EXTRACCIÓN DE ADN VEGETAL – PROTOCOLO CON CTAB

1. Agregue 2-mercaptoetanol a la cantidad de solución de extracción de CTAB (Buffer

lisis) para lograr una concentración final del 2 % (v/v). Caliente la solución y la
solución de CTAB / NaCl a 65 oC.
NOTA: Se requieren aprox. 4 mL de buffer lisis y entre 0,4 – 0,5 mL de la
solución de CTAB / NaCl por cada gramo de tejido de hojas frescas. Use 250 mg
de tejido vegetal con 500 μL de buffer lisis.

2. Pulverizar u homogenizar el tejido vegetal con nitrógeno líquido (-196 oC) o hielo
seco (-78 oC).
NOTA: Se pueden secar también las hojas en sílica gel o en horno para intentar
la pulverización con este tipo de material vegetal. Use material vegetal joven y
evite los tallos largos y las venas para lograr una alta producción de ADN con
una mínima contaminación de polisacáridos.

3. Agregue al tejido pulverizado el buffer de extracción previamente calentado a 65 oC

y se mezcla bien hasta humedecer todo el tejido vegetal. Incube entre 10 y 60 minutos
a 65 oC y mezcle o agite fuertemente cada 10 o 15 minutos.
NOTA: Una incubación de 60 minutos genera grandes cantidades de ADN, si no
se requiere una gran cantidad, es suficiente con 10 minutos. Si los tejidos
tienen grandes cantidades de compuestos fenólicos es posible añadir PVP al 1
% (v/v).

4. Añada al homogenizado un volumen igual de cloroformo : octanol o cloroformo :

alcohol isoamílico (24:1). Mezcle bien por inversión. Centrifugue por 5 minutos a
7500 X g (8000 rpm en un rotor JA-20, es decir a 10.000 rpm en una microcentrífuga
para muestras pequeñas) a 4 oC. Recupere sólo la fase acuosa.

5. Agregue 1/10 del volumen de la solución CTAB /NaCl a 65 oC y mezcle por

inversión.

6. Agregue de nuevo un volumen igual de cloroformo : alcohol isoamílico (24:1).

Mezcle con inversión. Centrifugue por 5 minutos a 7500 X g (8000 rpm en un rotor JA-
20, es decir a 10.000 rpm en una microcentrífuga para muestras pequeñas) a 4 oC.
Recupere sólo la fase acuosa.

7. Añada un volumen de la solución de precipitación de CTAB. Mezcle por inversión. SI

el precipitado es visible siga con el paso 8. Si no es así, incube la mezcla por 30
minutos a 65 oC.

8. Centrifugue por 5 minutos a 500 X g (2000 rpm en un rotor JA-20 o a 2700 rpm en
microcentrífuga) a 4 oC.

9. Remueva pero no descarte el sobrenadante y resuspenda el pellet en buffer TE con

alto contenido de sal (0,5 a 1 mL/g del material de inicio). Si el pellet es difícil de
resuspender, incube 30 minutos a 65 oC. Repetir hasta cuando todos o la mayoría de
los pellets estén disueltos.
NOTA: La contaminación con polisacáridos puede hacer difícil la resuspensión
del pellet. Haga lectura de A260 del sobrenandante y descarte el pellet si hay
ácidos nucleicos en el sobrenadante.

10. Precipite los ácidos nucleicos añadiendo 0,6 volúmenes de isopropanol. Mezcle
bien y centrifugue por 15 minutos a 7500 X g a 4 oC.
NOTA: El etanol puede ser usado para la precipitación, pero el isopropanol
puede producir pellets más claros.

11. Lave el pellet con etanol al 80%, seque y resuspenda en TE.

NOTA: El CTAB residual es soluble y es removido por el lavado con etanol al 80
%. Adicionalmente se puede purificar el ADN con Ribonucleasa (RNasa A) y
proteinasa K.

Buffer lisis CTAB:

CTAB al 2% (p/v)
Tris-HCl 100 mM, pH 8.0
EDTA 20 mM, pH 8.0
NaCl 1,4 M

Solución CTAB/NaCl: (10% CTAB en 0,7M de NaCl).

Disuelva 4,1 g de NaCl en 80 mL de agua y lentamente agregue 10 g de CTAB mientras
calienta y agita. Si es necesario caliente a 65 oC para disolver. Ajuste a un volumen
final de 100 mL.

Solución de precipitación de CTAB:

CTAB al 1 % (p/v)
Tris-HCl 50 mM pH 8.0
EDTA 10 mM pH 8.0

Buffer TE Alto en Sal:

Tris-HCl 10 mM pH 8.0
EDTA 0,1 mM pH 8.0
NaCl 1M