Manual

IDK® Zonulin ELISA

Para la determinación in vitro de zonulina en heces

Valid desde 2017-01-10

Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany

Tel.: +49 6251 70190-0 Fax: + 49 6251 849430
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TABLA DE CONTENIDOS
1. USO PREVISTO __________________________________________________________ 3

2. INTRODUCCIÓN _________________________________________________________ 3

3. MATERIAL SUMINISTRADO ________________________________________________ 3

4. MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO ____________________________ 4

5. PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REAGENTES_____________________ 4

6. COLECCIÓN DE MUESTRAS Y PREPARACIÓN ________________________________ 5

Extracción de las muestras fecales _____________________________________________ 5

Preparación de la muestra ____________________________________________________ 6

Preparación de normas y controles _____________________________________________ 6

7. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO _____________________________________________ 6

Principio de la prueba ________________________________________________________ 6

Procedimiento de prueba _____________________________________________________ 7

8. RESULTADOS ___________________________________________________________ 8

9. LIMITACIONES __________________________________________________________ 8

10. CONTROL DE CALIDAD __________________________________________________ 9

Rango de referencia _________________________________________________________ 9

11. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO _____________________________________ 9

Precisión y reproducibilidad ___________________________________________________ 9

Sensibilidad analítica _________________________________________________________ 10

Recuperación de la dilución ___________________________________________________ 10

12. PRECAUCIONES ________________________________________________________ 10

13. CONSEJOS TÉCNICOS ___________________________________________________ 10

14. NOTAS GENERALES SOBRE EL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO Y ENSAYO _______ 11

15. REFERENCIAS _________________________________________________________ 11

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1. USO PREVISTO
Este ELISA está destinado a la determinación cuantitativa de la zonulina en las heces. Sólo
para uso diagnóstico in vitro.

2. INTRODUCCIÓN
La zonulina es una nueva proteína humana análoga a la toxina zonula occludens derivada
de Vibrio cholerae que participa en estrechas uniones entre las células de la pared del tracto
digestivo. La zonulina se une a un receptor específico en la superficie del epitelio intestinal y
desencadena una cascada de eventos bioquímicos que induce un desmontaje de la unión
apretada y un subsiguiente aumento de la permeabilidad del epitelio intestinal, permitiendo
que algunas sustancias pasen a través y activen las reacciones inmunitarias.

El Dr. Fasano y sus colaboradores descubrieron que el sistema zonulin-zonulin-receptor es

más activado en pacientes con enfermedad celíaca y diabetes mellitus tipo 1. Los pacientes
con enfermedad celíaca activa mostraron niveles más altos de zonulina y anticuerpos anti-
zonulina en comparación con los pacientes no celíacos y los pacientes en remisión, que
estaban en una dieta sin gluten.

Con respecto a la diabetes tipo 1 autoinmune, en experimentos con ratas se pudo demostrar
que los niveles elevados de zonulina, así como el aumento de la permeabilidad intestinal,
preceden a la diabetes tipo 1. Por el contrario, la diabetes tipo 1 podría prevenirse mediante
la inhibición de la zonulina en experimentos con animales.

Además, se informó de que muchas personas que sufren de enfermedad celíaca también
sufren de otros trastornos autoinmunes. Se sugiere que el aumento de los niveles de
zonulina, son un factor que contribuye al desarrollo de la enfermedad celíaca y otros
trastornos autoinmunes como la diabetes insulino-dependiente, la esclerosis múltiple y la
artritis reumatoide.

3. MATERIAL SUMINISTRADO
Cat. N° Etiqueta Componentes del kit Cantidad
K 5600 PLATE PLATE Placa de microtitulación, pre-recubierta 12 x 8 pocillos
K 5600 WASHBUF WASHBUF Buffer de lavado concentrado, 10 x 2 x 100 ml
K 5600 DIL DIL Buffer de dilución concentrado, 2.5 x 2 x 100 ml
K 5600 TRACER TRACER Trazador concentrado, 100 x (biotinilada 1 x 300 μl
zonulin)
Conjugado concentrado, 100 x (estreptavidina
K 5600 CONJ CONJ 1 x 200 μl
marcada con peroxidasa)
STD Estándar, liofilizadas (Ver especificación de 4 x 5 viales
K 5600 STD
concentraciones)
K 5600 CTRL 1 CTRL 1 Control, liofilizado (Ver especificación de rango) 4 x 1 vial
K 5600 CTRL 2 CTRL 2 Control, liofilizado (Ver especificación de rango) 4 x 1 vial
SUB TMB substrato (Tetrametilbenzidina), listo para 1 x 15 ml
K 5600 SUB
usar
K 5600 STOP STOP Solución de parada ELISA, lista para usar 1 x 15 ml

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Para reordenar componentes individuales, utilice el número de catálogo seguido de la etiqueta como
número de producto.

4. MATERIAL REQUERIDO PERO NO SUMINISTRADO

• Agua ultra pura*

• Pipetas de precisión calibradas y puntas de 10-1000 μl

• Lámina para cubrir la placa de microtitulación

• Agitador horizontal de placas de microtitulación (disponible a través de Immundiagnostik

bajo petición)

• Pipetas multicanal o pipetas repetidoras

• Vortex

• Frascos de vidrio o plástico estándar de laboratorio, tazas, etc., hechos de polipropileno

• Lector de placas de microtitulación

* Immundiagnostik AG recomienda el uso de agua ultra pura (agua tipo 1, ISO 3696), que está libre
de iones no disueltos y coloidales y moléculas orgánicas (libre de partículas > 0,2 μm) con una
conductividad eléctrica de 0,055 μS/cm a 25 °C (≥ 18,2 MΩ cm).

5. PREPARACIÓN Y ALMACENAMIENTO DE LOS REACTIVOS

• Para ejecutar el ensayo más de una vez, asegúrese de que los reactivos estén
almacenados en las condiciones indicadas en la etiqueta. Prepare sólo la cantidad
apropiada necesaria para cada ejecución. El kit puede utilizarse hasta 4 veces dentro de
la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

• Los reactivos con un volumen inferior a 100 μl deben centrifugarse antes de su uso para
evitar la pérdida de volumen.

• Preparación del buffer de lavado: El buffer de lavado concentrado (WASHBUF) debe

diluirse con agua ultra pura 1:10 antes de usar (100 ml de WASHBUF + 900 ml de agua
ultra pura), mezclar bien. Los cristales pueden ocurrir debido a la alta concentración de sal
en el concentrado. Antes de la dilución, los cristales tienen que volverse a disolver a
temperatura ambiente o en un baño de agua a 37 °C. El WASHBUF es estable a 2-8 °C
hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El buffer de lavado (WASHBUF diluido
1:10) se puede almacenar en un matraz cerrado a 2-8 °C durante 1 mes.

• Preparación del buffer de dilución: El DIL (buffer de dilución concentrado) debe diluirse
con agua ultra pura 1:2.5 antes de usar (100 ml DIL + 150 ml de agua ultra pura), mezclar
bien. Los cristales pueden ocurrir debido a la alta concentración de sal en el concentrado.
Antes de la dilución, los cristales tienen que volverse a disolver en un baño de agua a 37 °C.
El DIL es estable a 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El buffer de

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dilución (DIL diluido 1:2.5) se puede almacenar en un matraz cerrado a 2-8 °C durante 1
mes.

• Preparación de estándar y controles: Los estándares liofilizados (STD) y los controles

(CTRL) son estables a 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Los
detalles de la reconstitución se dan en la hoja de especificaciones. Los estándares y
controles (STD y CTRL reconstituidos) no son estables y no pueden almacenarse.

• Preparación del trazador: El trazador concentrado (TRACER) debe diluirse 1:101 en

buffer de dilución (150 μl de TRACER + 15 ml de buffer de dilución) inmediatamente antes
de su uso. El TRACER es estable a 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta. Tracer (1:101TRACER diluido) no es estable y no puede almacenarse.

• Preparación del conjugado: El conjugado concentrado (CONJ) debe diluirse 1:101 en

buffer de dilución (100 μl CONJ + 10 ml buffer de dilución) inmediatamente antes de su uso.
El CONJ es estable a 2-8 °C hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. El
conjugado (1:101 CONJ diluido) no es estable y no puede almacenarse.

• Todos los demás reactivos de prueba están listos para usar. Los reactivos de ensayo son
estables hasta la fecha de caducidad (ver etiqueta del empaque del test) cuando se
almacenan a 2-8 °C.

6. COLECCIÓN DE LA MUESTRA Y PREPARACIÓN

La estabilidad de la muestra es la siguiente:

Heces fecales:

4 días a temperatura ambiente (15-30 °C) así como 3 meses a -20 °C.

Extractos de heces (1:50)

7 días a -20 °C.

Extracción de las muestras de heces

Se utiliza buffer de dilución como buffer de extracción de muestras. Recomendamos la

siguiente preparación de la muestra:

Sistema de aplicación de muestras de heces (SAS) (Cat. nº: K 6998SAS)

Tubo de muestras de heces - Instrucciones de uso

Tenga en cuenta que el factor de dilución de la suspensión final de heces depende de la

cantidad de muestra de heces utilizada y del volumen del buffer.

SAS con 0,75 ml de tampón de extracción:

Cantidad aplicada de heces: 15 mg

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Buffer Volumen: 0,75 ml

Factor de Dilución: 1:50

Por favor, siga las instrucciones para la preparación de muestras de heces utilizando el
SAS como sigue:

A) La muestra de heces en bruto debe descongelarse. Para muestras particularmente

heterogéneas, se recomienda una homogeneización mecánica utilizando un aplicador,
bucle de inoculación o un dispositivo similar.

B) Llenar el tubo de muestra vacío con 0,75 ml de buffer de dilución antes de usarlo con
la muestra. Importante: Deje que el buffer de extracción alcance la temperatura ambiente.

C) Desenrosque el tubo (parte amarilla del tapón) para abrirlo. Inserte la varilla medidora
de color amarilla en la muestra. La parte inferior de la varilla de medición tiene muescas
que necesitan ser cubiertas completamente con las heces después de insertarlo en la
muestra. Coloque la varilla medidora en el tubo. Al volver a colocar la palanca en el tubo,
el exceso de material se retirará, dejando 15 mg de muestra para diluir. Atornille
firmemente para cerrar el tubo.

D) Agite bien el tubo hasta que no queden muestras de heces en las muescas.
Importante: Por favor, asegúrese de que tiene una suspensión máxima homogénea
después de agitar. Especialmente con muestras más sólidas, empapar la muestra en el
tubo con tampón durante ~ 10 minutos mejora el resultado.

E) Deje reposar la muestra durante ~ 10 minutos hasta que el sedimento se haya

asentado. El material flotante como cáscaras de granos puede ser omitido.

F) Desenroscar con cuidado la tapa completa del tubo incluyendo el anillo azul más la
varilla de nivel. Deseche la tapa y la varilla de medición. Asegúrese de que el sedimento
no se disperse de nuevo.

Factor de Dilución: 1:50

Preparación de la muestra

Pipetee 150 μl de cada sobrenadante de la muestra de heces y 150 μl de trazador en los

tubos de reacción marcados y mezcle bien.

Preparación de estándar y controles

Transferir 150 μl de STD o CTRL en los tubos de reacción marcados correspondientemente,

agregar 150 μl de trazador y mezclar bien.

7. PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Principio de la prueba

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Este ensayo se basa en el método de ELISA competitivo. Como primera etapa de

preparación, se añade zonulina biotinilada a las muestras, patrones y controles.
Posteriormente, se transfieren alícuotas de las muestras tratadas, patrones y controles y se
incuban en los pocillos de placa de microtitulación recubiertos con anticuerpos policlonales
anti-zonulina. Durante la incubación, el antígeno objetivo libre en las muestras compite con
la zonulina biotinilada para la unión de los anticuerpos policlonales anti-zonulina
inmovilizados en los pocillos de placas de microtitulación. Los componentes no unidos se
eliminan mediante una etapa de lavado. Durante una segunda etapa de incubación, la
estreptavidina marcada con peroxidasa, que se une a la zonulina biotinilada, se añade a
cada pocillo de microtitulación. Después de una etapa de lavado para eliminar los
componentes no unidos, se añade el sustrato de peroxidasa tetrametilbenzidina. Finalmente,
la reacción enzimática se termina con una solución ácida de parada. El color cambia de azul
a amarillo y la absorbancia se mide en el fotómetro a 450 nm. La intensidad del color
amarillo es inversamente proporcional a la concentración de zonulina en la muestra; Esto
significa que la concentración elevada de zonulina en la muestra reduce la concentración de
la zonulina biotinilada unida a los anticuerpos anti-zonulina inmovilizados y disminuye la
señal fotométrica. Se genera una curva de respuesta a la dosis de la unidad de absorbancia
(densidad óptica, DO a 450 nm) frente a la concentración utilizando los valores obtenidos a
partir de la norma.

Procedimiento de prueba

Antes de usar, permita que todos los reactivos y muestras lleguen a la temperatura ambiente
(15-30 °C) y mezcle bien.

Tome tantas tiras de microtitulación (PLATE) como sea necesario desde el kit. Almacene las
tiras no utilizadas en el envase cerrado de aluminio a 2-8 °C. Las tiras son estables hasta la
fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

Para los procesadores ELISA automatizados, el protocolo dado puede necesitar ser
ajustado de acuerdo a las características específicas de la plataforma automatizada
respectiva. Para más información, póngase en contacto con su proveedor o con
Immundiagnostik AG.

Se recomienda realizar las pruebas por duplicado.

1. Añadir 100 μl de los patrones, controles o muestras preparados en cada pocillo.

Cubrir las tiras e incubar durante 1 hora agitando en un agitador horizontal a 350
2.
rpm con una órbita de 2 mm a temperatura ambiente (15-30 °C).
Decantar el contenido de cada pozo. Lavar la placa de microtitulación 5 veces con
250 μl de buffer de lavado. Después de la etapa de lavado final, la placa de
3.
microtitulación invertida debe ser golpeada firmemente sobre papel absorbente para
eliminar el exceso de solución.
4. Añadir 100 μl de conjugado (CONJ diluido) en cada pocillo.
Cubrir las tiras e incubar durante 1 hora agitando en un agitador horizontal a 350
5.
rpm con una órbita de 2 mm a temperatura ambiente (15-30 °C).
Decantar el contenido de cada pozo. Lavar la placa de microtitulación 5 veces con
6.
250 μl de buffer de lavado. Después de la etapa de lavado final, la placa de

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microtitulación invertida debe ser golpeada firmemente sobre papel absorbente para
eliminar el exceso de solución.
7. Añadir 100 μl de sustrato TMB (SUB) en cada pocillo
8. Incubar durante 10-20 minutos a temperatura ambiente (15-30 °C) *.
Añadir 100 μl de solución de parada ELISA (STOP) y mezclar brevemente en el
9.
lector ELISA usando la opción de agitación.
Determinar la absorción inmediatamente con un lector de ELISA a 450 nm frente
a 620 nm (o 690 nm) como referencia. Si no hay longitud de onda de referencia
10. disponible, lea sólo a 450 nm. Si la extinción de una muestra o una norma supera el
rango del fotómetro, la absorción debe medirse inmediatamente a 405 nm frente a
620 nm como referencia.
* La intensidad del cambio de color es sensible a la temperatura. Se recomienda observar el
cambio de color y detener la reacción tras una buena diferenciación.

8. RESULTADOS
Los siguientes algoritmos se pueden utilizar alternativamente para calcular los resultados.
Se recomienda utilizar el "algoritmo de 4 parámetros".

1. Algoritmo de 4 parámetros

Se recomienda utilizar una ordenada lineal para la densidad óptica y una abscisa logarítmica
para la concentración. Cuando se utiliza una abscisa logarítmica, se debe especificar el
patrón cero con un valor menor que 1 (por ejemplo, 0,001).

2. Cálculo punto a punto

Se recomienda una ordenada lineal para la densidad óptica y una abscisa lineal para la
concentración.

3. Algoritmo de spline

Se recomienda una ordenada lineal para la densidad óptica y una abscisa lineal para la
concentración.

La plausibilidad de los valores duplicados debe examinarse antes de la evaluación

automática de los resultados. Si esta opción no está disponible con el programa utilizado, los
valores duplicados deben evaluarse manualmente.

Muestras de heces

Los niveles de zonulina obtenidos de las muestras de heces deben multiplicarse con el
factor de dilución de 50.

En caso de que se utilice otro factor de dilución, multiplique el resultado obtenido con el
factor de dilución utilizado.

9. LIMITACIONES

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Las muestras con concentraciones por encima del rango de medición (ver definición más
adelante) deben ser diluidas y re-ensayadas. Por favor considere esta mayor dilución al
calcular los resultados.

Las muestras con concentraciones inferiores al rango de medición (véase la definición a

continuación) no pueden cuantificarse claramente.

El límite superior del rango de medición se puede calcular como:

Mayor concentración de la curva estándar × factor de dilución de la muestra a utilizar

El límite inferior del rango de medición se puede calcular como:

LoB × factor de dilución de la muestra a utilizar

10. CONTROL DE CALIDAD

Immundiagnostik recomienda el uso de controles externos para el control de calidad interno,
si es posible.

Las muestras de control deben ser analizadas con cada prueba. Los resultados, generados
a partir del análisis de muestras de control, deben ser evaluados para su aceptabilidad
usando métodos estadísticos apropiados. Los resultados para las muestras de pacientes
pueden no ser válidos si dentro del mismo ensayo uno o más valores de la muestra de
control de calidad están fuera de los límites aceptables.

Rango de referencia

Immundiagnostik basándose en estudios de muestras de heces de personas aparentemente

sanas (n = 40), se estimó un valor medio de 61 ng/ml (± 46 ng/ml).

Recomendamos a cada laboratorio establecer su propio rango de referencia.

11. CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO

Precisión y reproducibilidad

Intra-Ensayo (n = 24)

Muestra Zonulin [ng/ml] VK [%]

1 117.7 6.2
2 130.9 5.9
3 38.3 3.2

Inter-Ensayo (n=16)

Muestra Zonulin [ng/ml] VK [%]

1 36.4 12.7

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2 162.9 13.9

Sensibilidad analítica

Límite de blanco, LoB 0,105 ng/ml

Límite de detección, LoD 0,241 ng/ml

Límite de cuantificación, LoQ 0.241 ng/ml

La evaluación se realizó de acuerdo con el CLSI directriz EP-17-A2.

Recuperación de la dilución

Se diluyeron y analizaron dos muestras de heces. Los resultados se muestran a

continuación (n = 2):

ZONULIN ZONULIN MEDIDA

MUESTRA DILUCION
ESPERADA [ng/ml] [ng/ml]
1:50 58.5
1:100 29.3 20.3
A
1:200 14.6 10.6
1:400 7.3 6.7
1:50 169
1:100 84.5 80
B
1:200 42.3 42.5
1:400 21.1 24.1

12. PRECAUCIONES
• Todos los reactivos del paquete del kit son sólo para uso diagnóstico in vitro.

• Los materiales humanos utilizados en los componentes del kit fueron probados y resultaron
negativos para el VIH, Hepatitis B y Hepatitis C. Sin embargo, por razones de seguridad,
todos los componentes del kit deben ser tratados como potencialmente infecciosos.

• Los reactivos del kit contienen azida sódica o Proclin como bactericidas. Azida de sodio y
Proclin son tóxicos. Los sustratos para las reacciones enzimáticas de color son tóxicos y
carcinógenos. Evite el contacto con la piel o las membranas mucosas.

• La solución de parada consiste en ácido sulfúrico diluido, un ácido fuerte. Aunque diluido,
todavía debe ser manejado con cuidado. Puede causar quemaduras y debe manejarse con
guantes, protección para los ojos y ropa protectora apropiada. Cualquier derrame debe ser
limpiado inmediatamente con abundante cantidad de agua. No respirar el vapor y evitar la
inhalación.

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13. CONSEJOS TÉCNICOS

• No intercambie números de lote diferentes de ningún componente del kit dentro del mismo
ensayo. Además, se recomienda no ensamblar los pocillos de diferentes placas de
microtitulación para su análisis.

• Las muestras de control deben analizarse con cada prueba.

• Los reactivos no deben usarse más allá de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta
del kit.

• La solución del sustrato debe permanecer incolora hasta su uso.

• Para asegurar resultados precisos, es necesario adecuada adherencia de selladores de

placa durante las etapas de incubación.

• Evite la formación de espuma al mezclar los reactivos.

• No mezcle tapas y tapones de diferentes reactivos.

• El ensayo debe realizarse siempre de acuerdo con el manual adjunto.

14. NOTAS GENERALES SOBRE EL PROCEDIMIENTO DE ENSAYO

Y ENSAYO
• Este ensayo se produjo y se distribuyó de acuerdo con las directrices de IVD de la
Directiva 98/79/CE.

• Se deben seguir las directrices para los laboratorios médicos.

• IDK® es una marca comercial de Immundiagnostik AG.

• El tiempo de incubación, la temperatura de incubación y los volúmenes de pipeteo de los

componentes son definidos por el fabricante. Cualquier variación del procedimiento de
prueba, que no esté coordinada con el fabricante, puede influir en los resultados del ensayo.
Por lo tanto, Immundiagnostik AG no se hace responsable de los daños resultantes de un
uso incorrecto.

• Los reclamaciones de garantía y las quejas relativas a deficiencias deben registrarse

dentro de los 14 días posteriores a la recepción del producto. El producto debe ser enviado
a Immundiagnostik AG junto con una queja por escrito.

15. REFERENCIAS
1. Fasano, A, T No, W Wang, S Uzzau, I Berti, A Tommasini, y S E Goldblum. 2000.
"Zonulina, un modulador recientemente descubierto de la permeabilidad intestinal y su
expresión en la enfermedad celíaca." Lancet 355 (9214) (29 de abril): 1518-9. Doi:
10.1016 / S0140-6736 (00) 02169-3.

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2. Wang, W, S Uzzau, S E Goldblum y A Fasano. 2000. "Zonulina Humana, un Modulador

Potencial de Juntas Estrechas Intestinales." Journal of Cell Science 113 Pt 24
(December): 4435-40.

3. Fasano, A. 2001. "Zonulina Intestinal: Sesame Abierto!" Gut 49 (2) (Agosto): 159-62.

4. Freemark, Michael y Lynne L Levitsky. 2003. "Evaluación de la enfermedad celíaca en

niños con diabetes tipo 1: dos puntos de vista de la controversia". Diabetes Care 26 (6)
(junio): 1932-9.

5. Lazzarotto, Francesca, Daniela Basso, Mario Plebani, Alessandro Moscon, Renato

Zanchetta y Corrado Betterle. 2003. "Enfermedad Celíaca y Diabetes Tipo 1." Diabetes
Care 26 (1) (January): 248-9.

6. Watts, Tammara, Irene Berti, Anna Sapone, Tania Gerarduzzi, Tarcisio No, Ronald Zielke
y Alessio Fasano. 2005. "El papel del modulador de la unión estrecha intestinal Zonulin
en la patogénesis de la diabetes tipo I en las ratas diabéticas propensas a BB".
Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América
102 (8) (22 de febrero): 2916- 21. Doi: 10.1073 / pnas.0500178102.

7. De Magistris, María Teresa. 2006. "Zonula Occludens Toxin as New Promising Adjuvant
for Mucosal Vaccines." Vacuna 24 Supl 2 (12 de abril): S2-60-1.

8. Sapone, Anna, Laura de Magistris, Michelle Pietzak, María G Clemente, Amit Tripathi,
Francesco Cucca, Rosanna Lampis, et al. 2006. "La regulación positiva de la zonulina
está asociada con una mayor permeabilidad intestinal en sujetos con diabetes tipo 1 y
sus familiares". Diabetes 55 (5) (1 de mayo): 1443-9. Doi: 55/5/1443 [pii].

9. Thomas, Karen E, Anna Sapone, Alessio Fasano y Stefanie N Vogel. 2006. "La
estimulación de la gliadina de la expresión génica inflamatoria de los macrófagos murinos
y la permeabilidad intestinal dependen de MyD88: papel de la respuesta inmune innata
en la enfermedad celíaca" Journal of Immunology (Baltimore, Maryland, 1950) 176 (4) (15
de febrero) 2512 - 21.

Símbolos usados:

Límites de temperatura Número de Catálogo

Dispositivo Médico de Para ser usado con

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