PROTOCOLO EXPERIMENTAL PARA IDENTIFICAR EL

INHIBIDOR DE LA ALFA-AMILASA
Materiales:

 Yodo metálico al 1% disuelto en Etanol

 Solución de Almidón al 0.5%, preparado en buffer α-amilasa y hervido durante 5
minutos. Se pre-temperó a 37ºC (o 30ºC, según el ensayo) antes de utilizar.
 Buffer α-amilasa: Fosfato de Sodio 0.02 M, Cloruro de Sodio 0.006 M, pH 6.9
(Para 200 ml, pesar 0.567 g de NaHPO4 y 0.07 g de NaCl, ajustar a pH con HCl)
 Enzima o Saliva, diluida en buffer α-amilasa

Procedimientos realizados:

1. Determinación de la actividad enzimática

En dos pocillos se agregan 50 µl de solución de almidón, a uno de ellos se le agregan 5
µl de saliva (control positivo) y al otro 5 µl de buffer α-amilasa (control negativo). Los
pocillos se incuban por 30 minutos a 37ºC y luego de este tiempo se agregan 30 µl de
solución de yodo.
El almidón forma un complejo con el yodo, el cual al ser hidrolizado pierde esta
capacidad. Por lo tanto la formación de este complejo refleja actividad enzimática. Si
no existe actividad enzimática la solución de yodo se mantendrá de un color amarillo.

C. Negativo C. Positivo

2. Determinación de la cantidad mínima de enzima requerida.

A fin de ahorrar enzima en los ensayos posteriores, se realizó una titulación de la
cantidad de enzima que se requiere para obtener digestión total de almidón. Para esto se
realizan diluciones seriadas de la enzima en buffer α-amilasa en un volumen de 50 µl
finales. A las diluciones se les agregan 50 µl de solución de almidón. Las diluciones
indicadas en la figura se calcularon en este volumen de 100 µl finales. El protocolo se
continúa de acuerdo a lo antes descrito. Adicionalmente se utilizó saliva diluida.

1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 1/2560 1/5120 1/10240 1/20480 0

-Amilasa

Saliva

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 La figura muestra que ya se observa digestión con la dilución 1/320, por lo tanto y a fin
de asegurar este proceso, en los ensayos posteriores se utilizó la dilución menor
siguiente, es decir, 1 en 160.

3. Detección de extractos bloqueadores de la actividad -amilasa.

Se evaluaron los extractos presentes en la caja “Elvira 1”. En pocillos de placa de 96
micropocillos se agregaron 50 µl de almidón mas 50 µl de cada extracto.
Posteriormente se agregó la dilución de la enzima (en buffer α-amilasa) en un volumen
de 50 µl. Luego de una incubación a 37º durante 30 minutos se agragan 30 µl de
solución de yodo.
+ - 1462 1470 1441 1469 1447 915 1423 453 1132 1133

1490 1604 1466 1448 1489 1679 1488 1475 1631 1162 1468 1683

1602 1477 1498 1632 239 1124 1692 1476 1635 1456 1455 1618

1094 1641 42 1479 1616 1459 1677 164 891 1494 235 912

1698 1463 1481 1118 1474 1621 1485 1644 1640 1693 1673 1458

1453 1438 1651 1496 1668 818 1415 1136 1484 1450 1622 1909

1460 1487 1625 1467 1697 1699 1615 781 953 1451 1452 1634

960 1425 1658 1650 1642 1492 1674 1633 945 1134 1065 1465

Los resultados muestran que se obtuvo inhibición de la actividad α-amilasa en 13

extractos: 1447, 915, 1162, 1094, 891, 912, 818, 1909, 781, 953, 960, 945 y 1065.

El experimento se repitió en las mismas condiciones utilizando los extractos inhibidores

y uno de los extractos control. Además, para determinar si estos extractos actuarían en
la digestión, se utilizó saliva como control.

+ - 1447 915 1162 1094 891 912 818 1909 781 953

-Amilasa 960 945 1065 1641

+ - 1447 915 1162 1094 891 912 818 1909 781 953

Saliva 960 945 1065 1641

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 En la figura se observa que la inhibición de la actividad enzimática mostrada por los
extractos se reproduce. Además estos extractos son capaces de inhibir en la misma
proporción la enzima presente en saliva humana.
4. Actividad de los extractos bloqueadores de la actividad -amilasa después de un pulso
de alta temperatura.
Con el fin de evaluar la estabilidad térmica de los extractos, se realizó el protocolo
anterior utilizando extractos previamente hervidos a 100ºC en un baño seco durante 30
minutos. Además la preincubación del almidón y la incubación de la placa antes de la
adición de la solución de yodo se realizaron a 30ºC.
Se probaron sólo algunos extractos, debido a que la muestra de los otros se acabó.
+ - 818 915 1447 912 1909 1162 953 1094 891

-Amilasa

Saliva

Las flechas muestran los extractos que presentan una inhibición de la actividad
enzimática de aproximadamente un 50% (Muestras 915 y 1094). Estas cepas se
almacenaron a –80ºC para su posterior utilización.

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