4/2/2018 Actividades de promoción del crecimiento de plantas para endófitos bacterianos y fúngicos aislados de plantas medicinales de Teucrium polium L.

J Adv Res . 2017 de noviembre; 8 (6): 687-695. PMCID: PMC5607146

Publicado en línea 2017 Sep 11. doi: 10.1016 / j.jare.2017.09.001

Actividades de promoción del crecimiento de plantas para endófitos

bacterianos y fúngicos aislados de plantas medicinales de Teucrium
polium L.
Saad El-Din Hassan
Botany and Microbiology Department, Faculty of Science, AL-Azhar University, Nasr City, Cairo 11884, Egypt
Saad El-Din Hassan: saad.el-din.hassan@umontreal.ca :saad_hassan@azhar.edu.eg

Received 2017 Jun 17; Revised 2017 Aug 23; Accepted 2017 Sep 9.

Copyright © 2017 Production and hosting by Elsevier B.V. on behalf of Cairo University.

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Gráficamente abstracto Ir:

Palabras clave: actividad antimicrobiana, endofito, IAA, solubilización de fosfato, bacterias promotoras
del crecimiento de las plantas, Teucrium polium L., Zea mays L.

Abstracto Ir:

Los endófitos bacterianos y fúngicos son habitantes diseminados dentro de los tejidos vegetales y se ha
demostrado que ayudan al crecimiento y la salud de las plantas. Sin embargo, se sabe poco sobre los
endófitos promotores del crecimiento de las plantas (PGPE) de las plantas medicinales. Por lo tanto, los
objetivos de este estudio fueron identificar endofitos bacterianos y fúngicos de Teucrium polium y
caracterizar las propiedades promotoras del crecimiento de las plantas (PGP) de estos endófitos. Siete
endófitos bacterianos fueron aislados e identificados como Bacillus cereus y Bacillus subtilis , donde cinco
hongos endofíticos fueron obtenidos y asignados a Penicillium chrysogenum y Penicillium crustosum..
Los endófitos aislados produjeron diferencialmente ácido indol-acético (AIA) y amoníaco, y además de
sus actividades enzimáticas y antimicrobianas, mostraron una capacidad variable para la solubilización de
fosfato. Con el fin de investigar el efecto de los endófitos en el crecimiento de las plantas, se seleccionaron
cuatro endófitos representativos y sus consorcios en relación con su capacidad potencial para promover el
crecimiento de las plantas. Los resultados indicaron que los endófitos microbianos aislados de plantas
medicinales que poseen un papel vital para mejorar el crecimiento de la planta y podrían ser utilizados
como inoculantes para establecer un sistema de producción sostenible de cultivos.

Introducción Ir:

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Los enfoques a largo plazo de los fertilizantes orgánicos e inorgánicos además de los plaguicidas se
requieren con urgencia para la mejora de la producción de cultivos [1] . En particular, estas aplicaciones
influyen negativamente en la calidad del suelo y contribuyen a la contaminación ambiental [2] . Con
respecto a minimizar los efectos perjudiciales de las técnicas convencionales de la agricultura, los métodos
innovadores basados en la inoculación microbiana están ganando recientemente un mayor interés. Las
plantas y los microorganismos forman una asociación simbiótica con los beneficios para ambos socios.
Más importante aún, la simbiosis planta-microbio influye en el crecimiento y la salud de las plantas, lo que
mejora de forma efectiva los rasgos agrícolas y mejora la calidad del suelo y el ciclo de nutrientes [3] , [4]
, [5].

Los endófitos promotores del crecimiento de las plantas (PGPE) habitan los tejidos de las plantas y la
estrecha vinculación de los endófitos dentro de los tejidos vegetales facilita el intercambio de nutrientes y
la actividad de las enzimas [6] , [7] . La distribución de hormonas promotoras del crecimiento producidas
por microorganismos endófitos hacia los tejidos vegetales promueve positivamente el crecimiento de las
plantas [8] . Los endófitos poseen una capacidad vital para movilizar fosfato insoluble y proporcionar
nitrógeno a sus plantas huéspedes [9] , [10]. Los endófitos microbianos colonizan los tejidos de las plantas
sin un comportamiento sintomático y, en consecuencia, compiten con otros patógenos microbianos en los
mismos nichos ecológicos. Por lo tanto, la asociación planta-endófito establecida mejora la salud de la
planta a través de diferentes mecanismos mostrados por endófitos y potencialmente contribuye a la
protección de la planta huésped contra la patogénesis microbiana [11]. PGPE produce diversos compuestos
bioactivos con varias actividades biológicas que pueden describirse directa o indirectamente como agentes
promotores del crecimiento de las plantas (PGP). Aproximadamente la mayoría de las plantas albergan
endófitos en el interior de sus tejidos; sin embargo, la información disponible sobre PGPE y sus
actividades biológicas no es equivalente a la alta distribución de endófitos. Una comprensión superior de
los endófitos nativos de las plantas puede ayudar a aclarar sus capacidades y potencial para mejorar el
crecimiento de las plantas y establecer un sistema sostenible para la producción de cultivos.

Teucrium polium L. es una planta silvestre perteneciente a la familia Lamiaceae y se encuentra

naturalmente en el Protectorado de Santa Catalina, que es una parte de la Península del Sinaí en Egipto.
Saint Katherine Protectorate se caracteriza por un clima extremadamente árido y se encuentra a una media
de 1500-2000 m sobre el nivel medio del mar [12] . Se ha informado que la planta de T. polium utilizada
en medicina tradicional es antimicrobiana y antiséptica; más recientemente, se han aislado varios
compuestos bioactivos como terpenoides y flavonoides de T. polium y se han investigado sus usos
farmacéuticos como antimicrobianos, antioxidantes y anticancerígenos [13] . Aunque la importancia
ecológica y biológica de T. poliumComo habitante de una planta medicinal en un área ambiental única, los
endófitos microbianos de esta planta han sido investigados. Un estudio previo se centró en el aislamiento
de hongos endófitos de T. polium que ocurre en Saint Katherine Protectorate [12] ; las actividades
antimicrobianas de detección de estos hongos endófitos solo se han examinado. Hasta ahora, ningún
estudio publicado ha sido inspeccionado con actividades promotoras del crecimiento de plantas de
endofitos microbianos correlacionados con esta planta medicinal en hábitats áridos naturales.
Descubrimiento de la presencia de bacterias y hongos endofíticos en T. poliumpodría ser
biotecnológicamente aplicable; por lo tanto, la hipótesis del presente estudio es que los endófitos
microbianos de esta planta medicinal son prometedores bio-inoculantes para el rasgo de promoción del
crecimiento de las plantas. El bosquejo de este estudio se concentra en el aislamiento, la identificación
molecular y la caracterización de supuestos endófitos bacterianos y fúngicos relacionados con plantas
medicinales de T. polium que ocurren de forma natural en las condiciones áridas del Protectorado de Santa
Catalina. Se evaluó la especificidad, la verificación de las propiedades promotoras del crecimiento de
plantas de estos aislamientos microbianos, como la producción enzimática, la actividad antimicrobiana, la
producción de IAA y amoníaco y la solubilización de P para evaluar su influencia en la producción de
biomasa de la planta de maíz como cultivo económico importante.

material y métodos Ir:

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Muestreo de plantas y aislamiento de endofitos microbianos

Planta medicinal de Teucrium poliumL. (familia Lamiaceae) se recogió de Wadi al-Zwatin (lat 28.539290 °
a 28.53919 ° N; largo 33.930784 ° a 33.92044 ° E), Saint Katherine Protectorate, Sinai Peninsula, Egipto.
Las hojas de la planta se lavaron con agua corriente y posteriormente con agua destilada estéril, luego se
esterilizaron en superficie con etanol al 70% durante 1 minuto, hipoclorito de sodio al 2,5% durante 5
minutos, etanol al 70% durante 30 segundos y finalmente se lavaron con agua destilada estéril. 3 veces. El
último agua de lavado se plaqueó en agar nutriente, agar Czapek Dox (CD) y medio de agar de dextrosa de
patata (PDA). Adicionalmente, se detectó cualquier ADN microbiano en el último agua de lavado
mediante la amplificación de genes de ARNr bacterianos o fragmentos ITS fúngicos. El éxito del método
de esterilización superficial se confirmó por la ausencia de amplificación de ADN microbiano y también
cuando no se detectó crecimiento microbiano en los medios culturales. Los endófitos bacterianos se
aislaron de las hojas de plantas esterilizadas[14] en Luria-Bertani (LB) y medios de agar nutritivo, donde
los hongos endófitos se aislaron en PDA y medios CD [6] . Se verificó la pureza del crecimiento
bacteriano y fúngico de los tejidos internos o los segmentos triturados, se transfirió a inclinados culturales
frescos y se almacenó a 4 ° C para su posterior estudio.

Identificación molecular de endófitos

La identificación molecular se llevó a cabo basándose en el gen 16S rRNA bacteriano y el espaciador
transcrito interno fúngico (ITS) ADNc se une a amplificación y análisis de secuencia. El ADN genómico
se extrajo de acuerdo con el método de Miller et al. [15] . Bacterial 16S rRNA genes fueron amplificados
utilizando el ADN genómico como plantilla y primers bacterianos universales de 27 f (5-
GAGTTTGATCACTGGCTCAG-3) y 1492 r (5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3) [16] . Las
repeticiones de rDNA fúngico de ITS fueron amplificadas por los cebadores de ITS1 f (5-
CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3) e ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) [17]. La mezcla de
PCR contenía: tampón de PCR 1x, MgCl2 0,5 mM, ADN polimerasa Taq 2,5 U (QIAGEN, Germantown,
MD 20874, EE. UU.), DNTP 0,25 mM, 0,5 μM de cada cebador y 1 μl de ADN genómico extraído. La
PCR se realizó en un Ciclador térmico de motor de ADN (PTC-200, BIO-RAD, EE. UU.) Con 94 ° C
durante 3 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 1 min,
seguido de una extensión final realizada a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se verificaron
para el tamaño esperado en gel de agarosa al 1% y se secuenciaron en el Genome Quebec Innovation
Centre Facility (Montreal, Canadá) con los dos cebadores. Las secuencias bacterianas recuperadas en este
estudio se han depositado en GenBank con los números de acceso de KY905357 a KY905363 , donde los
números de acceso de las secuencias de ITS fúngicas sonKY906184-KY906188 . Las secuencias se
compararon con la base de datos GenBank utilizando el programa NCBI BLAST. Se realizó una
alineación de secuencias múltiple utilizando el paquete de software ClustalX 1.8 ( http://wwwigbmc.u-
strasbg.fr/BioInfo/clustalx ) y se construyó un análisis filogenético mediante el método de unión de
vecinos utilizando el software MEGA (Versión 6.1), con confianza probada mediante el análisis bootstrap
(1000 repeticiones).

Cribado de las propiedades promotoras del crecimiento de las plantas de los endófitos
Los aislamientos endofíticos microbianos se rastrearon para la solubilización de fosfato por el
procedimiento de Jasim et al. [18] utilizando medio Pikovskaya y azul de bromofenol como indicador. La
capacidad de los aislados endofíticos para producir amoníaco se evaluó utilizando el reactivo de Nesseler
en medios peptona líquidos [19] . Donde, la intensidad del cambio de color indica la capacidad de los
endófitos para la producción de amoníaco.

Las enzimas extracelulares producidas por endófitos bacterianos se evaluaron con la conducción de los
sustratos probados en un medio de sal mineral (MS) y la inoculación de los medios con aislados
bacterianos. La producción de enzimas extracelulares por hongos endófitos se detectó al crecer en medio
de agar levadura-malta (YM) (YM: 10 g / l de glucosa, 5 g / l de peptona, 3 g / l de extracto de levadura, 3
g / l de extracto de malta, 1,5% de agar, pH 6,7) y colocando tapones fúngicos de 5 mm en los medios de
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agar YM suplementados con sustratos indicativos disueltos y específicos. Las actividades de amilasa,
celulosa, proteasa, pectinasa y xilanasa de los endófitos se evaluaron cultivando los aislados endofíticos en
medios suplementados con 1% de almidón soluble, celulosa o carboximetilcelulosa (CMC), gelatina,
pectina y xilano, respectivamente.[20] .

Para probar la actividad antimicrobiana de los endófitos, los aislados bacterianos se cultivaron en medio de
caldo nutriente durante 6 días a 35 ± 2 ° C en un agitador a 180 rpm. Donde, los aislados fúngicos se
cultivaron en medio líquido de extracto de malta durante 10 días a 28 ° C en un agitador a 180 rpm. El
caldo de fermentación crudo se mezcló completamente y se centrifugó a 4000 rpm durante 5 minutos. El
sobrenadante líquido se extrajo con un volumen igual de acetato de etilo tres veces. El extracto de
disolvente orgánico se evaporó luego y los extractos brutos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) y
se usaron para el ensayo de selección de antimicrobianos por método de difusión de pozos [21] . Los
organismos de prueba codificados utilizados para el ensayo antimicrobiano fueron; Bacterias
grampositivas: Staphylococcus aureus , ATCC 6538 y Bacillus subtilisATCC 6633; Bacterias Gram-
negativas: Escherichia coli , ATCC 8739; Pseudomonas aeruginosa , ATCC 9027 y Salmonella
typhimurium ATCC 14028; y cepa de levadura de Candida albicans , ATCC 10231. La actividad
antimicrobiana de los extractos crudos endofíticos se determinó mediante el método descrito anteriormente
[20] .

La capacidad de los endófitos para producir IAA se determinó con el reactivo de Salkowski y diferentes
concentraciones de triptófano (1, 2 y 5 mg mL -1 ) o sin triptófano de acuerdo con el método colorimétrico
descrito anteriormente [22] . Además, los mayores productores de IAA se seleccionaron y se sometieron a
otro ensayo para detectar la cantidad de IAA a intervalos de 2 días dentro de los 14 días en presencia de
una concentración de triptófano óptima de 5 mg mL -1 .

Efecto de la inoculación endofítica en el crecimiento del maíz

Dos aislados bacterianos de Tp.1B y Tp.6B, un consorcio bacteriano formaron una mezcla de Tp.1B-
Tp.6B, dos aislados fúngicos Tp.2F y Tp.5F, y un inóculo fungoso formó una mezcla de Tp.2F -Tp.5F
fueron seleccionados por sus mejores actividades de PGP con el fin de probar el efecto de la inoculación
endofítica en la longitud de la raíz y la producción de biomasa de la planta de maíz. Las semillas se
desinfectaron en superficie remojando en hipoclorito de sodio al 2,5% durante 5 min, etanol al 70%
durante 1 minuto, y luego se lavaron con agua destilada estéril durante 5 veces. Los cultivos puros
bacterianos de Tp.1B y Tp.6B se cultivaron en caldo nutriente a 35 ± 2 ° C en un agitador a 180 rpm. Los
cultivos bacterianos se diluyeron en agua destilada esterilizada para alcanzar una concentración final de 10
6-8
CFU mL -1 [14]. Los aislados fúngicos de Tp.2F y Tp.5F se inocularon en caldo de CD a 28 ° C en un
agitador a 180 rpm durante 7 días [20] . Las semillas pregerminadas y desinfectadas en la superficie se
incubaron con suspensiones bacterianas o fúngicas a temperatura ambiente durante 6 h, el caldo sin
inoculación microbiana se usó para tratar semillas de control. Las semillas control y tratadas se colocaron
en placas de Petri esterilizadas con papeles de filtro esterilizados en húmedo y se incubaron a temperatura
ambiente durante 5 días en oscuridad para medir la longitud de la raíz. Los tratamientos experimentales se
llevaron a cabo en 5 repeticiones, en las cuales 10 semillas por cada unidad replicada.

Se llevó a cabo un invernadero con experimento en maceta para evaluar el efecto de la inoculación
endofítica en el crecimiento del maíz. Se estableció un diseño completamente aleatorizado que incluía la
inoculación con endófitos de Tp.1B, Tp.6B, Tp.2F y Tp.5F más consorcios microbianos de Mix.1-6B
(aislados bacterianos de Tp.1B y Tp.6B) y Mix.2-5F (aislados fúngicos Tp.2F y Tp.5F). Las semillas
desinfectadas se germinaron en papeles de filtro esterilizados húmedos y se incubaron a temperatura
ambiente durante 5 días en la oscuridad. Se eligieron plántulas del mismo tamaño y se sumergieron en
suspensiones bacterianas o fúngicas a temperatura ambiente durante 2 h [14]., donde las plántulas de
control fueron tratadas con suspensiones libres de bacterias o fúngicas. Las plántulas de control y tratadas
se trasplantaron en macetas de plástico de 1 L llenas con 900 g de mezcla de tierra y arena esterilizada, 3
plántulas por maceta. Un suelo arcilloso (arena 76.8%, cieno 10.9% y arcilla 12.2%) con caracteres
1 1
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químicos de: pH = 6, CEC (mEq por 100 g) = 15, materia orgánica = 5.2%, 24 mg kg -1 P, 15.1 mg kg -1
K, 186,4 mg kg -1 Na, 27,3 mg kg -1 Ca y 134,4 mg kg -1 Cl se usaron. Este suelo se secó al aire, se
tamizó con un tamiz de 2 mm y se sometió a autoclave dos veces durante una hora a 121 ° C. Para una
inoculación más exitosa, las plántulas de una semana de edad se trataron con 10 ml de suspensiones
microbianas [23]. Las plántulas de control se cargaron mediante suspensiones libres de bacterias o
fúngicas. Las plantas se cultivaron en un invernadero con una temperatura de 25-30 ° C y se regaron con
agua corriente sin agregar fertilización. Después de 30 días se cosecharon las plantas, se separaron los
sistemas de brotes y raíces, y las raíces se lavaron cuidadosamente con agua del grifo para eliminar las
partículas de suelo unidas con raíces. Se midieron los brotes y el peso fresco de las raíces, y luego se
secaron en estufa durante 72 horas a 60 ° C y se pesaron para determinar los pesos secos.

análisis estadístico
Los datos se analizaron estadísticamente mediante SPSS v17, se utilizó la prueba de análisis de varianza
unidireccional (ANOVA) para la comparación de muestras múltiples, cuando se cumplieron la normalidad
y la homogeneidad de la varianza, seguido de la prueba de comparación múltiple de LSD a P <0,05.

Resultados Ir:

Identificación molecular de endófitos

Siete endófitos bacterianos se aislaron y se purificaron del sistema de brotes de la planta de T. polium . El
análisis filogenético basado en la secuenciación y alineamiento del gen 16S rRNA reveló que estos
endófitos se clasificaron en dos especies diferentes de Bacillus ( Fig. 1 a). La identificación molecular de
los fragmentos del gen 16S rRNA de estos aislados mostró que 3 aislados de Tp.1B-3B se identificaron
como Bacillus cereus cepa BVC62 ( JQ660645 ) con 99% de identidad y 4 aislados de Tp.4B-7B tenían
amplicones ribosómicos 16S similares a la cepa UPMB10 de Bacillus subtilis ( KP641618 ) con una
homología del 99% ( Tabla 1).) Además, se obtuvieron cinco hongos endofíticos y se agruparon
genotípicamente en dos especies diferentes de Penicillium ( Fig. 2 b). Los resultados de BLAST mostraron
que las secuencias ITS de 2 aislados Tp.1F-2F eran más parentes a Penicillium chrysogenum aislado
MS15 ( KT362139 ) con 99% de similitud genética, donde 3 aislados de Tp.3F-5F estaban afiliados a
Penicillium crustosum cepa 2T01Y01 ( KC193255 ) con un 98% de homología ( Tabla 1 ).

Figura 1
Análisis filogenético de: (a) 16S rRNA secuencias de los aislados
bacterianos, y (b) ITS regiones de hongos aislados, con las secuencias
de NCBI. Tp.1B-3B y Tp.3B-7B se refieren a secuencias de ARNr
16S recuperadas de endofitos bacterianos, donde Tp.1F-2F y ...

Figura 2
Producción cuantitativa de IAA por: (a) aislados bacterianos
endofíticos, y (b) aislados fúngicos endofíticos; con y sin triptófano.
Las barras con la misma letra para cada aislado endofítico no
difirieron significativamente a un nivel significativo de ( P ≤ 0.05);
...

tabla 1
La identificación molecular de aislados microbianos endofíticos de T.
polium .

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Selección de actividades de promoción de crecimiento de plantas de endófitos

Se evaluaron las actividades de PGP de endofitos bacterianos y fúngicos que podrían promover directa o
indirectamente el crecimiento y la salud de las plantas. Los resultados revelaron que todos los hongos
endófitos aislados producían amoníaco diferencialmente, mientras que 3 endofitos bacterianos de Tp.2B,
4B y 5B no podían producir amoníaco. El análisis de ANOVA mostró que los hongos endofíticos
mostraron una mayor capacidad para solubilizar el fosfato inorgánico que los registrados para las bacterias
endofíticas ( Tabla 2 ). El aislado fúngico de Tp.2F y Tp.5F mostró la mayor ( P = 0.01) capacidad para la
solubilización de fosfato en comparación con otros endófitos.

Tabla 2
Producción de amoniaco y solubilización de fosfatos de aislamientos
microbianos endofíticos.

Las actividades antimicrobianas de los endófitos demostraron que el endófito bacteriano de Tp.6B inhibió
el crecimiento de los seis microorganismos ensayados; de hecho, Tp.6B fue el único endófito que afectó
positivamente al crecimiento fúngico patógeno de Candida albicans ATCC 10231. El endofito fúngico de
Tp.5F presentó acciones inhibitorias contra 3 patógenos microbianos probados y se observó entre los
supresores más altos para Bacillus subtilis ATCC 6633 El endófito bacteriano de Tp.1B significativamente
( P = 0.04) exhibió un efecto antagonista contra el crecimiento de 4 patógenos probados, donde este
endofito fue registrado como el inhibidor más alto para Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ( Tabla 3 ).

Tabla 3
Actividades antimicrobianas de endofitos microbianos.

Fue notable que los endófitos bacterianos y fúngicos aislados produjeron varias enzimas extracelulares; sin
embargo, diferentes aislados endofíticos aparecieron actividades enzimáticas variables. Los aislados
fúngicos de Tp.5F y Tp.2F mostraron las actividades enzimáticas máximas en comparación con otros
endófitos ( Tabla 4 ). Entre los endófitos bacterianos, el aislado de Tp.1B se registró como el mayor
productor de amaylasa ( P ≤ 0.001) y enzimas de celulosa ( P = 0.04). La producción bacteriana máxima
de pectinasas y enzimas proteasas se encontró para los endófitos bacterianos de Tp.1B y Tp.6B ( Tabla 4 ).

Tabla 4
Actividades enzimáticas extracelulares de endófitos microbianos.

Los resultados indicaron que todos los endófitos probados produjeron IAA sin o con triptófano como
precursor; sin embargo, se observó que el rango de producción de IAA aumentó al aumentar la
concentración de triptófano en los medios. La concentración de triptófano de 5 mg mL -1 indujo la mayor
cantidad de AIA producida por endófitos bacterianos y fúngicos ( Fig. 2).) Los hongos endófitos
exhibieron una mayor biosíntesis de IAA que aquellos sintetizados por endófitos bacterianos. En todas las
concentraciones de triptófano o sin triptófano, los endófitos fúngicos de Tp.5F y Tp.2F fueron los
productores de IAA máximos, donde se encontró la mayor producción de IAA bacteriana para los aislados
de Tp.1B y Tp.6B. Estos cuatro endófitos representativos se investigaron adicionalmente por su capacidad
de biosíntesis de IAA en ciclos de tiempo de 2-14 días. El endofito fúngico de Tp.5F exhibió el rango IAA
más alto de 19.9-63.5 μg mL -1 ( P ≤ 0.001) mientras que el endofito bacteriano Tp.1B produjo el valor
máximo ( P = 0.03) (4.1-23.4 μg mL -1 ) de IAA ( Fig. 3 ).

Fig. 3

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Producción de IAA por los más potentes de: (a) aislados bacterianos (b
fúngicos; en presencia de 5 mg / ml de triptófano y en diferentes interv
En cada momento, el asterisco indica una diferencia significativa entre
endofítico ...

Efecto de los endófitos en el crecimiento de las plantas

Con el fin de investigar el efecto de la inoculación de endófitos en el crecimiento de las plantas, se
seleccionaron cuatro endófitos representativos de Tp.1B, Tp.6B, Tp.2F y Tp.5F más consorcios
microbianos de Mix.1-6B y Mix.2-5F. en base a sus propiedades potenciales de PGP ( Tabla 5 , Tabla 6 ).
El análisis de varianza indicó que la inoculación bacteriana fue significativamente (F 3,36 = 55.8; P ≤
0.001) aumento de la longitud de la raíz en comparación con el control (semillas no inoculadas); sin
embargo, la inoculación con aislado bacteriano individual o Mix.1-6B dio como resultado una longitud de
raíz similar. Además, las inoculaciones fúngicas causaron importantes (F 3,36 = 59; P ≤ 0.001) aumenta la
longitud de la raíz en contraste con los tratamientos no inoculados. En cuanto al efecto de los endófitos en
la producción de biomasa de maíz en un experimento de invernadero, los análisis de comparaciones
múltiples revelaron que el mayor contenido de fresco (F 3,20 = 315.8 y; P ≤ 0.001) y seco (F 3,20 =
848.03 y; P ≤ 0,001) se obtuvieron los pesos de la inoculación de Tp.5F ( Tabla 5 ). Además, la
asociación de la planta Mix.2-5F condujo a un aumento significativo (F 3,20 = 83.34 y; P ≤ 0.001) del
peso de la raíz fresca comparable con las plantas no inoculadas ( Tabla 6).) Sorprendentemente, las plantas
inoculadas con hongos endófitos produjeron biomasa vegetal más alta que las observadas en plantas
inoculadas con bacterias.

Tabla 5
Efecto de las inoculaciones bacterianas en las propiedades de
crecimiento de las plantas de maíz .

Tabla 6
Efecto de las inoculaciones fúngicas en las propiedades de
crecimiento de las plantas de maíz .

Discusión Ir:

La planta medicinal de T. polium se presentó abundantemente en un área extremadamente árida en el

Protectorado de Santa Catalina de Egipto [12] . Bahramikia y Yazdanparast [13] revisaron 100 trabajos
publicados sobre usos fitoquímicos, farmacológicos y toxicológicos de extractos y compuestos activos
aislados de T. polium durante 40 años desde 1970 hasta 2011. Antioxidantes, anticancerígenos,
antibacterianos, antimicóticos y otras actividades biológicas han sido informados sobre los compuestos
activos de T. polium , en particular los terpenoides y los flavonoides [13]. Esta planta podría tener
diferentes componentes fisiológicos y biológicos que le permitan prosperar en áreas áridas con esa valiosa
importancia, y tal vez parte de su adaptación versátil dependería menos de su capacidad para establecer
una relación viable con endófitos microbianos. Hasta donde sabemos, este es el primer informe sobre el
aislamiento de supuestos bacteriófilos y hongos endófitos asociados con esta planta medicinal y la
caracterización de estos endófitos como PGPE.

En el estudio actual, se aislaron siete endófitos bacterianos y cinco hongos de plantas medicinales de T.
polium . Dependiendo de los rasgos de PGP, se seleccionaron cuatro aislados microbianos representativos
y se determinó su papel potencial para PGP. La caracterización genotípica de aislados bacterianos basada

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en el análisis de las secuencias de ARNr 16S mostró que las cepas aisladas se clasificaron en el género
Bacillus. El predominio del género Bacillus como bacterias endofíticas se ha aislado del ginseng ( Panax
ginseng CA Meyer) [24] , Lonicera japonica [25] y soja ( Glycine max L.) [26] . Hanna et al., [27]informó
también la frecuencia del género Bacillus en varias plantas perennes y anuales encontradas en los desiertos
del norte del Sinaí, Egipto. El bacilo es uno de los más comúnmente encontrados como endófitos
bacterianos [28] , [29] . Nuestros resultados están en línea con los que informaron que las poblaciones de
Bacillus se han encontrado ampliamente en diversas plantas medicinales como Glycyrrhiza spp., Pinellia
ternate , Lycium chinense , Digitalis purpurae , Leonurus heterophyllus , Bletilla striata , Belamcanda
chinases , P. pedatisecta y Taxus yunnanensis. [30] ,[31] , [32] .

El análisis filogenético de las secuencias de ITS fúngicas mostró el estado taxonómico de los hongos
endófitos del género Penicillium . Selim et al. [12] obtuvieron 6 hongos endófitos, a saber, Aspergillus
niger , Alternaria alternante , Nigrospora sphaerica , Penicillium corylophilum , Penicillium
chrysogenoum y micelio blanco estéril aislado de T. polium . Nicoletti et al. [33] revisó el endofitismo
ubicuo del género Penicillium en varias plantas leñosas; además, se aislaron diferentes especies de
penicillium endofítico a partir de plantas de café [34]. Para comprender la relación específica entre las
plantas y los endófitos se requieren técnicas de cribado amplias basadas en métodos dependientes del
cultivo o independientes para determinar la asociación entre endófitos y plantas. En esta dirección, la
determinación de los endófitos asociados a plantas sería útil para las aplicaciones biotecnológicas de
endófitos como biocontrol o agentes promotores del crecimiento de plantas.

Los endófitos microbianos promueven directamente el crecimiento de las plantas a través de la producción
de hormonas vegetales, particularmente la IAA o la movilización de fósforo. La promoción indirecta del
crecimiento de las plantas causada por endófitos incluye actividades antimicrobianas y la producción de
amoníaco o la síntesis de enzimas degradantes que inhiben significativamente los microorganismos
patógenos.

"Además de la función de IAA en la regulación del crecimiento de las plantas, IAA microbiana integra la
interacción simbiótica entre las plantas y los microorganismos [8] . Los resultados revelaron que los
rangos de concentración de IAA más altos de 19.9-63.5 μg mL -1 y 4.1-23.4 μg mL -1 se registraron para
el endofito fúngico de Tp.5F y el endofito bacteriano Tp.1B, respectivamente; sugiriendo que la capacidad
de estos endófitos para estimular el desarrollo de la raíz y promover el crecimiento de las plantas. Se ha
observado que la regulación del crecimiento radicular es el principal carácter fenotípico mediado por IAA
[35] , [36] ; también, IAA producido por endófitos bacterianos afectó positivamente el desarrollo de la raíz
de las plantas de tomate [37]. IAA tiene un papel crucial en la formación de raíces de plantas y en la
estimulación de la división celular, incluso en condiciones ambientales adversas [36] , [38]. El análisis de
datos mostró que el aumento de la concentración de IAA se logró significativamente con un aumento de
los niveles de triptófano. Curiosamente, los endófitos aislados tenían capacidad de síntesis de IAA sin
suplementación de triptófano, lo que refleja las condiciones dentro de los tejidos vegetales, donde la
síntesis de IAA se produce con niveles de triptófano libres. De hecho, nuestros resultados suponían que los
endófitos microbianos obtenidos en este estudio, potencialmente regulan el crecimiento de las plantas
mediante la síntesis de IAA. Además, diferentes especies microbianas endofíticas lograron una capacidad
variable para producir niveles de IAA de una manera que afectaba de manera diferencial el crecimiento de
la planta. Previamente, se observó que el IAA producido por endófitos bacterianos estimula el crecimiento
de la planta y aumenta el área de la raíz y, posteriormente, mejora la absorción de nutrientes del suelo [39]
. Dawwam y col.[40] demostraron que los endofitos bacterianos producían diferentes cantidades de IAA
con un rango de 0.36 mg mL a 14.77 mg mL -1 y de 0.6 μg mL -1 a 10.73 μg mL -1 . Tres hongos
endofíticos de Penicillium chrysogenum , Alternaria alternativa e hifas estériles se aislaron de Asclepias
sinaica y producen rangos IAA de 100-160 μg mL -1 y exhibieron un aumento significativo en la longitud
de la raíz de las plantas de maíz [20] .

La solubilización microbiana de fosfato es una herramienta prometedora como aplicación de

biofertilizantes; los resultados mostraron que los endófitos microbianos de Tp.2F, Tp.5F, Tp.6B y Tp1B
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4/2/2018 Actividades de promoción del crecimiento de plantas para endófitos bacterianos y fúngicos aislados de plantas medicinales de Teucrium polium L.

mostraron los índices más altos para la solubilización de fosfato, que es el principal contribuyente para el
crecimiento de la planta. Karagöz et al. [41] reveló que la secreción de ácidos orgánicos es uno de los
principales mecanismos que permiten a las bacterias movilizar el fosfato insoluble. Otro mecanismo por el
cual las bacterias solubilizadoras de fósforo ayudan a las plantas a acceder al P es a través de la excreción
de protones o producción enzimática que solubiliza las formas insolubles de P o mineraliza el fósforo
orgánico y lo pone a disposición de las plantas [42] , [43]. La inoculación con endófitos aumentó la
solubilización de fosfato y mejoró significativamente el crecimiento de las plantas [44] . Por otro lado, la
producción microbiana de amoníaco proporciona potencialmente a las plantas su demanda de nitrógeno y
no solo considera un mecanismo para la estimulación del crecimiento de las plantas, sino que también
aumenta la defensa de las plantas contra la colonización de patógenos. El aporte frecuente de nitrógeno en
el suelo aumenta principalmente el costo de la producción de cultivos; por lo tanto, la producción de
amoníaco por endófitos es un rasgo deseable para la promoción del crecimiento de las plantas y la
fertilidad del suelo [45] .

Las actividades enzimáticas y antimicrobianas son mecanismos indirectos exhibidos por los endófitos para
la promoción del crecimiento de las plantas. Los resultados demostraron que todos los endófitos aislados
producían enzimas de celulosa, pectinasa, xilanasa y proteasa. Estas enzimas son responsables de las
acciones hidrolíticas que permiten a los endófitos penetrar el tejido de la planta y establecer una relación
simbiótica entre los endófitos y la planta huésped. Las actividades enzimáticas de los endófitos
proporcionan a sus plantas hospedadoras una protección contra microorganismos patógenos a través de la
hidrólisis de la pared celular de patógenos [46] . Aunque los endófitos obtienen sus nutrientes de la planta
mediante la secreción de enzimas, estas actividades enzimáticas extracelulares mejoran la nutrición de las
plantas e implican la senescencia de las plantas por la degradación de las proteínas y los polisacáridos
[47].. En otro punto de vista con respecto a la biotecnología, las enzimas amilolíticas y proteolíticas de los
endófitos se están investigando para mejorar los procesos industriales de polisacáridos y la biodegradación
de proteínas [48] .

Supresión de crecimiento microbiano por filtrado crudo de endófitos se determinó con el fin de investigar
la actividad antimicrobiana de endófitos [49]. Los resultados mostraron que todos los endófitos aislados
mostraron una zona de inhibición significativa contra al menos uno de los patógenos microbianos
probados. Por lo tanto, los endófitos con caracteres PGP se integraron con acciones antimicrobianas
potencialmente útiles para la producción de cultivos. Nuestros resultados sugieren la capacidad de estos
endófitos como agentes de control biológico para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos.
Para la aplicación biotecnológica de endófitos como biocontrol, la selección de inoculantes microbianos
con respecto a su capacidad directa para promover el crecimiento de las plantas es crucial. Sin embargo,
son necesarios otros mecanismos que permitan a los inoculantes microbianos establecer un mutualismo
con plantas sin síntomas perjudiciales graves [50] .

Las endofitas se localizan dentro de los tejidos de las plantas, ese vínculo cercano facilita el mutualismo
entre los endófitos y la planta. Dado que los endófitos actúan como productores de varios compuestos
bioactivos a través de diversos mecanismos, ofrecen varios beneficios que afectan significativamente el
crecimiento de las plantas. Ventajosamente, al ser endófitos, colonizan tejidos vegetales con apariencia
asintomática; compiten con patógenos en el mismo hábitat e influyen positivamente en la salud de las
plantas. En un experimento de invernadero, las plantas inoculadas con endófitos mostraron mejores pesos
secos de brotes y raíces en comparación con las plantas no inoculadas. Además, los aislamientos
representativos aumentaron significativamente la longitud de la raíz de la planta que la encontrada para
plantas sin inocular. Endófitos aislados de la planta y su inoculación mejorada el crecimiento de otras
plantas se encontró previamente, donde se aislaron endofitos bacterianos deLonicera japonica mejoró el
crecimiento de las plantas de trigo, respectivamente [25] . El uso de un consorcio microbiano con
diferentes aislados endofíticos que tienen varios caracteres de PGP probablemente pueda integrarse y
mejorar el crecimiento y la salud de las plantas mediante diversos mecanismos de empleo en diferentes
períodos del ciclo de vida de la planta [45] . Obviamente, supuestos endófitos aislados en este estudio
exhibieron múltiples rutas para mejorar el crecimiento de las plantas; además, un mejor rendimiento de las
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4/2/2018 Actividades de promoción del crecimiento de plantas para endófitos bacterianos y fúngicos aislados de plantas medicinales de Teucrium polium L.

plantas inoculadas cultivadas en el suelo sugiere la probable competencia de endófitos aislados con
microorganismos del suelo. Sin embargo, ni esta competencia ni las capacidades endofíticas de aislados
representativos en las plantas evaluadas han sido aún probadas en nuestro estudio.

Conclusiones Ir:

El presente estudio reveló que la planta medicinal de T. polium , que es un habitante natural de las
condiciones áridas, es un nicho ecológico para diversos supuestos endófitos bacterianos y fúngicos. Estos
endófitos mostraron varios mecanismos directos e indirectos para promover el crecimiento de las plantas
sin lesión sintomática; por lo tanto, la inoculación de plantas de maíz con aislados endófitos
representativos estimuló el crecimiento de la planta y aumentó la producción de biomasa en comparación
con las plantas no inoculadas. Este estudio sugiere que la posible aplicación de estos endófitos en los
caracteres agrícolas podría mejorar la producción y la salud de las plantas y, de otro modo, mejorar la
calidad del suelo y la fertilidad. Sin embargo, se requieren más aislamiento de endófitos y experimentos de
campo repetitivos para respaldar el hallazgo actual.

Conflicto de intereses Ir:

El autor no ha declarado ningún conflicto de intereses .

Cumplimiento de los requisitos éticos Ir:

Este artículo no contiene ningún estudio con sujetos humanos o animales.

Expresiones de gratitud Ir:

Este trabajo se realizó en: Laboratorios de Biotecnología Microbiana y Jardín Botánico en el

Departamento de Botánica y Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Universidad AL-Azhar. El
autor desea agradecer al Prof. Dr. Azab M. (Facultad de Ciencias, AL-Azhar University) por su discusión
y comentarios que mejoraron en gran medida el manuscrito.

Notas a pie de página Ir:

Revisión por pares bajo la responsabilidad de la Universidad de El Cairo.

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Artículos de Journal of Advanced Research se proporcionan aquí cortesía de Elsevier

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