Obstáculo Efecto de la Actividad Antimicrobiana Alcanzado por

Tiempo Diferencial Liberando Nisina y Quitosano Hidrolizados de

Celulosa Bacteriana
Hui-Ling Hsiao, Shih-Bin Lin, Li-Chen Chen, and Hui-Huang Chen

Resumen: Se investigó el efecto antimicrobiano combinado de nisina y quitosano hidrolizados (CHS) mediante la regulación
de la orden de reacción antimicrobiana de sustancias debido a la diferencia de velocidad de liberación de
hidroxipropilmetilcelulosa-modificado celulosa bacteriana (HBC). La concentración mínima inhibitoria de la nisina frente a
Staphylococcus aureus y la de CHs contra Escherichia coli eran 6 IU y 200 µg / ml, respectivamente. Salto de obstáculos y
efectos aditivos antimicrobianos en las pruebas eran observó cuando se utilizó la nisina 6 h antes del tratamiento CH contra
S. aureus; Se observaron efectos similares cuando era CH utilizado antes del tratamiento nisina frente a E. coli. Al mismo
tiempo el tratamiento combinado de la nisina y la CHS exhibió la baja efecto antimicrobiano. a continuación, HBC fue
seleccionado como el vehículo para la liberación controlada de nisina y CHS. Una inhibición del 90% en el crecimiento de S.
aureus y E. coli se logró cuando /-CH-que contiene ml HBC y 62,5 g 30 que contiene IU-nisina HBC se usaron
simultáneamente. La liberación controlada de la nisina y CHs utilizando HBC minimiza la interacción entre nisina y CHs así
como el aumento del número de objetivos microbianos.

Palabras clave: antimicrobiano, celulosa bacteriana, quitosano, obstáculo, la nisina

asimétrica bicapa lipídica en proteínas y constituye una

Introducción
Varios productos antimicrobianos naturales se pueden utilizar
para matar las bacterias sin recurrir a productos químicos y
productos sintéticos. La nisina (Aly y otros 2011; Ndoti-nembe
y otros 2015), quitosano (Chen y otros, 2010), lisozimas
(Gucbilmez y otros ácidos 2007), orgánicos y fenoles (Pajohi y
otros 2011) tienen han investigado y utilizado en los productos
alimenticios para reemplazar artificiales conservantes.
La nisina, una bacteriocina bien estudiado, muestra una alta
actividad antibacteriana contra [G (+)] bacterias Gram-
positivas (Abee y otros 1994; Aly y otros 2011; Tong y otros
2014A). Se puede permeabilizar la membrana citoplasmática
mediante la interacción iónica con negativamente polímeros de
la pared celular cargados, tales como ácido teicoico (TA),
teicurónico ácido, y el ácido lipoteicoico, inhibiendo de este
modo el transporte de los aminoácidos y la liberación de los
aminoácidos acumulados, K +, y el ATP de las células y
vesículas de la membrana de bacterias (Kordel y Sahl 1986;
Sahl y otros 1987; Liu y otros 2015). El desglose concomitante
de la membrana es probable cesar la biosíntesis. Además, la
lisis de las células tratadas se produce rápidamente e inicia
una cantidad sustancial de hidrólisis pared causado por la
sustitución o la activación de autolisina con nisina (Bierbaum y
Sahl 1987; Tong y otros 2014A). La acción in vitro de la nisina
en liposomas y proteoliposomas es dependiente de fosfolípido
composición (Gao y otros, 1991; Garcera y otros 1993;
Breukink y de Kruijff 2006).
Bacterias Gram-negativas son menos sensibles a la nisina en
comparación con bacterias gramos-positivos. La membrana
externa (OM) de G (-) bacterias actúa como una barrera a la
nisina y evita que la nisina de llegar a la membrana
citoplásmica. La OM de estas bacterias está compuesto por
MS Enviado 20151911 11/17/2015, 03/07/2016 Aceptado. Los
autores son con Departamento de Ciencia de los Alimentos,
Universidad Nacional de Ilan., 1 Sec. 1, Shen Nung Rd., Ilan
ciudad, Taiwán, R.O.C. Dirija sus preguntas al autor Chen (E-
mail: hhchen@niu.edu.tw)
superficie hidrófila. Como resultado, el lipopolisacárido hidrófilo
Capa de proporcionar barrera de penetración hacia moléculas
hidrofóbicas como, por ejemplo, la nisina (Stevens y otros,
1992; Tong y otros 2014b). Por el contrario, debido a la
superficie cargada negativamente de más la pared celular, G
(-) las bacterias son más susceptibles a quitosano de G (+)
bacterias (Chung y otros, 2004; Lin y otros 2009). Sin embargo,
el mecanismo de la actividad antimicrobiana no es
completamente dilucidado. Se han propuesto varias hipótesis
para explicar este mecanismo, tal como la destrucción de la
membrana o la interrupción (Kumar y otros, 2007; Tang y otros,
2010), la unión al ADN (Goy y otros 2009), y el bloque
nutricional (Kumar y otros 2007; Raafat y otros 2008). Además,
la actividad antibacteriana de quitosano puede ser afectada
por su tamaño molecular (Lin y otros 2009).
Sin embargo, una alta dosis y limitados objetivos son
antimicrobianos los problemas para el tratamiento utilizando
una sola sustancia antimicrobiana (Zahran 2015). Cai y otros
(2010) informaron que la quitosano-combinación de nisina en
una relación en peso dada (0,05%: 0,005%) exhibida actividad
antimicrobiana contra las bacterias deseable G (+)
(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, y B.
stearothermophilus), G (-) bacterias (E. coli, Salmonella
enteritidis, y Proteus vulgaris), y los hongos (Fusarium
oxysporum), y las dosis de antimicrobiano combinado
sustancias fueron inferiores a la suma de una sola sustancia
antimicrobiana. Este hallazgo revela que la combinación de
quitosano-nisina reducción de las dosis de sustancias
antimicrobianas y ampliado la gama de objetivos microbianos.
Durante la última década, el interés en el desarrollo y uso
películas de activos de origen biológico, que se caracterizan
por antimicrobiana y actividades antifúngicas para mejorar la
conservación de los alimentos y reducir el uso de conservantes
químicos, ha ido en aumento (Aider 2010). xylinus
Gluconacetobacter produce una celulosa extracelular bien
definido de malla llamado celulosa bacteriana (BC), una escala
nanométrica y útil biomaterial con biocompatibilidad, alta
capacidad de retención de agua, y la resistencia mecánica
(Ross y otros 1991). Se puede utilizar en diversas
aplicaciones, incluyendo la envoltura de embutido (Nguyen y
otros 2008), y frescas almohadillas de alimentos (Guo 2013;
Yang y otros 2014). Huang y otros (2011) añaden
hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en un medio de cultivo de
fermentación BC para interrumpir el en formación in situ de la
estructura de BC y creó una HPMC-modificado BC (HBC).
HBC mostró menor cristalinidad de BC, así como lo hizo
mejora en la absorción de agua y una pequeña molécula
(Huang y otros 2011) y la actividad de liberación controlada
(Lin y otros, 2015). Los datos preliminares revelaron que la
combinación de nisina y CH a pH neutro podría potencialmente
resultar en la aparición de precipitación y, por lo tanto, se
deterioran sus efectos antimicrobianos (Guo, 2013). En otras
palabras, el antagonismo entre nisina y CH podría ocurrir en
ciertas condiciones de combinación. Para maximizar el efecto
obstáculo en el uso combinado de la nisina y el quitosano
hidrolizados (CHS) por su actividad antimicrobiana, diversos
niveles de concentración y órdenes de adición de estos
agentes en diferentes intervalos de tiempo fueron intentado en
este estudio. Además, un estudio de prueba de concepto fue
llevado a cabo para desarrollar y utilizar películas BC
contienen nisina o CHS para controlar la liberación de la nisina
y CHs y lograr un deseable combinado efecto antimicrobiano.
Materiales y Métodos
Organismos y condiciones de crecimiento
Las cepas bacterianas utilizadas fueron adquiridas de la
Bioresource Recogida y Centro de Investigación (CRCB) de la
Industria Alimenticia Instituto de Investigación y Desarrollo
(Hsinchu, Taiwán). Trichoderma viride (BCRC 32054) se
cultivó en la dextrosa de patata agar (Sigma-Aldrich Co. Ltd.,
St. Louis, Missouri, EE.UU.) a temperatura ambiente la
temperatura durante 7 días para inducir la actividad quitinasa.
S. aureus (BCRC 10451, 10780, y 10781) y E. coli (BCRC
10314 y 10675) se cultivaron en caldo de triptona de soja y
caldo nutriente, respectivamente, a 37 ° C durante 16 h para
llegar a la fase estacionaria (aproximadamente 5 × 10 9 UFC /
ml) para las pruebas antimicrobianas. G. xylinus (BCRC
12335) se cultivó en caldo de manitol a 30 ° C para preparar
HBC.
Solución de Nisina
Según Delves-Broughton (1990), cierta cantidad de nisina (2,5
× 104 UI / g, PM = 3,51 kDa, Sigma-Aldrich) se disolvió en una
solución esterilizada 0,02 N de HCl con pH 2,0 para alcanzar
el requisito de concentración para los experimentos de
antimicrobianos.
HCs
Polvo de quitosano (Chi, DD 93%, 297 kDa, Ying Huwa Co.,
Kaohsiung, Taiwán) se disolvió en 100 mM de solución tampón
acético (PH 4,0) para producir 1% (v w /) solución de quitosano.
El crudo enzima quitinasa se preparó mediante la inducción de
T. viride en un chitincontaining medio (Lin y otros, 2009). La
solución de quitosano fue hidrolizado con la enzima quitinasa
crudo a 42 ° C en un baño de agua durante 24 h y luego se
hierve durante 10 min para detener la enzimática reacción para
generar solución CH. El peso molecular de CHs fue de
aproximadamente 13,5 kDa según la ecuación de Mark-
Houwink-Sakurada (MHS) determinando su intrínseca
viscosidad (Lin y otros, 2009).
Concentración mínima inhibitoria
- concentración mínima inhibitoria de la CAM y la nisina.
De acuerdo con Chen y otros (2010), 100µl de cada 10 5 UFC /
mL probado microorganismos se mezcló con 100 l de
esterilizada solución de CH (160 µg / ml) o nisina (150 UI), que
eran previamente 2 veces diluido en serie con un medio
correspondiente tamponada con-mM 40 tampón fosfato (pH
7,0) a la designada concentración. Una mezcla
correspondiente sin bacterias se utilizó como control. A
continuación, se usó la mezcla en cada pocillo de una
microplaca de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C durante 24
h. El crecimiento de los microorganismos ensayados se
controló a OD590 cada 6 h mediante el uso de un lector de
ELISA (Biolog Inc., Hayward, Calif., ESTADOS UNIDOS.).
Todos los tipos de tratamiento se llevaron a cabo 5 veces. El
mínimo concentración inhibitoria (MIC) se definió como la más
baja concentración de las sustancias antimicrobianas
requerida para inhibir el crecimiento bacteriano durante 24 h.
- Además de temporización y el orden de la CAM y la nisina
para la combinación pruebas. Para evaluar el momento de
la adición de las antimicrobianas sustancias en el tratamiento
de combinación, sustancias antimicrobianas eran 2 veces
diluciones seriadas del MIC, 1 sustancias antimicrobianas (50
l) se añadieron en los ensayos antimicrobianos
secuencialmente a un intervalo de tiempo de 0 a 6 h antes de
que otra sustancia antimicrobiana se utilizó (50 l). Los
microorganismos ensayados se incubaron a 37 ° C y un control
en OD590 usando un lector de ELISA. El más tiempo Además
satisfactorio determinada se utilizó para realizar las pruebas de
combinación posteriores sobre el orden de adición de la CHS
y la nisina, que eran también de 2 veces diluciones seriadas
del MIC, eran añadido en microplacas simultáneamente o de
acuerdo con el deseado intervalo. Las pruebas
antimicrobianas combinadas fueron diseñadas como los
siguientes:
N → C: la nisina se añadió en el h prueba de 6 antes de la
adición de CH
N+C: la nisina y CH se añadieron en la prueba de forma
simultánea
C → N: CH se añadió en el h prueba de 6 antes de la adición
de nisina
- Evaluación del efecto antimicrobiano combinado. la
fraccional concentración inhibitoria (FIC) se define como la
MIC de la agente en combinación dividida por la MIC del
agente utilizado solo. ¿Los resultados fueron considerados
como una sinergia si el índice FIC de la combinación es? 0,5,
aditivo cuando se fue de 0,5 <índice FIC <1, sustractiva cuando
1 <índice FIC> 4 o antagonismo para el índice FIC > 4 (Duarte
y otros, 2012).
Pruebas antimicrobianas combinadas con HBC
-Preparación HBC. G. xylinus se enumeró utilizando una
placa contar técnica con un medio de agar manitol (Huang y
otros 2010). Un medio de jugo de coco modificado que
contiene 0,2% ácido acético y 10 ° Brix contenido de sólidos
solubles ajustado con sacarosa se inoculó con el cultivo G.
xylinum (10%, v / v, alrededor 5 × 108 UFC) y cultivados de
forma estática en frascos de 250 ml a 30 ° C por 14 días.
HPMC (300 mPa · s para la solución de gel de 2% a 20 ° C con
metoxilo y de grupo hidroxipropoxilo sustituciones de un 23%
y 10%, respectivamente) comprado de Toong Yeuan
Enterprise Co. Ltd. (Taipei, Taiwán) y luego se introdujo en la
fermentación en situ a 0,75%. Para eliminar las impurezas,
tales como bacterias y otras sustancias que interfieren, torta
de celulosa flotando en el cultivo fue de recogido y hervido en
NaOH 0,5 N durante 10 min, inmerso en 0,5 NaOH N durante
24 h a temperatura ambiente, y se enjuagó con agua
desionizada agua para lograr un pH neutro.
- Pruebas antimicrobianas de HBC que contiene nisina o
CHs. HBC con un 1 cm de diámetro, 0,2 cm de espesor de
película círculo era se centrifugaron (8.000 x g) durante 10 min
y se esterilizó a 120 ° C durante 15 minutos. HBC esterilizada
se sumergió en una concentración específica de nisina
cuantificados y solución de CH durante la noche a 4 ° C para
obtener contenido de agua del 99% antimicrobiano HBC,
llamado NBC y CBC, respectivamente. Para simplificar la
regulación del tiempo de reacción de la nisina y CHS, CBC y
NBC, que contiene cierta cantidad de nisina o CHS, de
antimicrobiano HBC se añadieron simultáneamente en 1 ml de
la solución de microorganismo ensayado (10 3 UFC / ml). el
combinado efecto antimicrobiano fue comparado con la NBC
individuo o CBC, y la combinación de nisina y CBC. El
microorganismo probado tipo de solución se incubó a 37 ° C
durante 24 h, y la inhibición porcentaje (PI (%) = [(UFCcontrol -
UFCmuestra) / UFCcontrol ×100%] Se evaluó.

Exploración observación microscopía electrónica

HBC, NBC, y CBC se liofilizaron para formar trozos pequeños.
El specimenswere secado montado en tacos de aluminio y
recubierto con una aleación de oro / paladio en condiciones de
alto vacío. Las muestras fueron examinadas utilizando un Figura 1-Los efectos de inhibición combinadas de nisina tratamiento
microscopio Tescan Vega TS5136MM (Sro Tescan, Brno, (A) (3 UI) con intervalo de tiempo antes de CH (6,25 µg / ml) de
República Checa) para observar la microestructura de rotura tratamiento contra S. aureus (BCRC 10780) y CH (B) (100 µg / ml) de
de superficies. tratamiento con un intervalo de tiempo antes el tratamiento de la nisina
(6,25 UI) contra E. coli (BCRC 10675). El control Además representado
ninguna sustancia antimicrobiana.
Análisis estadístico
Los valores medios y las desviaciones estándar se calcularon.
Tabla 1-Los valores de CIM de nisina y CH 3 contra S.
Datos Se analizó estadísticamente con el programa SPSS.
aureus cepas y 2 cepas de E. coli.
Cuando el análisis de la varianza (ANOVA) reveló un efecto
significativo (P <0,05), medios de datos se compararon
mediante una prueba de diferencia mínima significativa (DMS).

Resultados y discusión

La actividad antimicrobiana de la nisina y la CHs
El crecimiento de S. aureus se inhibió marcadamente por la
nisina, y la CMI frente a BCRC 10451, 10780, 10781 y fue
150.0, 6,0, y 10,0 IU, respectivamente. La eficiencia de la
inhibición de la nisina fue menor frente a E. coli que contra S.
aureus (Tabla 1). En el propuesto mecanismo antibacteriano,
la nisina se involucra los compuestos intermedios de la pared
celular lípidos II y pirofosfato de undecaprenilo en estables
complejos de detergente insolubles, que son retirados de la
célula biosíntesis de la pared, y los resultados en la formación
de poros y la pared celular inhibición (Bonev y otros, 2004). Sin
embargo, con una celda diferente diseño de la pared, las
bacterias Gram-negativas no son generalmente sensibles a las
nisina. La membrana externa de las bacterias gram-negativas,
actuando como barrera de permeabilidad para la célula, puede
prevenir la molécula de nisina de llegar a la membrana
citoplasmática (Stevens y otros 1991). Esto es probablemente
la razón por E. coli es mucho menos sensible a la nisina de S.
aureus.
a
NI indica que no hay efecto de inhibición.
El crecimiento de E. coli se inhibió marcadamente por CHS y
el MIC de BCRC 10314 y 10675 fueron de 200 y 100 µg / ml,
respectivamente. La eficiencia de la inhibición de la CHS fue
menor frente a S. aureus que contra E. coli (Tabla 1).
Resultados similares fueron observados por Lin y otros (2009)
en la que llegaron a la conclusión de que la antibacteriano la
actividad de quitosano de bajo peso molecular (CBPM) fue
principalmente causada por la diferencia en el potencial zeta
entre la superficie de partículas CBPM y las bacterias. En su
estudio se encontró E. coli poseer mayor carga negativa en su
superficie celular de S. aureus, y por lo tanto, era más
susceptible a CH. En adición, la naturaleza de las
nanopartículas de CBPM, con un tamaño molecular adecuado,
puede aumentar la actividad antibacteriana de CBPM. Por lo
tanto, la inhibición del crecimiento bacteriano por CBPM puede
implicar superficie efectos y, en cierta medida, los efectos de
permeación (Chen y otros 2010).

Figura 2-Los efectos de inhibición combinadas de nisina tratados
durante 6 h antes al tratamiento CH contra (A) S. aureus (BCRC
10780) y (B) de E. coli (BCRC 10675).
Debido BCRC 10780 es más sensible a la nisina, pero menos
sensibles a CHS y, a la inversa, BCRC 10675 es más sensible
a la CHS, pero menos sensible a la nisina, BCRC 10780 y
10675 representados BCRC G (+) y G (-) bacterias,
respectivamente, y se seleccionaron en el ensayos de
actividad de combinación antimicrobianos posteriores.
Además momento de la CAM y la nisina en las pruebas
combinadas
Para maximizar la actividad antimicrobiana cooperante, el
combinado efecto y orden de adición de los dos agentes en un
antimicrobiano Se estudió prueba. tiempo antimicrobiano
resultados del estudio mostraron curso que el orden de adición
y el intervalo de tiempo afectaron la inhibición eficacia contra
S. aureus y el crecimiento de E. coli. Lo mas obvio Se observó
un efecto de inhibición cuando un intervalo de tiempo de 6 h
era utilizado (Figura 1).
De acuerdo con los resultados del estudio del curso del tiempo,
el retraso y logarítmica fases de BCRC 10780 fueron de 0 a 4
y 5 a 12 h, respectivamente. Por otra parte, el GAL y
logarítmicas fases de BCRC 10675 fueron de 0 a 3 y 4 a 9 h,
respectivamente (datos no cotizados). La inhibición de la
BCRC 10780 con 3 IU (50% MIC) de la nisina en una
(6,25µg/ml) de tratamiento intervalo de tiempo de 2 a 4 h antes
de CH hizo no muestran un retraso de 24 horas como MIC
definida excepto a 6 h intervalo de tiempo (Figura 1A).
Comportamientos similares se obtuvieron en contra BCRC
10675 cuando se añadieron CHS (100µg / ml) antes de la
nisina (6,25 IU) tratamiento (Figura 1B). Los efectos que
socavan en combinación prueba observa en intervalo de
tiempo más corto (2-4 h) podría ser debido a la interacción que
se produce entre la nisina y CH, donde NH3+ de CHs interactuó
con el grupo con carga negativa de la nisina (Cai y otros 2010),
y podría debilitar el antimicrobiano combinado actividad
(Pranoto y otros 2005). El efecto de sustracción podría
reducirse prolongando el intervalo de tiempo de adición.
Durante el intervalo de tiempo antes de la adición de la
segunda sustancia antimicrobiana, las células, en conjunción
con la primera sustancia antimicrobiana, requieren unas pocas
horas para aclimatarse a la ambiente austero. Esta condición
es propicio para acelerar muerte bacteriana y reducir la
capacidad de multiplicación bacteriana. Además, las células 6-
h-cultivadas alcanzaron la etapa inicial de la logarítmica fase,
donde se dividen para la replicación y, por lo tanto, eran más
vulnerables a morir a manos de la segunda antimicrobiana
sustancia. Esta condición antimicrobiana combinada puede
proporcionar una efecto barrera para prevenir el crecimiento
de microorganismos (McMeekin y otros, 2000). El intervalo de
tiempo de 6 h se utilizó en la siguiente pruebas antimicrobianos
combinados.
Para la adición de nisina y la CHS en antimicrobiana
combinada pruebas
Los efectos inhibidores de 3 UI (50% MIC) nisina para 6 h antes
6 µg / ml CHS (N → C) se utilizaron contra S. aureus (BCRC
10780) fueron similares a los de 6 UI (100% MIC) nisina (Figura
2A). la daño celular resultante de ataque nisina puede facilitar
la liberación de materiales celulares y también facilitan CH
entrada, lo que puede dar lugar a la unión de CH a ADN y
detener la transcripción del mRNA (Kumar y otros 2007). Estos
fenómenos aumentaron la tasa de muerte celular más rápido
que el daño de la pared celular hicieron por nisina solamente.
En general, el tratamiento de nisina, seguido de tratamiento
CH (N → C) frente a S. aureus exhibido cañizo y los efectos
sinérgicos casi porque el valor de FIC era cerca de 0,5 (Tabla
2), así como la reducción de la cantidad de nisina y CHs utiliza.
Sin embargo, el tratamiento N → C mostró un efecto
sustractivo contra E. coli. La actividad inhibidora frente a E. coli
en combinación hace necesaria una mayor cantidad de CHS
(400 µg / mL) y fue mayor que el de solo CH tratamiento (Figura
2B). de la pared celular de E. coli, equipado con una membrana
externa, podría mantener permanencia nisina en la superficie
celular y por lo tanto disminuir la adsorción de CH a la celda de
superficie (Liu y otros, 2015). Se observó un efecto de
sustracción de nisina y CH combinado tratamiento (N + C)
contra S. aureus (Tabla 2 y Figura 3A). La actividad
antimicrobiana de N + C fue menor que la de la nisina solo.
Esta diferencia puede ser atribuida a la carga positiva (NH 3+)
sustancias antimicrobianas generados durante la competición
para los sitios en la superficie celular y la interacción de unión
COO- en la nisina con NH3+ En los cps (Cai y otros 2010) y por
lo tanto reducida la actividad antimicrobiana. Además, de
acuerdo con su molecular pesos, CHs es mayor que la de la
nisina y podrían obstaculizar la la interacción entre la nisina y
la pared celular cuando se adsorben CHs o depositado en la
superficie de S. aureus.
Se obtuvo un efecto antimicrobiano similar para el tratamiento
N + C contra E. coli. La actividad de inhibición de
antimicrobiano combinado tratamiento fue menor que la de
CHs solo. El antimicrobiano combinado la actividad se debilitó
a medida que los niveles de adición de nisina aumento cuando
la concentración de CH fue de más de 50% MIC (100 µg / ml)
(Figura 3B).

Figura 3-Los efectos de inhibición combinadas de nisina y CH con
simultánea tratamiento contra (A) S. aureus (BCRC 10780) y (B) de E.
coli (BCRC 10675).
En el tratamiento C → N, actividad de inhibición de CHS
aunque exhiben frente a S. aureus, la actividad global, que
aumentó con el aumento concentración de nisina, no aumentó
la concentración de CH aumentado (Figura 4A). Aunque la
adsorción de CHs en células pared es importante la acción
antibacteriana contra S. aureus, que puede obstruir nisina
ejerza su efecto inhibitorio. El efecto adverso se puede evitar
mediante la mejora de la suplemento nisina.
En el tratamiento C → N contra E. coli (Figura 4B), 100 µg / ml
CHs y 6 o 13 UI de nisina tenía la actividad de inhibición similar
a la así como exhibido un efecto aditivo (Tabla 2). Se encontró
que 100 µg / ml CHs era insuficiente para inhibir
completamente E. coli crecimiento, pero eficaz cuando se
combina con 6 o 13 UI de nisina.
Sin embargo, el exceso de nisina parecía interactuar con la
CHS y reducir el efecto antimicrobiano combinado. En general,
el tratamiento N → C frente a S. aureus y el tratamiento C →
N contra E. coli exhibe efectos inhibidores deseable cuando
50% MIC de la nisina y CHs se utilizaron en antimicrobiana
combinada pruebas (Figura 5). Por lo tanto, cuando las
bacterias fueron atacados por estos sustancias a niveles de
concentración insuficiente, el crecimiento celular fue
incompleta inhibida, pero el daño causado a las células
residuales dictada hace más vulnerables a las sustancias
antimicrobianas posteriores. El efecto obstáculo se muestra en
la antimicrobiano combinado pruebas redujeron
considerablemente la dosis de sustancias antimicrobianas.
Estas pruebas combinadas no sólo podrían ser útiles contra
muchos microbios cepas, sino también minimizar los riesgos
causados al cuerpo humano y características sensación en la
boca no deseables, tales como la astringencia de quitosano
(Pranoto y otros 2005; Cai y otros 2010).
Figura 4 Los efectos de inhibición combinadas de tratamiento durante
6 h antes de la tratamiento nisina frente (A) S. aureus (BCRC 10780)
y (B) de E. coli (BCRC 10675)
El momento de la adición de sustancias antimicrobianas debe
ser precisa para evitar la interacción o unión competitiva entre
2 antimicrobiano sustancias. Sin embargo, las dificultades se
presentan con el Además de diversas sustancias
antimicrobianas dentro de un intervalo de tiempo de 6 h
durante el procesamiento de alimentos. Los siguientes
experimentos se realizado para regular el orden de reacción
antimicrobiano de la nisina CHS y de acuerdo con el diferencial
de tasas de liberación de BC informaron por Yang y otros
(2014) para obtener una deseable combinación efecto
antimicrobiano.
Controlar el tiempo de liberación en combinación con BC
BC se ha estudiado como un bioportador debido a su
nanoescala red de fibra y biocompatibilidad. Nguyen y otros
(2008) informó que la nisina podría ser liberado de BC dentro
de 6 horas. Además, Huang y otros (2011) complementan
HPMC en una BC medio de cultivo de fermentación para
interrumpir la formación in situ de la estructura antes de Cristo
y crear HBC. HBC es un candidato adecuado para
aplicaciones de liberación controlada ya que el conjunto
empaquetado reducido de tiras de celulosa en HBC pueden
aumentar el espacio disponible para difusión de las moléculas
de agua y las sustancias de bajo peso molecular, generando
un aumento de la liberación de los compuestos de las redes de
celulosa en HBC (Lin y otros, 2015). Por lo tanto, se optó por
HBC para regular la liberación y la combinación de nisina y
CHS.
Microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró imágenes de
una floja red de celulosa y huecos en HBC (Figura 6A), lo que
facilitó el movimiento de la nisina (Yang y otros, 2014).
Partículas adherido en la superficie de los haces de HBC, y el
diámetro de haz y los huecos se agrandaron cuando la nisina
fue adsorbido en la NBC (Figura 6B). CHS se encontraron
capas de dispersar en CBC (Figura 6C). Además, se
atribuyeron los cristales de sal similar observadas en la NBC a
la nisina, así como la leche en polvo descremada y cloruro de
sodio partículas, que fueron utilizados como excipientes en
este estudio para mejorar la dispersión y la solubilidad de la
nisina. A través de SEM, Xu y otros (2007) también
demostraron que las partículas adheridas en un gelano
película de goma que contiene nisina. Los haces agrandados
y huecos en NBC podría causar una adhesión débil entre la
nisina y la película de a favor de la liberación de la nisina. Por
el contrario, el quitosano es un polisacárido lineal conβ-1,4-
vínculos y es un formador de película. La CHS en capas CBC
tienen una estructura similar a la de un compuesto BC-
quitosano película (Phisalaphong y Jatupaiboon 2008). Hemos
puesto de manifiesto que CHs podría migrar a HBC y formar la
estructura de capas por entrelazamiento con los β-1,4-vínculos
de celulosa. el entrelazado estructura restringe la difusión de
la CHS y el retraso en la liberación de CHS de CBC. El estudio
preliminar sobre las tasas de liberación de la nisina y CH,
depositado en las películas de HBC, en la prueba
antimicrobiana medios fueron aproximadamente 40% y 20%
en 6 h, respectivamente (Yang y otros 2014). El diferencial de
la liberación de los comportamientos de nisina y CH en HBC
fueron luego utilizados en el siguiente estudio de los
antimicrobianos. Aunque la inhibición del crecimiento de S.
aureus (PI = casi 100%) era consigue utilizando NBC que
contiene 30 UI de nisina (Figura 7A), el crecimiento retraso fue
de menos de 24 h (PI = aproximadamente 80%) debido de
impedimento por HBC. En otras palabras, la liberación de la
nisina podría no coincide con el crecimiento de bacterias. Para
lograr inhibición similar, se requiere una concentración más
alta para sustancias antimicrobianas atado en una película
compuesta de sustancias antimicrobianas para no unidos
(Pranoto y otros 2005; Ravishankar y otros 2009). Para
mejorar la actividad antimicrobiana de NBC, la concentración
de nisina HBCwas en aumento para liberar de forma sostenible
y de forma sincrónica suficiente nisina a partir de redes de HBC
para evitar S. aureus entren la fase logarítmica. NBC que
contiene 30 UI de nisina y exhibiendo PI 80% dentro de 24 h
fue elegido para la posterior combinado pruebas
antimicrobianas.
La actividad inhibidora de la combinación de NBC (30 IU) +
CBC (Figura 7B) contra S. aureus fue más bajo que el de la
combinación de nisina (6 UI) + CBC (Figura 7C) después de 3
h de incubación. Esta diferencia podría deberse a que la se
obtuvo deseable efecto antimicrobiano combinado en una
adición de 6 h intervalo (Figura 1). Una cantidad específica de
CHS liberado de CBC interactuó con nisina liberado de NBC y
podría limitar el efecto antimicrobiano combinatoria, sobre todo
a un alto CH concentración en CBC (Pranoto y otros 2005;
Yang y otros 2014). Un efecto similar se demostró con la nisina
+ CBC combinación, a pesar de que 6 IU fue la MIC de la nisina
frente a S. aureus. Una reacción de 3-h era insuficiente para la
nisina disponible para inhibir el crecimiento de S. aureus. Sin
embargo, se obtuvo alta PI para la NBC + CBC y nisina + CBC
combinaciones después de 6 y 9 h de incubación, ya CHs
fueron liberados lentamente de CBC, resultando en una
suficiente dosis de nisina y tiempo suficiente para atacar a las
bacterias. Para CBC en 6,25, 62,5 y 625 µg / ml, PI de NBC +
CBC combinación fue del 70%, 92% y 92%, respectivamente,
después de 24 h de incubación (Figura 7B), que eran más altos
que los de la combinación de nisina CBC + (56%, 66% y 90%,
respectivamente, Figura 7C). Estas diferencias podrían haber
sido atribuidas a la liberación rápida de la nisina y la liberación
lenta de la CHS, que produjo efectos antimicrobianos
combinados similares a los producidos BYN → C tratamiento.
Por lo tanto, como la duración de la incubación aumentó, CBC
con una alta concentración de CH liberado más CHS para
ayudar a la nisina en la inhibición de crecimiento celular.
La combinación de NBC (30 IU) + CBC (62,5 µg / ml) mostraron
actividad inhibitoria frente a S. aureus y la reducción de la dosis
de CHs en comparación con la adición directa de sustancias
antimicrobianas en microplacas. La combinación de NBC +
CBC exhibió la más alta actividad inhibidora (PI = 95,1%) frente
a E. coli (Tabla 3). Este resultado se puede atribuir a la
pequeña cantidad de nisina requiere asociar con CHs para
inhibir el crecimiento de E. coli. Por lo tanto, la NBC (30 UI) +
CBC (62,5 µg / ml) fue la combinación considerado la
combinación antimicrobiana deseable simultáneamente inhibir
el crecimiento de S. aureus y E. coli. Duran y otros (2016)
encontraron que los envases antimicrobianos basado en la
combinación de revestimiento de quitosano con antimicrobiana
agentes, tales como la nisina, mostraron mayor efecto
antimicrobiano contra la bacterias mesófilas y el aumento de la
vida útil de fresa fresca en comparación con la fruta sin revestir.
Sin embargo, según los resultados de espectros IR y análisis
térmico mostró que el complejo de quitosano / nisina formado
principalmente debido a la interacción electrostática entre los
grupos amino protonados en la cadena principal con quitosano
los iones carboxilato de nisina (Cai y otros 2010). en quitosano
película, aumentando el nivel combinación de nisina a mayor
concentración no reveló un aumento significativo inhibitoria.
Era generalmente causado por la capacidad máxima de
polímero de quitosano para llevar agentes activos junto a la
ocurrencia de interacción grupos funcionales fenómeno
(Pranoto y otros 2005).
Figura 5 El efecto del orden de tratamiento de los efectos de inhibición de la nisina y CH debajo del 50% del MIC. (N → C: nisina se añadió
a la h prueba de 6 antes de la adición de CH; N + C: nisina y CH eran añadido en la prueba de forma simultánea; C → N: CH se añadió a la
h prueba de 6 antes de la adición de nisina).

Figura 6-fotografías SEM (5000 veces) de (A) HBCB) NBC y (C) CBC.

Figura 7-El porcentaje de inhibición de S. aureus (BCRC 10780) (A)
por la nisina liberado de NBC, así como diversos niveles CH contenía
CBC cooperó simultáneamente con (B) NBC (30 UI) y la nisina (C) (6
IU). Control: contiene CBC solamente.
a-d
Letras diferentes en diferentes porcentajes de inhibición después de
24 h de incubación indicar la diferencia significativa (P <0,05).
Tabla 3-El porcentaje de inhibición de S. aureus (BCRC
10780) y E. coli (BCRC 10675) por CBC cooperó de forma
simultánea con NBC después de 24 horas de incubación.
CBC, HBC contiene 62.5μg / ml CH; NBC, HBC que contiene 30 UI de
nisina.
En este estudio, los resultados de las pruebas antimicrobianas
combinacionales mostró que la actividad de absorción y
liberación de HBC reducida sustractiva entre nisina y la CHS,
así como maximizado el combinado efecto antimicrobiano.
Conclusión
El orden de adición de diversas sustancias antimicrobianas
afecta el efecto inhibidor en un sistema antimicrobiano
combinado. El intervalo de adición deseable fue de 6 h para la
nisina y CHs y obstáculo y no se observaron efectos casi
sinérgicos cuando se utilizó la nisina antes CHs contra S.
aureus, así como cuando se utilizaron CHs antes la nisina
frente a E. coli. Además, la absorción y liberación controlada
actividad de películas biocelulosa reduce la interacción entre
nisina y la CHS, mejor será el efecto antimicrobiano combinado
por la reducción de la dosis de sustancias antimicrobianas, y
el aumento del número de cepas microbianas objetivo. HBC
fue demostrado tener aplicaciones potenciales como películas
de envasado antimicrobianos o insertos para productos
alimenticios procesados.
Reconocimiento
Los autores desean dar las gracias al Consejo Nacional de
Ciencia (NSC 101-2313-B-197-002-MY3) por el apoyo
financiero para este estudio.
Contribuciones de autor
H. L. Hsiao realizó los experimentos, L. C. Chen recogió datos
de prueba y redactó el manuscrito, S.B Lin proporciona
consultoría de la investigación y modificado el manuscrito y H.
H. Chen diseñó el estudio y la investigación integrada y
resultados.
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