraño y posterior
colonización de organismos patógenos.
En niños, la infección de genitales por agentes que se transmiten por contacto

sexual, en su mayoría son resultado de un abuso sexual. Los laboratorios que
trabajan este tipo de muestras deberán tener mucho cuidado para identificar y
documentar todos los hallazgos ya que tienen implicaciones médico-legales.
En seguida se enlistan microorganismos patógenos que con mayor frecuencia

se aíslan de infecciones genitales:
BACTERIAS: Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, Haemophilus
ducreyi, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium.
Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Ureaplasma
urealyticum y Treponema pallidum.
HONGOS: Candida spp y otras levaduras.
VIRUS: Citomegalovirus, Virus del herpes Simple y del papiloma.
PROTOZOARIOS: Trichomonas vaginalis.
Cuadro 9-1 Principales microorganismos causantes de infecciones genitales.
Algunos de estos organismos pueden estar presentes en el hospedero sin que

se presenten síntomas. (6)
Las infecciones frecuentemente se inician en la uretra anterior del varón y en la

uretra, las glándulas vulvovaginales y el cuello uterino en la mujer.
Chlamydia trachomatis es el organismo que con mayor frecuencia se aísla

como responsable de cervicitis purulenta dentro de las enfermedades de
transmisión sexual en los Estados Unidos de Norteamérica. Está asociada con
la enfermedad pélvica inflamatoria, consecuente con infertilidad y nacimiento
prematuro (4,6).
Mycoplasma hominis en casos de inflamación pélvica y pielonefritis, es

causante de morbilidad y mortalidad elevada en el infante. U. urealyticum,
agente responsable de uretritis aguda e infertilidad en la mujer, se menciona
que en ocasiones puede ser la causa de bajo peso del recién nacido (2,5).
G. vaginalis y bacterias anaerobias se han aislado de la vagina de mujeres, que

presenta el síndrome de vaginosis bacteriana. Esta es una enfermedad que se

caracteriza por flujo abundante de mal olor y es causa de parto prematuro,
además del bajo peso del recién nacido. La patogénesis y etiología de esta
entidad no está clara. La concentración de estos organismos se incrementa
drásticamente alcanzando hasta 10 7 a 108 UFC por mililitro de exudado. Dentro
de los anaerobios involucrados se encuentran: Bacteroides spp, Peptococos,
Peptoestreptococos, Mobiluncus curtisii y Mobiluncus mulieris (8).
Los enteropatógenos como: Shigella, Salmonella y campylobacter pueden ser
agentes de enfermedades de transmisión sexual (2). La relación orogenital
permite en algunas ocasiones que N. meningitidis colonice e infecte el canal
genital.
MATERIALES:
 Agar sangre
 Agar Casman
 Agar Chocolate
 Agar de Thayer-Martin
 Agar EMB
 Agar de manitol salado
 Agar Biggy
 Asas de nicromo
 Mechero Fischer
 Portaobjetos
 Hisopos estériles
 Medio de transporte de Amies con carbón
 Frasco con vela.
LA TOMA DE LA MUESTRA:
HOMBRES:
1. Tener listo: hisopos estériles, portaobjetos limpios, agar sangre, agar
chocolate, agar Casman, agar EMB, agar manitol salado y agar Thayer-
Martin.
2. Con el hisopo estéril tomar una gota de la secreción. La muestra se
toma de preferencia antes de la primera orina de la mañana.
3. Preparar cuidadosamente un frotis delgado sobre el portaobjetos,
haciendo rodar el palillo sobre la lámina, no frotar.
4. Colorear el frotis con la tinción de Gram.
5. Sembrar en los medios, con asas flameadas y frías, diseminar por
estrías el inóculo sobre la superficie de las placas.
6. Incubar el agar sangre, Casman y el de Thayer-Martin durante 24-48
horas a 35ºC en el frasco con vela. El Biggy Agar incubar a temperatura
ambiente por 24-72 horas.
7. Observar la morfología colonial y microscópica, identificar la flora
asociada.
8. Determinar la sensibilidad a los antibióticos cuando sea necesario.
EXUDADOS PROSTATICOS
La muestra se obtiene previo masaje prostático-vesicular; para lo cual se
coloca al paciente en posición genupectoral y con la mano enguantada y con el
dedo índice envaselinado se introduce en el recto, se hace masaje en la
próstata, se procura hacer presión, se interrumpe el masaje cuando escurre el
líquido prostático. El líquido que salga de la uretra se recoge en un frasco
estéril de boca ancha (1).
MUJERES:
1. En Las mujeres la muestra la debe obtener el ginecólogo, y debe
hacerse directamente de la lesión, cuando ésta es evidente, como
sucede en los casos de cervicitis, blenorragia crónica, úlcera,
abscesos, etc. Tener listo el mismo material que en el caso de los
hombres.
2. Debe hacerse un aseo de genitales externos y evitar la aplicación de
algún tipo de tratamiento local o sistémico; así como el lavado
vaginal y abstenerse de efectuar el coito por lo menos 3 días antes
de la toma de muestra.
3. Se coloca a la enferma en posición ginecológica, se introduce en la
vagina u espejo de cuzco estéril, lubricado con agua estéril calentada
a 37°C, evitando el uso de lubricantes tipo vaselina o algún
antiséptico; una vez localizado el cuello uterino, se fija el espejo
abriendo las valvas y se toma la muestra con un hisopo estéril del
cérvix y/o fondo del saco posterior.
4. Se toman con hisopos diferentes tres muestras, con una se hace
frotis para teñir con Gram, la otra proporción se pasa a un tubo con
solución salina estéril para efectuar el examen en fresco, en donde
se buscarán leucocitos, eritrocitos, tricomonas, levaduras y células
clave; la tercera muestra se utilizará para sembrar los medios de
transporte de Amies con carbón o sembrarse directamente.
PROCEDIMIENTO:
1. Medir el pH de la muestra aunque se recomienda hacerla in situ.
2. Poner una gota entre un portaobjetos y un cubreobjetos y observar la
preparación en fresco.
3. Colorear los frotis con la tinción de Gram.
4. Sembrar en los medios, con asas flameadas y frías, diseminar por
estrías el inóculo sobre la superficie de las placas.
5. Incubar el agar Sangre, Casman y el de Thayer-Martin durante 24-48
horas a 35ºC en el frasco con vela. El Biggy Agar incubar a temperatura
ambiente por 24-72 horas.
6. Observar la morfología colonial y microscópica, identificar la flora
asociada.
7. Determinar la sensibilidad a los antibióticos cuando sea necesario.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:
GRAM: Buscar diplococos adosados en forma de granos de café y

Gramnegativos (rojos). Anotar si se encuentran intracelularmente, dentro de
los leucocitos polimorfonucleares o fuera de ellos (extracelular).

CULTIVO: Después de 24-48 horas de incubación a 35ºC en el frasco con
vela, examinar el Thayer-Martin, ya que éste contiene sustancias
enriquecidas que favorecen el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae.
Efectuar las pruebas de oxidasa para verificar género.
La prueba de oxidasa puede efectuarse sobre tiras con papel filtro
impregnado con el reactivo o aplicando directamente el reactivo líquido
sobre el cultivo.
Luego identificar la especie de Neisseria gonorrhoeae por medio de la
prueba de oxidación de tres azúcares (CTA): Maltosa, glucosa y sacarosa.
CUESTIONARIO:
1. Explique porqué va en aumento la frecuencia de las enfermedades
transmitidas sexualmente y hable de las medidas para controlarlas.
2. ¿Cómo se diagnostica la sífilis?
3. Describa el agente etiológico de la gonorrea. ¿Cómo se diferencia
esta especie de otras neisserias?
4. Investigue cuál es el agente etiológico causante de ETS con mayor
prevalencia en la República Méxicana.
5. Para la toma de muestra de un paciente con uretritis, es necesario: a)
un escobillón de punta gruesa b) un escobillón flexible de punta fina
c) introducir el escobillón unos 2 cm d) retener la primera micción
matinal e) desechar la primera gota de pus que aparece.
6. En pacientes con cervicitis, la toma de muestra se hace: a) con
ayuda de espéculo b) con un escobillón grueso c) con un escobillón
fino flexible d) sin tocar las paredes vaginales e) por triplicado.
7. Tres microorganismos productores de uretritis inespecífica podrían
ser: a) Clamydia trachomatis b) Candida albicans c) Neisseria
gonorrhoeae d) Ureaplasma urealyticum e) Tricomonas vaginalis.
8. Si una muestra de flujo vaginal tiene apariencia de leche cuajada,
podemos sospechar: a) infección por levaduras b) infección por
Gardnerella c) Infección por Tricomonas d) Enfermedad pélvica
inflamatoria e) la presencia de células clave.
9. Para la investigación de gonococia en la mujer, la muestra más
adecuada es: a) exudado vaginal b) exudado uretral c) exudado
endocervical d) las tres anteriores e) ninguna de las anteriores.
10. El granuloma inguinal es una ETS cuyo agente etiológico es: a)
Calymmatobacterium granulomatis b) Chlamydia trachomatis c)
Haemophilus ducreyi d) Micoplasma hominis e) Ureaplasma
urealyticum.
11. El diagnóstico de uretritis por Chlamydia se realiza de forma rutinaria
mediante: a) cultivo en líneas celulares b) cultivo en medios
específicos c) inmunofluorescencia directa d) inmunofluorescencia
indirecta e) tinción con naranja de acridina.
12. En un flujo vaginal con aspecto espumoso, verdoso y olor fétido
podemos sospechar: a) Tricomonas b) Candida c) Gardnerella d)
Gonococo e) Proteus.
13. El exudado vaginal con un pH superior a 4,5, blanquecino y
adherente, que al añadir KOH huele a pescado sugiere: a)
candidiasis b) Infección por Gardnerella c) Trichomoniasis d)
Infección por Gonococo e) Ausencia de vaginitis.
DISCUSION:
1. Toma de muestra.
2. Diagnóstico preliminar.
3. Medio de cultivo. Composición. Incubación.
4. Interpretación del cultivo.
5. Pruebas bioquímicas utilizadas.
6. Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
7. Reporte final.
REFERENCIAS:
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Diagnóstico y Tratamiento. El manual Moderno, S.A. de C.V. México,
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2. Barón EJ and SM Finegold. 1990. Bailey & Scott’s Diagnostic
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4. De León Rodríguez y JT Hernández Méndez. 2000. Chlamydia
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5. Garza Velazco R, E Peniche Quintana y S Manero Brito. 1992. La
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Moldawska y S García. 2000. Microorganismos Asociados con
Chlamydia trachomatis Aislados de Pacientes con Leucorrea. An. Esc.
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7. Nuget RP, MA Krohn and SL Hiller. 1991. Reliability of Diagnosis
bacterial Vaginosis is Improved by a Standarized Method of Gram Stain
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8. Piot P. 1988. Bacterial Vaginosis, p94-99. In: A Balows, WJ Hausler Jr, M
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Principles and Practice. Vol.I, Springer Verlag. N.Y.
Vo.Bo.
Práctica No. 10
LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO Y OTROS LIQUIDOS DE DERRAME
OBJETIVOS:
1. Realizar el examen directo del Líquido cefalorraquídeo, interpretar y
hacer su reporte.
2. Identificar los medios de cultivo de utilidad para muestras de LCR y
otros líquidos de derrame, inocularlos e incubarlos en condiciones
adecuadas.
3. Identificar las bacterias aisladas y reportar sus resultados.
4. Aislar e identificar las bacterias causantes de meningitis.
5. Conocer el procesamiento de otros líquidos de derrame.
COMPETENCIA:
El estudiante tendrá los conocimientos y las habilidades para realizar el
diagnóstico bacteriológico de las meningitis purulentas utilizando el LCR, la
tinción de Gram, la microscopía, el cultivo y las pruebas bioquímicas, así como
de otros líquidos de derrame.
ALCANCE:
Este procedimiento será aplicado a todas los líquidos de derrame incluyendo
el LCR para su examen directo y diagnóstico de meningitis bacteriana.
DEFINICIONES:
LCR: líquido contenido dentro de los cuatro ventrículos del cerebro, el espacio
subaracnoideo y el conducto del epéndimo de la médula espinal, es formado
por el plexo coroideo y el parénquima cerebral, circula por los ventrículos del
espacio subaracnoideo y es absorbido hacia el sistema venoso.
Meningitis: Inflamación de las meninges.
Meningoencefalitis: Inflamación de las meninges y el cerebro.
INTRODUCCION:
La meningitis purulenta es una respuesta inflamatoria aguda de las membranas
que envuelven el encéfalo y la médula espinal, causada por bacterias, de las
que predominan, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y
Klebsiella pneumoniae, todas ellas capsuladas. La mortalidad es elevada, así
como las secuelas neurológicas que presentan las personas que se recuperan,
lo que determina la urgencia del diagnóstico. Generalmente, se originan por
infecciones previas en el aparato respiratorio o en algún otro foco, de donde
por la circulación sanguínea alcanzan los senos venosos de la duramadre y a
través de la aracnoides llegan al conducto medular (7).
La meningitis tuberculosa, generalmente se presenta como una complicación

de una infección primaria con o sin difusión miliar; de una tuberculosis crónica o
en una etapa Terminal, y aún puede aparecer como una forma aislada en
donde no se descubren lesiones miliares en la necropsia. Algunos hongos,
virus y paráitos pueden producir un cuadro meníngeo (10,11).
Las características clínicas son semejantes a todas las formas de meningitis

purulentas, en ellas se presentan: cefalalgia, rigidez cervical, letargo o
somnolencia, confusión, delirio, estupor y los signos de Kerning y de Budzinski.

Estadísticamente se ha encontrado que en los lactantes predominan
Streptococcus agalactiae, las enterobacterias, Pseudomonas aeruginosa,
Listeria monocytogenes, Streptococcus grupo A, B, D, Staphylococcus
epidermidis y Candida albicans (4, 7, 9, 10,13).
En los niños de 1 a 5 años: Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae

(4, 9) y Bacteroides fragilis también puede producir meningoencefalitis
(4,12,14).
En México los agentes etiológicos más frecuentes en la meningoencefalitis

purulentas son las mencionadas antes, sin embargo, N. meningitidis se
encuentra poco, lo que contrasta con hallazgos de otros países (1,8).
La meningoencefalitis histérica es una infección perinatal que existe en México

y frecuentemente pasa inadvertida porque L. monocytogenes se confunde con
un bacilo difteroide contaminante de la muestra; por lo tanto, el microbiólogo, el
médico y el químico de laboratorio deben tener conciencia de su presencia,
para no correr el riesgo de descartar el verdadero agente etiológico del
padecimiento (3). En gelosa sangre desarrollan colonias puntiformes de 0,3 a
1.5 mm, circulares, lisas, y translúcidas de color azul grisáceo con una zona
discreta de beta hemólisis. Son positivas a la prueba de catalasa, Vogues-
Proskauer, rojo de metilo y la fermentación de la glucosa; es oxidasa y manitol
negativo, reduce la leche tornasolada. La prueba de virulencia en el ojo del
conejo o reacción de Antón es positiva (9), así como la prueba de CAMP (2,
6,11,12). Es susceptible al trimetropim-sulfametoxazol, rifampicina y
ciprofloxacina.
El LCR en las meningitis purulentas presenta una ligera pleocitosis al inicio de

la enfermedad, siendo marcada durante la evolución con predominio de PMN,
lo que determina el aspecto turbio, aunque este aspecto puede aparecer en los
abscesos meningocefálicos. En la meningitis purulenta la glucosa está
disminuida sensiblemente, es relativamente baja en la forma tuberculosa y en
las micóticas y casi normal en las virales (2, 3, 5).
En las meningitis purulentas, el diagnóstico microbiológico se realiza,

demostrando el agente etiológico en la muestra de LCR, la que debe ser
tomada por el médico.
MATERIALES
 Agar Sangre
 Agar Chocolate
 Agar de Thayer-Martin
 Agar de Manitol salado
 Agar Sabouraud
 Coloración de Ziehl-Neelsen
 Tinta China
 Asas de nicromo
 Mechero Fischer
 Portaobjetos
 Hisopos estériles
 Frasco con vela.
MUESTRAS:
Las muestras incluidas en los fluidos corporales son:
 Líquido cefalorraquídeo
 Líquido ventricular
 Fluido abdominal (líquido peritoneal o ascítico)
 Líquido pleural
 Líquido pericárdico
 Líquido sinovial
 Médula ósea
Las muestras deben transportarse rápidamente al laboratorio y ser procesadas

inmediatamente no después de 30 minutos de recolectados. Rotular con el
nombre del paciente, número de registro, fecha y naturaleza de la muestra. Si
el médico sospecha que la muestra pueda contener bacilos alcohol ácido
resistentes debe hacerlo saber en su solicitud de laboratorio.
PROCEDIMIENTO:
1. El médico debe obtener la muestra (LCR o cualquier otro fluido corporal
del cual desee examen completo) y se recoge en dos tubos de
preferencia con tapón de hule.
2. Uno de ellos contendrá citrato de sodio 0,01 g por cada 5 ml de muestra
(el cual no se centrifuga) y de éste se hará el estudio citoquímico y
células (recuento total de células), recuento diferencial (fórmula blanca)
y análisis químico. El otro tubo sirve para análisis microbiológico.
3. Centrifugar la muestra 15 minutos a alta velocidad (2500-3000 rpm);
decantar asépticamente, tapar, agitar y procesar solo el sedimento.
4. Sembrar una asada del sedimento en cada uno de los medios:
 Agar sangre de carnero al 5%.
 Agar Mac Conkey
 Agar Sabouraud (hongos)
 Lowestein-Jensen (solo si se investiga BAAR)
 Agar levinthal
 Agar Chocolate
 Agar Manitol salado
5. Diseminar por estrías en toda la superficie de los medios sólidos.
Introducir el agar sangre de carnero, Levinthal y el agar chocolate en el
frasco con vela para atmósfera parcial de CO 2. Incubar todos los medios
a 35ºC, excepto el sabouraud que se incuba a temperatura ambiente,
para el aislamiento de hongos patógenos especialmente (Cryptococcus
neoformans).
6. Del sedimento hacer una preparación en fresco con tinta china y
observarla al microscopio con objetivo de seco fuerte, con el fín de
buscar microorganismos capsulados.
7. En portaobjetos nuevos o bien limpios con alcohol, hacer dos frotis
pequeños (de aproximadamente un centímetro de diámetro) en el centro

de la lámina.
8. Colorear un frotis con Gram y otro con Ziehl-Neelsen.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS:

Observa los frotis del sedimento de LCR con el objetivo de inmersión. En vista
que del resultado de los frotis depende el tratamiento inmediato de pacientes
con infección grave de las meninges, su observación debe hacerse con todo
cuidado. Observar las siguientes morfologías:
1. Diplococos Gramnegativos (rojos o rosados), arriñonados, dispuestos en
parejas como granos de café, idénticos a Neisseria gonorrhoeae de pus
uretral: morfología compatible con Neisseria meningitidis. Notificar
inmediatamente al médico.
2. Cocobacilos Gramnegativos (rojo pálido) pleomórficos, con escasas
formas bacilares: morfología compatible de Haemophilus influenzae,
agente de meningitis en niños de 6 meses a 4 años.
3. Cocos Grampositivos (morados), lanceolados, ovalados, dispuestos en
parejas o cadenas cortas, la cápsula se insinúa como halo claro
alrededor de las bacterias en LCR: morfología compatible con
Streptococcus pneumoniae.
4. Bacilos Gramnegativos (rojos) de coloración sólida, no pleomóficos,
bacilos alargados: morfología compatible con Enterobacterias o
Pseudomonas (E. coli, Salmonella spp, Pseudomonas aeruginosa).
5. Levaduras redondeadas, algunas con gemaciones laterales,
Grampositivo se insinúa cápsula, hacer “tinta china” para demostrar la
presencia de levadura capsulada sugestiva de Cryptococcus
neoformans.
6. En Ziehl-Neelsen: bacilos alcohol-ácido resistentes (rojos) cortos,
algunos con coloración dispareja en forma de gránulos: morfología
compatible con Mycobacterium tuberculosis.
INFORME:
 El primer informe, entregar el mismo día de la obtención de la muestra:
Frotis de Gram: se observan morfología de bacterias, cantidad de
leucocitos, cultivo pendiente.
 El segundo informe, entregar el día que termina la identificación: Cultivo:
se aísla: Nombre de la bacteria, género, especie, más antibiograma.
LCR Y LIQUIDOS DE DERRAME
 Agar Sangre y Mac Conkey

 Agar Chocolate
 Agar Lowestein-Jensen
 Agar Manitol salado
 Agar Sabouraud
 Agar Levinthal
Incubar 18-24 horas
Crecimiento No crecimiento
Reincubar 24 horas
Gram Crecimiento No crecimiento

Identificar bacteria Reporte
Sensibilidad
Reporte
GRAM
Cultivo negativo
Subcultivo del caldo
a las 48 horas
Bacteria aislada Identificar bacteria

Sensibilidad Antibiograma
Reporte
Se aisló: Dar nombre de

bacteria y sensibilidad
Figura No. 10-1 Aislamiento de bacterias procedentes de LCR.
CUESTIONARIO:
1. En un paciente de sospecha de meningitis bacteriana, el tratamiento

empírico podría consistir: a) Penicilina b) Ampicilina c) Eritromicina d)
Cefotaxima e) Ceftriaxona.
2. El LCR se extrae por punción lumbar entre las vértebras: a) primera y
segunda b) segunda y tercera c) tercera y cuarta d) cuarta y quinta e)
cualquiera de ellas.
3. En un LCR con glucosa y proteínas ligeramente elevadas y 250
linfocitos/mm3 sospechamos: a) meningitis meningocócica b) meningitis
vírica c) meningitis fúngica d) meningitis tuberculosa e) Meningitis
sifilítica.
4. La meningitis bacteriana en el neonato: a) puede cursar con signos
meníngeos solapados b) cursa con rigidez de nuca como primer síntoma
c) suele cursar con glucorraquia normal d) siempre es producida por N.
meningitidis e) presenta la tríada clásica: fiebre, vómitos y rigidez de
nuca.
5. Puede resultar negativo el cultivo de LCR en una meningitis
meningocócica: a) cuando se demora la siembra después de la punción
b) cuando el paciente está tratado c) cuando se refrigera el líquido varias
horas d) todas las respuestas anteriores son verdaderas e) todas las
respuestas anteriores son falsas.
6. En la meningitis de prematuros y recién nacidos el agente etiológico más
frecuente es: a) bacilos Gramnegativos b) Streptococcus agalactiae c)
Neisseria meningitidis d) Haemophilus influenzae e) Streptococcus
pneumoniae.
7. Cuando en un LCR se solicita examen en fresco con tinta china se
sospecha meningitis por: a) Micobacterias atípicas b) Klebsiella c)
Candida d) Cryptococcus e) Amebas.
8. Ante un LCR claro, opalescente, con glucosa baja, proteínas altas y
100% de linfocitos: a) se sospecha meningitis tuberculosa b) hay que
realizar tinción de Ziehl-Neelsen c) Es preciso realizar cultivo en medio
de Lowestein-Jensen d) No es rentable realizar tinción de Gram e) todas
las respuestas anteriores son ciertas.
9. En un líquido de diálisis peritoneal sospechoso de infección se
encuentra habitualmente: a) Staphylococcus aureus b) Pseudomonas
aeruginosa c) Escherichia coli d) Staphylococcus epidermidis e) Candida
albicans.
10. En la meningitis bacteriana la concentración de glucosa en LCR se
encuentra generalmente: a) aumentada b) disminuída c) no se afecta d)
igual que en sangre e) 40% más baja que en sangre.
Bibiliografía Consultada:
DISCUSION:
1. Muestra. Cantidad y procesamiento.
2. Frotis coloreado. Cuidados al hacerlo, importancia y significado clínico.
3. Diagnóstico preliminar.
4. Medios de Cultivo.
5. Aislamiento e identificación bacteriana.
6. prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos.
7. Reporte definitivo.
REFERENCIA:
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Ozores G. (2003). Bacteriología Médica Diagnóstica. Ediciones Cuellar.
2ª. Edición.IPN.
 Holt, J.G., N.R. Krieg, P.H.A. Sneath, J.T. Staley and J.T. Williams.
(1994). Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology. 9 th. Edition. The
Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
 Jawetz E., Melnick Joseph (1990). Manual de Microbiología Médica.
Editorial El Manual Moderno.
 Joklik Wolfang, Willet Hilda, Amos Bernard. (1996). Microbiología de
Zinsser. 20ª. Edición. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires,
Argentina.
 Jhonson T.R. and C.L. Case. (1992). Laboratory Experiments in
Microbiology. 3a. Edición. Cummings Publishing Company, Inc. USA.
 Koneman Elmer, Allen Stephen, Dowell V. R., Sommers Herbert. (1996).
Atlas de Diagnóstico Microbiológico. Editorial Interamericana. México.
 Krupp, Jawetz, Tierney (1992). Diagnóstico Clínico y de Laboratorio.
Editorial El Manual Moderno.
 Lynch M.J., S.S. Raphael, L. D. Mellor. 1997. Métodos de Laboratorio.
Vol. I y II. Editorial Interamericana. México.
 Mac Faddin J. F. (2000). Pruebas Bioquímicas para la Identificación de
Bacterias de Importancia Clínica. 3ª. Edición. Editorial Médica
Panamericana. México, D.F.
 Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. (1998). Biología de los
Microorganismos. 8ª. Edición. Prentice Hall. España.
 Practical Handbook of Microbiology. (1989). William M O’Leary. Cornell
Medical College, New York, USA. CRC Press.
 Pelczar M. J.; Reid Roger; Chan ECS. (1997). Microbiología. McGraw
Hill. 4ª. Edición en español. México, D.F.
 Prescott L. M., Harley J. P., Klein D. A. (2004). Microbiología. 5ª.
Edición. Editorial Mc. Graw Hill-Interamericana. España.
 Schaechter, Medoff, Eisenstein, Guerra (1992). Microbiología:
Mecanismos de las Enfermedades Infecciosas.2ª. Edición. Editorial
Médica Panamericana. Buenos Aires, Argentina.
 Sánchez Vegas J. T, Tay Zavala J. (2003). Fundamentos de
Microbiología y Parasitología Médicas. Méndez Editores. México, D.F.
 Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prácticas de Laboratorio en
Microbiología. Editorial Limusa. México.
ANEXO 1
TINCIONES
COLORACION DE GRAM
1. Hacer frotis.
2. Fijar el frotis con calor y dejar enfriar.
3. Cubrir el frotis con cristal violeta por 2 minutos.
4. Lavar con agua de chorro, eliminar el exceso de agua.
5. Cubrir el frotis con lugol por 1 minuto.
6. Lavar con agua de chorro.
7. Decolar con alcohol-cetona por 20-30 segundos.
9. Cubrir con safranina el frotis por 30 segundos.
11. Dejar secar al aire y observar al microscopio con objetivo de 100X.
INTERPRETACION
 Bacterias Gramnegativas: color rojo o rosado
 Bacterias Grampositivas: color violeta oscuro.
REACTIVOS:
CRISTAL VIOLETA DE GRAM

Solución A:
Cristal violeta 2,0 g
Etanol 96% 20,0 ml
Disuelva el cristal violeta en el etanol.
Solución B:
Oxalato amónico Q.P. 0,8 g
Agua destilada 80,0 ml
Disuelva el oxalato amónico en el agua destilada.
ACETONA-ALCOHOL
Etanol (96%) 700 ml
Acetona 300 ml
YODO DE GRAM
Yodo Q.P. 1,0 g
Yoduro de potasio Q.P. 2,0 g
Mezcle en un mortero, el yodo y el yoduro de potasio y muélalos muy
finamente. Añada luego una pequeña cantidad de agua para lavar el material;
agregue el resto del agua. Agite bien.
SAFRANINA DE GRAM
Safranina 0,25 g
Etanol 96% 10,00 ml
Disuelva la safranina en el etanol, mezclando bien. Agregue el agua destilada y
vuelva a agitar. Filtre la solución con papel filtro.
TINCION DE ALCOHOL ACIDO RESISTENTE

ZIEHL-NEELSEN
Esta es una tinción diferencial que permite distinguir entre algunas bacterias
que por su alto contenido de sustancias lipídicas o céreas se tiñen con
dificultad por los procedimientos usuales; sin embargo, una vez teñidas resisten
el colorante aún cuando se les lave con una mezcla de alcohol-ácido
clorhídrico. Esta tinción es importante para distinguir, entre otras las bacterias
alcohol ácido resistentes causantes de la tuberculosis y la lepra. Existen varias
técnicas para este tipo de tinción, sin embargo, nos referimos a la de Ziehl-
Neelsen.
REACTIVOS:
CARBOLFUCSINA ZIEHL-NEELSEN
Fucsina básica 0,3 g
Etanol 96% 10,0 ml
Cristales de fenol Q.P. 5,0 g
Disuelva la fucsina básica en el etanol. En otro recipiente disuelva los cristales
de fenol en el agua destilada. Mezcle ambas soluciones y agite bien.
ALCOHOL ACIDULADO
Acido Clorhídrico (37%) 30 ml
Etanol (96%) 970 ml
Disuelva el ácido clorhídrico en el etanol.
AZUL DE METILENO DE LOEFFLER

Azul de metileno 0,3 g
Etanol 96% 30,0 ml
Disuelva el azul de metileno en el alcohol. Agregue el agua destilada y mezcle
bien. Filtre con papel filtro.
PROCEDIMIENTO:
1. Prepare un frotis adecuado de muestra a estudiar.
2. Cubra la lámina con carbolfucsina y caliente suavemente hasta que haya
emisión de vapor. No deje que el colorante hierva ni se seque. Agregue
más fucsina si es necesario. Mantenga la emisión de vapor durante 5-10
minutos.
3. Lave la preparación con agua de la llave.
4. Decolore con alcohol-ácido durante 1 minuto.
5. Lavar con agua de grifo.
6. Aplique el colorante de contraste azul de metileno por 1 minuto.
7. lavar con agua de grifo.
8. Dejar secar y observe con objetivo de inmersión 100X.
RESULTADO:
 Bacterias alcohol ácido resistentes: rojas.
 Bacterias no alcohol-ácido resistentes: azules.
ANEXO II
PRUEBAS DE IDENTIFICACION
PRUEBA DEL CORDON
En una lámina colocar una gota de desoxicolato de sodio al 0.5% y suspender

las colonias bacterianas sospechosas. La mezcla se vuelve sumamente
viscosa si es una bacteria del género Vibrio. Esta viscosidad se puede
visualizar mejor si se sumerge dentro de la mezcla un asa. Al retirar el asa de la
preparación se forma un cordón o hilo de mucosidad entre el asa y la mezcla.
PRUEBA DE LA COAGULASA
La coagulasa es una enzima que tiene la capacidad de convertir el fibrinógeno

que está presente en el plasma humano o animal en fibrina, lo cual se
evidencia en el laboratorio por la formación de un coágulo visible.
Esta prueba se usa para diferenciar Staphylococcus aureus que siempre

produce esta enzima, de otras especies de Staphylococcus que no la
producen. La coagulasa está presente en las bacterias en dos formas:
coagulasa libre y coagulasa ligada a la pared de la bacteria. La coagulasa
unida a la pared se evidencia haciendo la prueba en lámina, y la coagulasa
libre se determina haciendo la prueba en tubo. La prueba en lámina es
presuntiva y a todos los cultivos que den la prueba débil o negativa se le debe
hacer la prueba en tubo, porque algunas cepas de Staphylococcus aureus sólo
producen la coagulasa libre.
MEDIOS Y REACTIVOS
 Plasma de conejo o plasma humano de sangre fresca estéril.

 Cloruro de calcio al 5%: pesar 5,0 gramos de cloruro de calcio, deposite
en un matraz aforado de 100 ml y lleve con agua destilada hasta la
marca de aforo.
 Medio de cultivo: cualquier medio sólido, libre de sal (NaCl) debe usarse
para que crezca el microorganismo a probar.
PRUEBA EN LAMINA
1. Ponga una gota de solución salina estéril en un portaobjetos limpio.
2. Tome una asada del cultivo a probar. Debe tener 18 horas y haber
crecido en un medio sin sal. Haga con el asa una emulsión homogénea
en la gota de solución salina.
3. Agregue una gota de plasma a la suspensión de bacterias y mezcle.
4. Observa si hay formación inmediata o no de un precipitado granular de
coágulos.
PRUEBA EN TUBO
1. Agregue asépticamente 0,5 ml de plasma a un tbo estéril de 12X75 mm.
2. Añada 0,5 ml de cultivo crecido en caldo BHI o una asada de cultivo
crecido en un medio sólido.
3. Incube el tubo en un baño maría a 35ºC por 4 horas.
LECTURA E INTERPRETACION
PRUEBA EN LAMINA
PRUEBA POSITIVA: Formación de un precipitado granular dentro de un periodo

de tiempo de 5 segundos a 1 minuto. Después de 1 minuto si aparece
precipitado, monte la prueba en tubo.
PRUEBA NEGATIVA: Suspensión homogénea.
PRUEBA EN TUBO
Observe cada 30 minutos y si a las 4 horas está negativa, deje 24 horas en el

baño maría.
PRUEBA POSITIVA: Cualquier indicio de coágulo. No hay desplazamiento por las

paredes del tubo.
PRUEBA NEGATIVA: Suspensión homogénea, se desliza por las paredes del
tubo.
CONTROL DE CALIDAD:
a. Control de esterilidad del plasma: 24 horas a 35ºC.
b. Control de coagulación: Agregue una gota de solución de cloruro de
calcio al 5% a 0,5 ml de plasma. El plasma debe coagular en un periodo
de 1 minuto.
c. Control positivo: Staphylococcus aureus.
d. Control negativo: Staphylococcus epidermidis.
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES
1. Si se usa plasma citratado, agregue 5 unidades de heparina/ml para

eliminar falsos positivos en la prueba de la coagulasa, ya que
microorganismos que utilizan el citrato causan coagulación del plasma al
consumirlo.
2. Si el cultivo a probar tiene más de 24 horas o es escaso se puede
obtener una prueba de coagulasa débil.
3. Si una colonia no se suspende en solución salina en la prueba en
lámina, el resultado es imposible de interpretar.
4. No se deben emplear inóculos provenientes de medios con alta
concentración de sal, ya que el cultivo autoaglutina en solución salina.
5. Cuando realice la prueba en tubo no agite el tubo para observar la
formación del coágulo. Un falso negativo puede ocurrir debido a un
rompimiento del coágulo inicial que no se formará de nuevo.
6. Es muy importante observar el tubo cada 30 minutos, ya que existen
cepas de Staphylococcus aureus que producen grandes cantidades de
fibrinolisina, por lo que el coágulo se puede lisar antes de 4 horas e
interpretar erróneamente el resultado como negativo.
7. Algunas depas producen poca coagulasa, por lo que la formación del
coágulo se evidencia hasta las 24 horas de incubación.
PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa, es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y

anaerobias facultativas. El peróxido de hidrógeno es uno de los productos

finales del metabolismo oxidativo de los carbohidratos y si se acumula es letal
para el microorganismo. La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en
agua y oxígeno de acuerdo con la siguiente reacción:
H2O2 Catalasa 2H2O + O
Esta prueba es de vital importancia en la diferenciación de Streptococcus

(catalasa negativa) y de los Staphylococcus (catalasa positiva).
REACTIVO
Peróxido de hidrógeno al 3%: se prepara con peróxido de hidrógeno y agua
destilada. Este es un reactivo muy inestable que cuando se expone a la luz se
descompone fácilmente. Debe almacenarse en refrigeración y en botella color
ámbar. Además justo cuando se va a usar debe revisarse que de bien con los
controles de calidad.
PRUEBA EN LAMINA
a) Con una aguja bacteriológica pique el centro de una colonia bien
aislada y transfiera el inóculo a un portaobjetos limpio.
b) Anada 1 o 2 gotas de perxóxido de hidrógeno al 3%.
c) Observe si se forman burbujas o no inmediatamente después que
se añade el reactivo.
d) Descarte la laminilla en un contenedor punzocortante.
METODO EN TUBO
a) Añada unas gotas del peróxido de hidrógeno al 3% directamente sobre
un caldo de crecimiento, de preferencia caldo BHI.
b) Observe si hay o no formación de burbujas sobre la superficie del caldo
y paredes del tubo.
METODO EN PLACA DE PETRI

a) Añada unas gotas de peróxido de hidrógeno al 15% directamente sobre
la superficie donde hay crecimiento.
b) Observe si se forman o no burbujas de inmediato.
CONTROL DE CALIDAD
a) Control positivo: Staphylococcus spp.
b) Control negativo: Streptococcus spp.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa

de platino ya que puede dar un resultado falso positivo. El alambre de
nicromo no interfiere.
2. La prueba debe realizarse a cultivos de 18-24 horas; cultivos más viejos
pueden perder su actividad de catalasa dando una reacción falsa
negativa.
3. El peróxido de hidrógeno es extremadamente cáustico por lo que se
debe evitar que toque la piel ya que puede causar quemaduras
dolorosas. En caso de que ocurran, inunde de inmediato el área
afectada con alcohol al 70% para neutralizar la acción. No debe usar

agua.
PRUEBA DE OXIDASA
La enzima oxidasa, conocida también como citocromo oxidasa o

indofenoloxidasa. Se encuentra presente en una gran variedad de seres
vivientes entre los que incluyen bacterias hasta animales superiores. Su
función es la de promover la oxidación del citocromo c a expensas de oxígeno
molecular.
En bacteriología se puede determinar su presencia al hacer reaccionar una

población bacteriana con su sutrato oxidable como el dimetil o tetrametil-p-
feniléndiamina y el resultado observado es la aparición de color que va del
rosado al púrpura.
Las siguientes reacciones ilustran lo anteriormente expuesto:ç
2 citocromos c reducidos + 2H+ + ½ O 2 citocromo oxidasa 2 citocromos c

oxidados + H2O
2 citocromos c reducidos + reactivo oxidación compuesto coloreado
Esta prueba es sumamente importante en la identificación de bacterias

Gramnegativas y en la diferenciación de cocos Grampositivos de importancia
clínica: Micrococcus (prueba positiva) y Staphylococcus (prueba negativa,
excepto S. sciuri).
REACTIVOS
PARA GRAMNEGATIVOS
1. REACTIVO DE KOVAC
Tetrametil-p-fenilendiamina dihidrocloruro 0,1 g
Agua destilada 10 ml
Agregue agua al tetrametil-p-fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario

caliente lentamente para lograr la disolución completa. Este reactivo debe ser
incoloro o mostrar un tono rosado sumamente leve. Si presenta otro aspecto,
descártelo; es poco estable y se oxida rápidamente, de tal forma que deba
preparse justo antes de usarlo. De los reactivos usados para detectar oxidasa,
éste es el más sensible.
2. REACTIVO DE GORDON Y McLEOD:

Dimetil-p-fenilendiamina monohidrocloruro 0,1 g
Agua destilada 10 ml
Agregue agua al dimetil-p-fenilendiamina y disuélvalo. Si es necesario caliente

lentamente para lograr la disolución completa. Este reactivo debe presentar un
tono lila muy tenue. Si presenta otro aspecto, descártelo. Es más estable que el
reactivo de Kovac pero menos sensible. Debe preparse justo antes de usarlo.
PARA COCOS GRAMPOSITIVOS

REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER
Tetrametil-p-fenilendiamina dihidrocloruro 0,1 g

Dimetilsulfóxido 10 ml
Agregue el dimetilsulfóxido al tetrametil-p-fenildeiamina y disuélvalo. Este

reactivo presenta un tono lila suave, es muy sensible. Almacénelo en botellas
color ámbar. Si el reactivo presenta otro color descártelo.
PROCEDIMIENTO
1. PARA GRAMNEGATIVOS
A. TIRAS DE PAPEL
A partir de un cultivo de 18-24 horas, tome un inóculo denso con asa de platino
o aplicador de madera estéril y deposítelo sobre una tirilla de papel filtro
impregnada con el reactivo para oxidasa.
B. PRUEBA DIRECTA EN PLACA

Inunde las colonias en estudio en la placa con el reactivo para oxidasa.
II. PARA COCOS GRAMPOSITIVOS

A partir de un agar incubado a 35ºC por 18-24 horas en atmósfera aerobia
tome una asada del cultivo y espárzala en una tira de papel filtro. Agregue una
gota del reactivo de Faller y Schleifer.
LECTURA E INTERPRETACION
a) REACTIVO DE KOVAC: Se debe hacer la lectura en un periodo de hasta 10
segundos.
b) REACTIVO DE GORDON Y McLEOD : Se debe leer en un
periodo de hasta 30 minutos.
c) REACTIVO DE FALLER Y SCHLEIFER: Se debe de leer
en un periodo de hasta 2 minutos.
PRUEBA POSITIVA: Aparición de color púrpura en el tiempo establecido.

PRUEBA NEGATIVA: No aparición de color púrpura en el tiempo establecido.
CONTROL DE CALIDAD
Control Positivo para: Gramnegativos: Aeromonas hydrophila

Pseudomonas aeruginosa
Grampositivos: Micrococcus spp.
Control Negativo para: Gramnegativos: Escherichia coli
Grampositivos: Staphylococcus aureus
PRECAUCIONES Y RECOMENDACIONES
1. La cristalería empleada para preparar y almacenar los reactivos para

oxidasa debe ser lavada escrupulosamente para eliminar restos de
materia orgánica, ya que ésta contribuye a oxidar el reactivo.

2. No realice la prueba de oxidasa a colonias bacterianas crecidas en
medios que contengan glucosa, ya que su fermentación inhibe la
actividad de la enzima y ocasiona falsos negativos.
3. La prueba debe realizarse únicamente a colonias provenientes de
medios no selectivos y no diferenciales.
4. Para la prueba no debe utilizarse el asa corriente (de nicromo) dado que
ésta, por las trazas de hierro que deja, puede inducir la oxidación del
reactivo y dar falsos positivos.
5. La reacción debe observarse UNICAMENTE en la colonia y no alrededor
de ésta.
6. El dimetil-p-fenilendiamina es menos sensible y las colonias viscosas
(mucoides) pueden aparecer como oxidasa negativas por la poca
penetración del reactivo.
ANEXOS III
MEDIOS DE CULTIVO
BASE DE AGAR SANGRE
 USO: Para el aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes de difícil

crecimiento.
Ingredientes (g/L)
Agar 15,0 g.
Cloruro de sodio 5,0 g.
Infusión de músculo cardiaco 10,0 g.
Peptona 10,0 g.
 pH final: 7,3  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 40 g. del polvo por cada litro de agua destilada.

2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.
3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado en la libra.
4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por un minuto hasta
disolución completa.
5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a
frascos de cristal perfectamente limpios de acuerdo al volumen que se
necesite.
6. Esterilizar los frascos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15
minutos.
7. Dejar enfriar los frascos y posteriormente vaciarlos a cajas petri o tubos de 13 x
100 mm según sea requerido.
8. Dejar solidificar las placas, o si se trata de tubos inclinarlos para que
solidifiquen y se forme el pico de flauta. A la placa se le rotula las iniciales del
medio de cultivo (ABS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
9. Incubar las cajas y/o tubos por 24 hrs. A 37°C para realizar la prueba de
esterilidad.
10. Sacar las cajas y/o tubos revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo,
guardarlas en bolsas de plástico a la cual se le pegará una etiqueta y la
leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
AGAR SANGRE
 USO: Para el aislamiento, cultivo y actividad hemolítica de gérmenes de difícil

crecimiento.
Ingredientes (g/L)
Agar 15,0 g.
Infusión de músculo cardiaco 10,0 g.
Peptona 10,0 g.
 pH final: 7,3  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:


necesite.
minutos.
7. Dejar enfriar las frascos aproximadamente a 45°C y adicionarle sangre estéril
(3% si es concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total) girando
suavemente el frasco para evitar la formación de burbujas.
8. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la ayuda
de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales del
medio de cultivo (AS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
9. Incubar las cajas a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.
10. Sacar las cajas, revisar si hubo desarrollo de colonias y si no la hubo,
AGAR MUELLER HINTON
 USO: Recomendado para el ensayo de sensibilidad, o para ensayos de

resistencia de agentes patógenos médicamente importantes frente a antibióticos y
sulfamidas.
Ingredientes (g/L)
Extracto de carne 2,0 g.
Peptona de caseína ácida 17,5 g.
Almidón 1,5 g.
Agar 17,0 g.
 pH final: 7,4  0,2
 PROCEDIMIENTO:

frascos de cristal perfectamente limpios con el volumen que se necesite.
minutos.
7. Dejar enfriar los frascos.
medio de cultivo (AMH). Se dejan enfriar hasta solidificación.
guardarlas en bolsas de plástico a la cual se le pegará una etiqueta que
contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda PRUEBA DE

ESTERILIDAD ACEPTABLE.
BASE DE AGAR COLUMBIA
 MARCA: BD BIOXON
 USO: Medio básico para preparación de la gelosa sangre, rico en materiales

nutritivos y especialmente útil para cultivar y multiplicar gérmenes exigentes.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseina 12.0 g.
Peptona de carne 5.0 g.
Extracto de levadura 3.0 g.
Extracto de carne 3.0 g.
Almidón de maíz 1.0 g.
Cloruro de sodio 5.0 g.
Agar 13.50 g.
 pH final: 7.3  0.2 a 25°C
 PROCEDIEMIENTO:
1. Suspender 42.5 g. del polvo por cada litro de agua destilada.

3. Medir el pH inicial y anotarlo en la bitácora de preparación de medios. Ajustar el
pH al indicado en la libra y anotarlo en bitácora anteriormente mencionada.
frascos de cristal perfectamente limpios con un volumen de 300 mL cada uno.
6. Colocar a cada frasco una etiqueta que contenga el nombre del medio de
cultivo, el número de lote de preparación, el volumen que contiene, y la fecha
de preparación.
minutos.
8. Dejar enfriar los frascos aproximadamente a 45°C y adicionarle sangre estéril
medio de cultivo (COL). Se dejan enfriar hasta solidificación.
contenga el nombre del medio de cultivo, el número de lote de preparación, la
fecha de preparación, y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
BASE DE AGAR AZIDA SANGRE

 MARCA: MERCK
 USO: Agar selectivo para la demostración y el aislamiento de Estreptococos y

Estafilococos, a partir de deposiciones, aguas residuales, productos alimenticios u
otros materiales objeto de investigación. Puede utilizarse con o sin adición de
sangre.
Ingredientes (g/L)
Triptosa 10.0 g.
Azida de sodio 0.3 g.
Agar 15.0 g.
 pH final: 7.2  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

de preparación.
minutos.
8. Dejar enfriar los frascos aproximadamente a 45°C y adicionarle sangre estéril
medio de cultivo (AAS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR MUELLER HINTON CON SANGRE

 USO: Recomendado para las pruebas de sensibilidad a antibióticos y cultivo de

Neisseria spp.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína ácida 17.5 g.
Almidón 1.5 g.
Agar 17.0 g.
 pH final: 7.4 0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 38 g. del polvo por cada litro de agua destilada a preparar.

de preparación.
minutos.
medio de cultivo (MHS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
BASE DE AGAR THAYER MARTIN
 USO: Diseñado especialmente para aislar Neisserias patógenas, gonococo y

meningococo cuando se le agrega hemoglobina, antimicrobianos y factores de
crecimiento.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 7.5 g.
Almidón de maíz 1.0 g.
Fosfato dipotásico 4.0 g.
Fosfato monopotásico 1.0 g.
Agar 10.0 g.
 pH final: 7.2  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 7.2 g. del polvo por cada 100 mL de agua destilada.

matraces erlenmeyer de cristal perfectamente limpios con un volumen de 600
mL cada uno.
6. Colocar a cada matraz una etiqueta que contenga el nombre del medio de
de preparación.
7. Esterilizar los matraces a una temperatura de 121°C por un periodo de 15
minutos.
8. Sacar los matraces e inmediatamente adicionarle sangre estéril para que halla
hemólisis (3% si es concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total)
girando suavemente el matraz para evitar la formación de burbujas.
9. Enfriar el matraz en un baño de agua fría para posteriormente adicionarle
reactivo de polienriquecimiento (1 mL por cada 100 mL), y reactivo inhibidor (1
mL por cada 100 mL).
medio de cultivo (ATM). Se dejan enfriar hasta solidificación.
guardarlas en bolsas de plástico a la cual se le pegara una etiqueta que
BASE DE AGAR GELOSA CHOCOLATE
 USO: Diseñado especialmente para aislar Neisserias patógenas, gonococo y

meningococo cuando se le agrega hemoglobina, antimicrobianos y factores de
crecimiento.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseina 7,5 g.
Peptona de carne 7,5 g.
Almidón de maíz 1,0 g.
Fosfato dipotásico 4,0 g.
Fosfato monopotásico 1,0 g.
Agar 10,0 g.
 pH final: 7,2  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 7,2 g. del polvo por cada 100 mL de agua destilada.

matraces erlenmeyer de cristal perfectamente limpios y estériles con un
volumen de 600 mL cada uno.
6. Esterilizar los matraces a una temperatura de 121°C por un periodo de 15
minutos.
7. Sacar los matraces e inmediatamente adicionarle sangre estéril para que halla
hemólisis (3% si es concentrado eritrocitario o 5% si se trata de sangre total)
girando suavemente el matraz para evitar la formación de burbujas.
8. Enfriar el matraz en un baño de agua fría para posteriormente adicionarle
reactivo de polienriquecimiento (1 mL por cada 100 mL).
medio de cultivo (GCH). Se dejan enfriar hasta solidificación.
MEDIO HEMINA BACITRACINA (GHBEL)
 USOS: para el aislamiento y diferenciación de Haemophilus influenzae.
Ingredientes (g/L)
Base de gelosa sangre 40,0 g.
Solución de hemina equina (3 mg/mL) 1,0 mL.
Bacitracina 300 mg/15 mL Agua 15,0 mL.
Agua destilada 1000 mL.
Preparación:
La base de gelosa sangre adicionada de hemina se esteriliza a 121°C durante 15
minutos; se enfría a 45°C y se le adiciona la bacitracina. Se vierte en cajas de petri y
en tubos para su almacenamiento.
Hemina equina:
Se centrifugan 40 mL de sangre desfibrinada de caballo, los eritrocitos se separan y se

les añaden 100 mL de acetona que contenga 1,2 mL de HCl concentrado, con
agitación constante y vigorosa. Se agregan 100 o 120 mL de agua destilada gota a
gota para precipitar la hemina y se almacena durante 5-7 días a 4°C con agitación
esporádica. El precipitado se colecta por centrifugación a 5,000 rpm por 20 minutos, se
lava tres veces con agua destilada, se seca y así se conserva hasta su uso.
Solución de Hemina:
Hemina equina 300,0 mg.
KOH 0,2 M 1,0 mL.
Regulador de Na2HPO4 0,1M, pH 7.0 100,0 mL.
Preparación: verificar el pH y esterilizar a 121°C durante 15 minutos.
Extracto de Levaduras:
Levadura fresca de Fleischmann 32,0 g.
KH2PO4 0,2M 100,0 mL.
Preparación: Se suspende la levadura fresca en el KH 2PO4 y se calienta a 80°C en

baño maría por 20 minutos. Se centrifuga a 5,000 rpm por 45 minutos. El
sobrenadante se esteriliza por filtración con membrana millipore 0.45 µm.
Discos con extractos de levadura: Se adiconan 10 µl del extracto de levadura por disco
de papel filtro estéril (Whatman No.3). Permanecen útiles a 4°C hasta por un mes.
La muestra se siembra en medio GHBEL y se le coloca un disco de extracto de

levadura como fuente del factor V y que difunden en el medio. Después de incubar a
37°C durante 24 horas en atmósfera al 5-10% de dióxido de carbono, las colonias de
Haemophilus se desarrollan característicamente en forma satélite a los discos de
papel filtro.
AGAR BASE DE CASMAN
 MARCA: DIFCO
 USO: Este medio es usado con sangre para el aislamiento de microorganismos

fastidiosos bajo tensión reducida de oxígeno, que favorece el desarrollo
satisfactorio de Haemophilus influenzae y cocos patógenos.
Ingredientes (g/L)
Proteosa peptona No.3 10,0 g.
Triptosa 10,0 g.
Nicotinamida 0,05 g.
Acido p-aminobenzoíco 0,05 g.
Dextrosa 0,5 g.
Almidón de maíz 1,0 g.
Agar 14,0 g.
 pH final: 7.3 0.2 a 25°C.
 PROCEDIMIENTO:

de preparación.
minutos.
(5% si se trata de sangre total) y 0.15% de solución de sangre lisada con agua
estéril (1 parte de sangre a 3 partes de agua), girando suavemente el frasco
para evitar la formación de burbujas.
9. Omitir la solución de sangre lisada con agua estéril si la sangre estéril está
parcialmente lisada debido a almacenamiento.
medio de cultivo (CAS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR NUTRITIVO
 USO: Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias

exigentes.
Ingredientes (g/L)
Peptona de gelatina 5,0 g.
Extracto de carne de res 3,0 g.
Agar 15,0 g.
 pH final: 6,8  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

2. Remojar unos 15 minutos y mezclar perfectamente hasta disolución del polvo.
4. Calentar el medio con agitación frecuente y hervir por uno a dos minutos hasta

necesite.
minutos.
medio de cultivo (AN). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR EOSINA Y AZUL DE METILENO
 USO: Medio selectivo y diferencial para la identificación y diferenciación de

enterobacterias patógenas.
Ingredientes (g/L)
, Lactosa 5,0 g.
Sacarosa 5,0 g.
Agar 13,5 g.
Eosina 0,4 g.
Azul de metileno 0,065 g.
 pH 7,2  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

minutos.
medio de cultivo (EMB). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR DE SAL Y MANITOL
 USO: Medio selectivo para aislar estafilococos patógenos de materiales

clínicos diversos (orina, genitales, heridas, exudados faríngeos, etc.). También se
utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines.
Ingredientes (g/L)
D-manitol 10,0 g.
Agar 15,0 g.
Rojo de fenol 0,025 g.
 pH final: 7,4  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
minutos.
medio de cultivo (ASM). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR CETRIMIDA
 USO: Medio selectivo y diferencial para la identificación y diferenciación de

Pseudomonas patógenas. Este medio promueve tanto la producción de piocinina
como la fluoresceína, bajo la luz ultravioleta, en los cultivos de P. Aeruginosa.
Ingredientes (g/L)
, Cloruro de magnesio 1,4 g.
Sulfato de potasio 10,0 g.
Cetrimida 0,3 g.
Agar 13,6 g.
pH 7,2  0,2 a 25°C.
 PRCEDIMIENTO:
1. Suspender 45,3 g. del polvo por cada litro de agua destilada.

2. Agregar 10,0 mL de glicerol.
3. Remojar durante unos 10 minutos.
7. Esterilizar los frascos a una temperatura de 118° a 121°C por un periodo de 15
minutos.
medio de cultivo (CET). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR DE LOWESTEIN-JENSEN
 MARCA: SE PREPARA POR INGREDIENTES.
 USOS: Para el aislamiento, cultivo y diferenciación de micobacterias.
Ingredientes (g/L)
KH2PO4 anhidro 2,4 g.
MgSO4.7H2O 0,24 g.
Citrato de magnesio 0,6 g.
L-asparagina 3,6 g.
Glicerina bidestilada 12,0 mL
Agua destilada 600,0 mL
Huevos enteros 1,000 mL
Verde de malaquita al 2%
Recién preparada 20,0 mL
Preparación:
1. Disolver las 3 primeras sales y la asparagina en 200 mL. de agua
destilada.Las sales se disuelven fácilmente, pero es necesario calentar
suavemente a baño maría para la disolución de la asparagina.
2. Filtrar en un matraz de 2000 mL de capacidad. Agregar la glicerina y el
resto de agua destilada hasta completar 600 mL.
3. Esterilizar en el autoclave a 121°C por 15 minutos y dejar enfriar.
4. Los huevos deben ser frescos, preferentemente de granja, se limpian
cuidadosamente con un cepillo, agua y jabón, y se dejan por pocos
minutos en un depósito con agua jabonosa. Se lavan prolijamente en

agua corriente, se colocan en un canastillo de alambre y se limpian con
una gasa embebida en alcohol al 70%.
5. Con las manos cuidadosamente lavadas, quebrar los huevos uno por
uno en un pequeño vaso estéril. Esta etapa tiene por objeto observar
cada huevo, que para ser utilizado debe tener yema firme, que
permanezca redonda, sin aplastarse ni romperse.
6. Vaciar los huevos en un vaso de licuadora hasta completar un litro,
donde serán agitados durante algunos segundos. Todo el material debe
ser estéril.
7. Vaciar los huevos homogeinizados en el matraz que contiene la
solucióncon sales, asparagina y glicerina.
8. Agregar enseguida 20 mL de una solución acuosa al 2% de verde de
malaquita recién preparada, filtrada y esterilizada.
9. Mezclar bien agitando manualmente el matraz y luego dejar reposar
para que las burbujas de aire contenidas en el medio asciendan a la
superficie y se eliminen.
Distribución del medio de cultivo:

Todo el material de vidrio a emplear debe estar escrupulosamente limpio y enjuagado
previamente a su esterilización. Emplear un embudo de vidrio de 15-30 cm de
diámetro con la parte superior cubierta con doble capa de gasa. El extremo del
embudo se une con un tubo de vidrio terminado en punta por medio de un tubo
látex. Tanto la parte superior como la punta deben estar protegidos con papel al
esterilizarse. Antes de envasar se coloca en el tubo de látex una pinza de Mohr.
Levantar un costado del papel que recubre el embudo y vaciar el medio de
cultivo, para filtrarlo a través de la gasa. Distribuir el medio en tubos, en
condiciones de esterilidad, trabajando junto al mechero, abriendo y cerrando la
pinza de Mohr.
La cantidad de medio en cada tubo (5 mL aproximadamente) debe ser la suficiente
para obtener una vez coagulado el medio, un plano inclinado, por lo que es
conveniente tener un tubo patrón marcado al nivel correspondiente. Es importante que
queden por lo menos 3 cm entre la boca del tubo y el extremo del plano inclinado. Al
distribuir evitar la formación de burbujas dejando escurrir el medio de cultivo por la
pared interna del tubo. Colocar en el coagulador los tubos evitando girarlos. Con esta
precaución se evitará que el medio de cultivo opaque la pared del tubo, lo que facilitará
la observación de las colonias. El coagulador debe tener una temperatura de 85°C. La
coagulación debe hacerse durante un tiempo máximo de 50 minutos. Terminado el
tiempo de coagulación retirar los tubos evitando su enfriamiento brusco. Una vez a
temperatura ambiente llevarlos a la cámara de cultivos a 37°C, dejándolos durante 48
horas para controlar su esterilidad y eliminar el agua de condensación, los tapones
deben quedar ligeramente flojos. Luego se guardan los tubos en refrigeración,
ajustando bien los tapones para evitar la desecación. Si se usan tubos con tapón de
algodón se guardarán en bolsas de plástico cerradas herméticamente, a fin de que
mantengan la humedad. Se recomienda no usar el medio después de 2 meses de su
preparación.
AGAR DEXTROSA SABOURAND

AGAR MALTOSA SABOURAUND
 USO: Recomendado para el aislamiento, identificación y conservación de

hongos patógenos y saprófitos.
Ingredientes (g/L)
Mezcla de peptonas 10,0 g.

Dextrosa ó maltosa 40,0 g.
Agar 15,0 g.
 pH final: 5,6  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

2. Remojar de 10 a 15 minutos.
3. Mezclar perfectamente hasta obtención de una suspensión uniforme.
7. Esterilizar los frascos a una temperatura de 118°C (nomás de 15 libras de
presión) por un periodo de 15 minutos.
medio de cultivo (ADS ó AMS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR BIGGY (GLICINA, GLUCOSA, LEVADURA Y SULFITO DE SODIO)
 USO: Recomendado para el aislamiento y la identificación presuntiva de

Candida, por medio de la reacción del sulfuro.
Ingredientes (g/L)
Citrato de amonio y bismuto 5,0 g.
Dextrosa 10,0 g.
Glicina 10,0 g.
Extracto de levadura 1,0 g.
Agar 16,0 g.
 pH final: 6,8  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:


disolución completa. No se autoclavea.
medio de cultivo (BIGGY). Se dejan enfriar hasta solidificación.
6. Determinar La funcionalidad del medio del medio de cultivo con
microorganismos típicos.
AGAR PARA METODOS ESTANDAR
 USO: Recomendado para el recuento de bacterias en Microbiología Sanitaria

(para recuento en placa), principalmente de la leche y otros alimentos de
importancia sanitaria.
Ingredientes (g/L)
Dextrosa 1,0 g.
Agar 15,0 g.
 pH final: 7,0  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 23,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.
2. Remojar y Mezclar perfectamente de 5 a 10 minutos hasta disolución del polvo.
minutos.
7. Dejar enfriar los frascos y rotular con el nombre del medio (CMA).
AGAR VERDE BRILLANTE
 USO: Medio altamente selectivo empleado para aislar Salmonella (excepto S.

typhi y Shigella) de heces, orina, leche y productos lácteos, y de otros alimentos de
importancia sanitaria.
Ingredientes (g/L)

Lactosa 10.0 g.
Sacarosa 10.0 g.
Rojo de fenol 0.08 g.
Verde brillante 0.0125 g.
Agar 20 .0 g.
 pH 6.9  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo. Adicionar a la mezcla 0.08
grs de *Sulfadiazina por cada litro de agua a preparar.
de preparación.
minutos.
8. Dejar enfriar los frascos y posteriormente medir el pH final y anotarlo en
bitácora de preparación de medios.
medio de cultivo (AVB). Se dejan enfriar hasta solidificación.
*SULFADIAZINA: Pesar 0.085 g. y disolverla en 20 ml de agua destilada. Calentar

hasta ebullición.
AGAR DE MAC CONKEY
 USO: Empleado para aislar e identificar enterobacterias y coliformes a partir de

heces fecales, orina, aguas negras y diversos alimentos.
Ingredientes (g/L)
Peptona de gelatina 17.0 g.
Lactosa 10.0 g.
Sales biliares 1.5 g.
Agar 13.5 g.
Rojo neutro 0.03 g.
Cristal violeta 0.001 g.
 pH : 7.1  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

de preparación.
minutos.
bitácora.
medio de cultivo (MAC). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR TCBS
 USO: Utilizado para el aislamiento y cultivo selectivo de Vibrio cholerae y otro

vibriones enteropatógenos.
Ingredientes (g/L)
Citrato sódico 10.0 g.
Tiosulfato sódico 10.0 g.
Bilis de buey desecada 5.0 g.
Colato sódico 3.0 g.
Sacarosa 20.0 g.
Cloruro sódico 3.0 g.
Citrato de hierro (III) 1.0 g.
Azul de bromotimol 0.04 g.
Agar 14.0 g.
 pH final: 8.6  0.2 a 25°C

 PROCEDIMIENTO:

disolución completa. No se autoclavea.
medio de cultivo (TCBS). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR SULFITO DE BISMUTO
 USO: Agar selectivo para el aislamiento y diferenciación de Salmonella typhi y

otras Salmonellas, a partir de material clínico y otras clases.
Ingredientes (g/L)
Extracto de carne 5.0 g..
D(+)-glucosa 5.0 g.
Hidrogenofosfato disódico 4.0 g.
Sulfato ferroso 0.3 g.
Verde brillante 0.025 g.
Indicador bismuto-sulfito 8.0 g.
Agar 15.0 g.
 pH final: 7.6  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

disolución completa. No autoclavear.
5. Vaciar a cajas de petri y eliminar las burbujas que hayan quedado con la
ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se le rotula las iniciales
del medio de cultivo (ASB). Se dejan enfriar hasta solidificación.
AGAR SALMONELLA SHIGELLA
 USO: Medio diferencial selectivo para el aislamiento de Salmonella y Shigella,

a partir de heces, orina y alimentos diversos, tanto frescos como enlatados.
Ingredientes (g/L)
Lactosa 10,0 g.
Sales biliares 8,5 g.
Citrato de sodio 8,5 g.
Tiosulfato de sodio 8,5 g.
Citrato férrico 1,0 g.
Agar 13,5 g.
Rojo neutro 0,025 g.
Verde brillante 0,330 mg.
 pH final: 7.0  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Medir el pH inicial y anotarlo en la bitácora de preparación de medios. Ajustar
el pH al indicado en la libra y anotarlo en bitácora anteriormente mencionada.
5. Enfriar entre 45 y 50°C.
6. Vaciar a cajas de petri empleando 20 mL por caja y eliminar las burbujas que
hayan quedado con la ayuda de la flama de un mechero bunsen. A la placa se
le rotula las iniciales del medio de cultivo (SS). Se dejan enfriar hasta
solidificación.
AGAR XILOSA LISINA DESOXICOLATO (XLD)
 USO: Medio diferencial selectivo para el aislamiento de bacterias

enteropatógenas, especialmente de los géneros Salmonella, Shigella y Arizona.
Ingredientes (g/L)
Xilosa 3,5 g.
L-lisina 5,0 g.
Lactosa 7,5 g.
Sacarosa 7,5 g.
Agar 13,5 g.
Desoxicolato de sodio 2,5 g.
Citrato de hierro y amonio 0,8 g.
 pH final: 7.4  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

2. Dejar que se remoje de 10 a 15 minutos.
5. Calentar el medio con todo cuidado hasta una temperatura aproximada de
90°C pero sin que el medio llegue a hervir.
6. Dejar de calentar en cuanto se obtenga una disolución completa del polvo.
7. No autoclavear.
8. Una vez disuelto, enfriar rápidamente en agua o en baño maría a 50°C.
9. El medio debe ser transparente y tener un color rojo rubí anaranjado.
le rotula las iniciales del medio de cultivo (XLD). Se dejan enfriar hasta
solidificación.
11. El calentamiento excesivo o el mantener el medio demasiado tiempo en baño
maría puede ocasionar que se formen precipitados. En este caso se corre el
riesgo de que las colonias sean de menor tamaño y presenten reacciones
menos nítidas. Sin embargo, el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano
y puede eliminarse por filtración con papel filtro.
AGAR ENTERICO HEKTOEN
 USO: Medio diferencial selectivo para el aislamiento y diferenciación de

patógenos entéricos como Salmonella, Shigella y otras enterobacterias.
Ingredientes (g/L)
Lactosa 12,0 g.
Sacarosa 12,0 g.
Salicina 2,0 g.
Citrato de hierro y amonio 1,5 g.
Agar 14,0 g.
Azul de bromotimol 0,065 g.
Fucsina ácida 0,1 g.
 pH final: 7,5  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

5. Enfriar entre 50 y 60°C.

le rotula las iniciales del medio de cultivo (AH). Se dejan enfriar hasta
solidificación.
AGAR DE BILIS Y ROJO VIOLETA
 USO: Utilizado para la detección de microorganismos coliformes en agua,

productos lácteos y otros alimentos.
Ingredientes (g/L)
Mezcla de sales biliares 1.5 g.
Lactosa 10.0 g.
Agar 15.0 g.
Rojo neutro 0.03 g.
Cristal violeta 0.002 g.
 pH final: 7.4  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

frascos de cristal estériles con un volumen de 300 mL cada uno.
de preparación.
bitácora de preparación de medios.
AGAR SOYA TRIPTICASA
 USO: Cultivo sólido altamente nutritivo de gérmenes exigentes, para realizar

pruebas de sensibilidad o preparar com sangre para detectar hemólisis.

Ingredientes (g/L)
Peptona de soya 3,0 g.

Dextrosa 2,5 g.
Agar 15,0 g
 pH final: 7,3  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 30 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.

de preparación.
minutos.
bitácora.
medio de cultivo (AST). Se dejan enfriar hasta solidificación.
CALDO MUELLER HINTON
 USO: Recomendado para crecer bacterias Gramnegativas y dejar a 0,5

MacFarland previo al Antibiograma.
Ingredientes (g/L)

Peptona de caseína ácida 17.5 g.
Almidón 1.5 g.
 pH final: 7.4  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:


5. Dejar enfriar hasta los 50°C aproximadamente y posteriormente vaciar a tubos
con 10 mL del caldo.
6. Colocar a cada tubo una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo,
el número de lote de preparación, el volumen que contiene, y la fecha de
preparación.
7. Esterilizar los tubos a una temperatura de 121°C por un periodo de 15 minutos.
8. Dejar enfriar los tubos y posteriormente medir el pH final y anotarlo en bitácora.
9. Incubar los tubos a 37°C por 24 hrs. para realizar la prueba de esterilidad.
10. Sacar los tubos, revisar si hubo desarrollo de turbidez y si no la hubo,
CALDO NUTRITIVO
 USO: Cultivo líquido complejo de uso en general para el cultivo de bacterias.
Ingredientes (g/L)
 pH final: 6,9  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

4. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite.
5. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 121°C por un periodo de 15
minutos.
6. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CN). Se dejan
enfriar.
AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA)
 USO: Cultivo líquido de enriquecimiento para favorecer el desarrollo de Vibrio

cholerae.
Ingredientes (g/L)
 pH final: 9,0  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Pesar la cantidad de cada uno de los ingredientes con exactitud.

2. Mezclar perfectamente hasta disolución del polvo y calentar suavemente la
disolución.
3. Medir el pH inicial. Ajustar el pH al indicado.
4. Envasar en recipientes adecuados con el volumen que se necesite. Puede ser
en tubos de 16X150 mm con tapón de rosca un volumen de 10 mL y/o en
frascos un volumen de 450 mL para muestras de alimentos o 50 mL de APA
concentrada 10X para muestras de agua blanca.
minutos.
6. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (APA). Se dejan
enfriar.
CALDO NUTRITIVO CON AGAR AL 0,5%
 USO: Cultivo semisólido de uso en general para el cultivo de bacterias no

exigentes para determinar movilidad.

Ingredientes (g/L)
Agar 5,0 g.
 pH final: 6,9  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 8 g. del polvo de caldo nutritivo por cada litro de agua destilada.
3. Adicionar el agar en la cantidad señalada.
5. Envasar en recipientes adecuados (tubos de ensayo de 13 x 100 mm con
tapón de rosca) con un volumen de 4,0 mL.
minutos.
7. A los recipientes se les rotula las iniciales del medio de cultivo (CNA 0,5%). Se
dejan enfriar.
CALDO INFUSION DE CEREBRO CORAZON (BHI)
 USO: Cultivo líquido de gérmenes exigentes.
Ingredientes (g/L)
Infusión de cerebro de ternera 200,0 g.
Infusión de corazón de res 250,0 g.

Dextrosa 2,0 g.
Fosfato disódico 2,5 g.
 pH final: 7,4  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Calentar ligeramente si es necesario.
minutos.
7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (BHI). Se dejan
enfriar.
CALDO EXTRACTO DE MALTA
 MARCA: DIFCO
 USO: Cultivo líquido altamente nutritivo de gérmenes exigentes.
Ingredientes (g/L)
Extracta de malta 15,0 g.
 pH final: 7,0  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Añadir el extracto de malta a un litro de agua destilada.

minutos.
7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (CEM). Se dejan
enfriar.
CALDO ROJO DE FENOL + CARBOHIDRATOS
 USO: Estudio de fermentación de carbohidratos por bacterias.
Ingredientes (g/L)
Carbohidratos 5,0 g.
 pH final: 7,4  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Disolver 20 gramos del medio deshidratado en un litro de agua destilada.

2. Mezclar perfectamente hasta disolución del soluto.
5. Coloque una campana de Durham en cada uno de los tubos con tapón de
rosca de 13X100 mm.
6. Vierta el caldo en los tubos en porciones de 5 mL.
7. Esterilizar los recipientes a una temperatura de 116° - 118°C (no más de 12
libras de presión) por un periodo de 15 minutos. No sobrecalentar.
8. Permitir enfriar los tubos a temperatura ambiente.
Nota: Los azúcares glucosa, lactosa y sacarosa se pueden esterilizar a 116-118°C
sin que sufran daño. La fructosa y la xilosa deben ser esterilizados por medio de
filtros bacteriológicos.
AGAR DE HIERRO Y TRIPLE AZUCAR
 USO: Para identificación y diferenciación de enterobacterias. Medio empleado

para determinar la capacidad de un organismo de atacar un carbohidrato
específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de
gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico.
Ingredientes (g/L)

Lactosa 10.0 g.
Sacarosa 10.0 g.
Dextrosa 1.0 g.
Sulfato de hierro y amonio 0.2 g.
Tiosulfato de sodio 0.2 g.
Rojo de fenol 0.25 g.
Agar 13.0 g.
 pH final: 7.3  0.2 a 25°C
 PRECEDIMIENTO:


de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y adicionar un
volumen de 4.0 mL cada uno.
6. Agrupar tubos de 10 en 10 y colocar a cada grupo de tubos una etiqueta que
contenga el nombre del medio de cultivo, el número de lote de preparación, el
volumen que contiene, y la fecha de preparación.
8. Sacar los tubos e inclinarlos para que al solidificarse quede la forma de pico de
flauta.
10. Sacar los tubos, revisarlos y guardarlos en bolsas de plástico a la cual se le
pegará una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo, el número
de lote, la fecha de preparación, y la leyenda PRUEBA DE ESTERILIDAD
ACEPTABLE.
AGAR DE HIERRO Y LISINA
 USO: Agar de ensayo para demostración simultánea de lisina - descarboxilasa

y de la formación de ácido sulfhídrico para la identificación de Enterobacteriáceas
sobre todo de Salmonella y Shigella.
Ingredientes (g/L)

Dextrosa 1.0 g.
L-lisina 10.0 g.
Citrato de hierro y amonio 0.50 g.
Tiosulfato de sodio 0.04 g.
Púrpura de bromocresol 0.02 g.
Agar 15.0 g.
 pH final: 6.7  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

flauta.
ACEPTABLE.
MEDIO MIO
 USO: Para la identificación de enterobacterias sobre la base de movilidad, la

producción de ornitina descarboxilasa y el indol.
Ingredientes (g/L)
L-Ornitina 5.0 g.
Dextrosa 1.0 g.
Agar 2.0 g.
Púrpura de bromocresol 0.02 g.
 pH final: 6.5  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

ACEPTABLE.
MEDIO RM-VP
 MARCA: BIOXON
 USO: Medio líquido empleado para efectuar las reacciones indicadas de rojo de
metilo y acetil-metil-carbinol (Vogues-Proskauer) del grupo
Escherichia/Enterobacter.
Ingredientes (g/L)
Dextrosa 5,0 g.
 pH 6.9  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Si es necesario. Calentar ligeramente hasta disolución.
5. Distribuir a tubos de 13 x 100 mm de cristal con rosca, perfectamente limpios y
adicionar un volumen de 4.0 mL cada uno.
ACEPTABLE.
10. Adicionar 0,6 mL de la solución A y 0,2 mL de la solución B a 1 mL de cultivo
en caldo RM-VP del organismo, incubado a 37°C por 48 horas. Mezclar bien,
después de la adición de cada reactivo; no tapar el tubo. Dejar en reposo por
15 minutos. Estos reactivos se preparan de la manera siguiente:
1.- Solución A:
Alfa naftol 5,0 g.
Alcohol etílico absoluto 100,0 mL
2.- Solución B:
KOH 40,0 g.
Agua destilada 100,0 mL.
BASE MOELLER DESCARBOXILASA PARA ARGININA
 MARCA: DIFCO
 USO: Medio líquido empleado para diferenciar bacterias en base a la actividad

de descarboxilación de la arginina.
Ingredientes (g/L)
Peptona 5,0 g.
Dextrosa 0,5 g.
Púrpura de bromocresol 0,01 g.
Rojo de cresol 0,005 g.
Piridoxal 0,005 g.
 pH 6.0  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Calentar con frecuente agitación y hervir por 1 minuto hasta que se disuelva
completamente el polvo.
4. Adicionar 10 gramos de L-Arginina y disolver.
ACEPTABLE.
BASE DE AGAR UREA
 USO: Estudio de diferenciación de enterobacterias a través de la actividad de la

ureasa.
 MARCA BD BIOXON
Ingredientes (g/L)
Dextrosa 1,0 g.
Urea 20,0 g.
 pH final: 6,8  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Disolver 29,0 gramos del medio deshidratado en 100 mL de agua destilada y

esterilizar por filtración.
2. Disolver por ebullición 15,0 g de agar en 900 mL de agua destilada.
3. Mezclar perfectamente hasta disolución del soluto.

5. Esterilizar a 121°C por 15 minutos, enfriar a 50°C y agregar a los 100 mL de la
base con urea estéril, mezclar bien y distribuir asépticamente
6. Vierta el medio en los tubos de 13 x 100 estériles en porciones de 4 mL.
7. Dejar solidificar en posición inclinada.
CALDO MALONATO DE EWING MODIFICADO
 MARCA: BIOXON
 USO: Medio líquido empleado para diferenciar enterobacterias como Klebsiella,

Salmonella y Shigella.
Ingredientes (g/L)
Sulfato de amonio 2,0 g.
Malonato de sódio 3,0 g.
Dextrosa 0,250 g.
Azul de bromotimol 0,250 g.
 pH 6.7  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Si es necesario, calentar ligeramente hasta disolución.
ACEPTABLE.
AGAR CITRATO DE SIMMONS
 MARCA: BIOXON
 USO: Utilizado para la diferenciación de Enterobacterias basado en la

utilización de Citrato como única fuente de carbono para el metabolismo,
produciendo alcalinidad.
Ingredientes (g/L)
Sulfato de Magnesio 0.2 g.
Fosfato dihidrógeno de amonio 1.0 g.
Fosfato dipotásico 1.0 g.
Citrato de sodio 2.0 g.
Agar 15.0 g.
Azul de bromotimol 0.08 g.
 pH 6.8  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

flauta.
ACEPTABLE.
CALDO INDOL
 USO: Cultivo para la identificación de enterobacterias sobre la base de la

producción de indol a partir de triptófano.

Ingredientes (g/L)
 pH final: 7,3  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 25 g. de la mezcla de los ingredientes por cada litro de agua

destilada.
2. Mezclar perfectamente hasta disolución de los solutos.

4. Medir el pH inicial. Ajustar al pH final.
5. Envasar en tubos con tapón de rosca de 13 x 100 mm con el volumen que se
necesite (4 mL).
6. Agrupar los tubos en serie de 10 piezas y esterilizarlos a una temperatura de
121°C por un periodo de 15 minutos.
7. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (Indol). Se dejan
enfriar.
8. Para la interpretación de la prueba adicionar 5 gotas del reactivo de Kovac.
Este reactivo se prepara de la siguiente manera:
p-dimetilaminobenzaldehído 10,0 g.
Alcohol amílico o isoamílico 150 mL.
HCl concentrado 50 mL.
Disolver el aldehído en el alcohol, agregar lentamente el ácido clorhídrico a la
mezcla aldehído-alcohol.
AGAR FENILALANINA
 USO: Agar de ensayo para demostración de fenilalaninadesaminasa para la

diferenciación de grupo de Proteus y Providencia de otros miembros de
enterobacterias.
Ingredientes (g/L)
DL-fenilalanina 2.0 g.
Fosfato de sodio 1,0 g.
Agar 12.0 g.
 pH final: 7,3  0.2 a 25°C.
 PROCEDIMIENTO:

flauta.

ACEPTABLE.
11. Al medio de cultivo una vez inoculada e incubado se le adiciona cloruro férrico
al 10% preparado de la siguiente manera:
Cloruro férrico 10,0 g.

HCl concentrado 2,5 g.
CALDO TIOGLICOLATO
 USO: Pruebas de esterilidad de productos biológicos y farmacéuticos.
Ingredientes (g/L)
Dextrosa (glucosa) 5,0 g.
L-cistina 0,5 g.
Tioglicolato de sódio 0,5 g.
Agar 0,75 g.
Rezasurina (certificada) 0,001 g.
 pH final: 7,1  0,1 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
1. Suspender 28,5 g. del medio deshidratado por cada litro de agua destilada.
2. Mezclar perfectamente hasta disolución del medio.
3. Medir el pH inicial. Ajustar al pH final.
4. Calentar agitando frecuentemente.
5. Hervir hasta disolución.
6. Distribuir en tubos con tapón de rosca de 16 x 175 mm con el volumen que se
necesite (10 mL).
7. Agrupar los tubos en serie de 10 piezas y esterilizarlos a una temperatura de
121°C por un periodo de 15 minutos.
8. A los recipientes se le rotula las iniciales del medio de cultivo (Tioglicolato). Se
dejan enfriar.
9. Se puede prescindir del agar y de la rezasurina.
MEDIO SIM
 USO: Utilizado para la diferenciación e identificación de Enterobacterias

basado en la utilización de sulfuros, indol y movilidad.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 20,0
Peptona de carne 6,1
Sulfato de hierro y amonio 0,2
Tiosulfato de sodio 0,2

Agar 3,5
 pH 7,3  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Remojar durante 10 minutos.
volumen de 4,0 mL cada uno.
contenga el nombre del medio de cultivo.
9. Sacar los tubos y enfriar en posición vertical.
pegará una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo y la leyenda
PRUEBA DE ESTERILIDAD ACEPTABLE.
GELATINA NUTRITIVA
 USO: Utilizado en la determinación de gérmenes que licuan la gelatina

(proteolíticos).
Ingredientes (g/L)
Peptona de gelatina 5,0
Extracto de carne de res 3,0
Gelatina 120,0
 pH 6,8  0,2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:
2. Remojar durante 10 minutos.
4. Calentar ligeramente para disolverlo.
volumen de 4,0 mL cada uno.
contenga el nombre del medio de cultivo.
9. Sacar los tubos y enfriar.

pegará una etiqueta que contenga el nombre del medio de cultivo (GN) y la
BASE DE CALDO TETRATIONATO
 USO: Medio líquido de enriquecimiento, empleado para aislar Salmonella typhi

y otras salmonelas provenientes de heces, agua residual, alimento, y otros
materiales de interés sanitario.
Ingredientes (g/L)
Carbonato de calcio 10,0 g.
 pH 7,5  0.2 a 25°C
 PROCEDIMIENTO:

3. Calentar hasta ebullición.
4. No esterilizar en autoclave.
6. Distribuir a tubos estériles de 16 x 150 mm de cristal con rosca, perfectamente
limpios y adicionar un volumen de 10,0 mL cada uno.
8. Si se va a usar el mismo día, agregar 20 mL de solución yodo-yodurada, si no
es así, adicionar 0,2 mL (de 3 a 4 gotas) de solución yodo-yodurada a cada
tubo preparándola de la siguiente manera:
Yodo en cristales 6,0 g.

Yoduro de potasio 5,0 g.

Manual Microbiología II

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Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología II

QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO

MANUAL DE PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA II

MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

Miguel Angel Aguayo López

Ramón A. Cedillo Nakay

Carlos Eduardo Monroy Galindo

Daniel Jaramillo Cano

Patricia Campos Pulido

Ma. Rosario Moreno Véjar

MARIO ALBERTO GAITAN HINOJOSA

Miguel Ángel Aguayo López

Ramón A. Cedillo Nakay

Juan Calos Yánez Velazco

Carlos Eduardo Monroy Galindo

José Gerardo Cerrato Oseguera

Martha Alicia Magaña Echeverría

Daniel Jaramillo Cano

Mario Alberto Gaitán Hinojosa

Patricia Campos Pulido

Juan Carlos Morales Ramírez

Mario Alberto Gaitán Hinojosa

NOMBRE DEL ALUMNO(s)

El manual de Microbiología II está enfocado a la Bacteriología Médica

Consideramos que este manual va a servir de guía a los estudiantes en

En virtud de que este manual esta dirigido a estudiantes de las ciencias

El manual de prácticas está compuesto de 10 experimentos. Estas 10

Cada parte experimental contempla los objetivos y competencias, una

Como parte complementaria del manual de Microbiología se presentan

Finalmente, considero que el manual será una herramienta

M. en C. Mario Alberto Gaitán Hinojosa

CONSIDERACIONES GENERALES PARA SU PROTECCION

1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas para el trabajo

2. Todas las muestras de especímenes biológicos deben considerarse

3. Todos los alumnos deben usar permanentemente una bata de

4. Está absolutamente prohibido: fumar, ingerir líquidos (agua, refresco,

5. No deberá sacar del laboratorio equipo, cepas o medios de cultivo

6. No poner ropa o libros sobre la mesa de trabajo, ni guardar material de

7. Los membretes o etiquetas deben ser humedecidos con agua y no con

8. Al inicio y al final de la práctica limpiar y descontaminar las mesas de

9. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón antiséptico y

10. No se permite la visita personal de personas ajenas a la práctica ya que

PROCEDIMIENTOS DEL LABORATORIO

2. En caso de cualquier accidente personal (herida personal o incendio) o

primero conservar la calma y colocar servilletas o toallas de papel sobre

3. No se debe pipetear con la boca. Usar siempre pipetas automáticas o

4. Todos los procedimientos se deben efectuar con cuidado para no formar

5. Todo el personal debe lavarse las manos profusamente con un

6. Todo el material sucio debe ser manejado con guantes.

7. Hay que separar las pipetas, portaobjetos y cubreobjetos contaminados

8. A todo el material contaminado de desecho se le deben quitar etiquetas

9. Las pipetas contaminadas se sumergen en una solución de hipoclorito

10. procurar no producir “salpicaduras” con la muestra obtenida. Debe

PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO DE

La sangre y los líquidos corporales de los pacientes o estudiantes deben

necesario el uso de mascarilla y gafas protectoras. Hay que cambiarse

Material indispensable que deberá traer el estudiante por sesión.

1. Bata blanca de laboratorio.

Las medidas de bioseguridad que deben seguirse en un laboratorio de

1. Hay que seguir cuidadosamente las reglas establecidas mencionadas

ELEMENTOS PROPUESTOS PARA QUE INTEGREN A UNA PRÁCTICA

Explicación detallada sobre cada uno de los posibles elementos:

Portada de presentación con los siguientes datos: