INTRODUCCIÓN

Los métodos catalítico cinéticos representan una de las alternativas más atractivas

para la determinación espectrofotométrica de nitritos a niveles traza y ultratraza. En

los últimos años han aparecido en la literatura una serie de métodos

espectrofotométricos para la determinación de nitritos en aguas, que se basan en el

efecto catalítico cinético de este ión en la oxidación de diversas moléculas

orgánicas, por parte del ión bromato en medio ácido. Estos procedimientos son

simples y requieren de una instrumentación sencilla y accesible a muchos

laboratorios. El principal objetivo del presente trabajo es hacer una revisión y una

evaluación crítica de los diversos desarrollos metodológicos propuestos, y algunas

alternativas metodológicas que no han sido aún exploradas.

 FOSFATASA ALCALINA METODO CINÉTICO OPTIMIZADO.

La fosfatasa alcalina se encuentra ampliamente distribuida en los del cuerpo

humano. Su fuente de importancia clínica incluye hígado, hueso, placenta,
intestino, bazo y riñón. Aunque se desconoce su función biológica precisa,
aparentemente participa en el transporte de membrana, ya que está unida a la
membrana celular. En el hígado, la actividad de la ALP se localiza en la
membrana celular que une el borde sinoidal de las células del parénquima a los
canalículos biliares. En los huesos la actividad de la ALP se localiza en la
membrana celular que une el borde sinoidal de las células del parénquima a los
canalículos. En los huesos, su actividad se confina a los osteoblastos.
El aumento de actividad de fosfatasa alcalina en suero se observa en diversas
afecciones; sin embargo, su significado clínico se relaciona principalmente con la
detección de enfermedades óseas y hepáticas. La actividad de la ALP es útil para
el diagnóstico diferencial de enfermedades hepáticas. La fosfatasa alcalina suele
elevarse más en caso de afecciones de los conductos biliares, que en las que se
produce principalmente la lesión hepatocelular. Por lo tanto en la enfermedad
hepática coléstática u obstrucción hepatobiliar, la ALP suele incrementarse hasta
10 o 15 veces más que los valores normales, pero en general sólo se observan
leves elevaciones de 2 a 3 veces los valores normales en afecciones
hepatocelulares como hepatitis. Además, la síntesis de esta enzima se estimula
por la colestasis.
Otras afecciones hepáticas que también incrementan la actividad de la fosfatasa
alcalina son: la mononucleosis infecciosa, la colangiolitis, la cirrosis total,
carcinoma hepatocelular primario y carcinoma hepático metastático secundario,
también incrementan la actividad de la fosfatasa alcalina.
La ALP también se sintetiza en las células osteoblásticas, en donde se produce la
formación de hueso. Por tanto, en afecciones óseas con incremento de actividad
osteoblástica, en general los niveles de fosfatasa alcalina se elevan.
1. OBJETIVOS
 Demostrar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la
enzima fosfatasa alcalina ALP en una muestra biológica.
 Establecer los valores normales de referencia de la actividades de esta
enzima y comparar con el valor de nuestra muestra problema a analizar.
BIOQUIMICA- LABORATORIO METODOS CINÉTICOS

 Definir cuales son las principales patologías que se presentan si tenemos

valores altos o bajos de estas enzimas en una muestra biológica.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO
Se mide la actividad de la fosfatasa alcalina con un método cinético que utiliza un
tampón de 2-amino-2-metil-1-propanol (AMP). En la reacción, la fosfatasa alcalina
cataliza la hidrólisis del sustrato incoloro éster de fosfato orgánico, el p-
nitrofenilfosfato, a un producto de color amarillo (p-nitrofenol y fosfato). Esta
reacción ocurre a un pH alcalino de 10.3.

ESQUEMA DE LA REACCIÓN QUÍMICA

ALP
p-Nitrofenilfosfato + H2O p-Nitrofenol + Fosfato
++
pH 10,3, Mg
(incoloro) (amarillo)

GAMMA GLUTAMIL TRANSFERASA – GT MÉTODO CINÉTICO. SUSTRATO

CARBOXILADO.

La GGT (o -GT) es una enzima localizada en la membrana que juega un papel

importante en el metabolismo del glutatión y en la reabsorción de los aminoácidos
del filtrado glomerular y de la luz intestinal. El glutatión ( -glutamilcisteinilglicina)
en presencia de la GGT y un aminoácido o péptido transfiere el glutamato al
aminoácido formando un enlace péptido en el ácido - carboxílico, formando, por
consiguiente, cisteinilglicina y el péptido -glutamil correspondiente.
Aunque la mayor actividad de la GGT se presenta en el tejido renal, la elevación
de la GGT generalmente es un indicador de la enfermedad hepática. La GGT
sérica se eleva antes que las otras enzimas hepáticas en enfermedades como la
colecistitis aguda, la pancreatitis aguda, la necrosis hepática aguda y subaguda, y
neoplasias de sitios múltiples que cursan con metástasis hepáticas. Puesto que la
GGT es una enzima microsomal hepática, la ingestión crónica de alcohol o drogas
como los barbitúricos, los antidepresivos tricíclicos y los anticonvulsivantes
inducen la producción de enzimas microsomales. Estas elevaciones inducidas por
drogas preceden cualquier otro cambio en las enzimas del hígado y si se
suspende la ingestión de la droga en ese momento, los cambios del hígado son
generalmente reversibles. La GGT permite la diferenciación de otras
enfermedades hepáticas en las cuales por sus condiciones se eleva la fosfatasa
alcalina sérica, puesto que los niveles de GGT son normales en la enfermedad
de Paget, el raquitismo y la osteomalacia y en los niños y mujeres embarazadas
sin enfermedad hepática. Asimismo, puesto que la próstata tiene una actividad
significativa de GGT, la actividad sérica es mayor en hombres sanos que en
mujeres. La mayor utilidad de la GGT està en el diagnóstico de colestasis
causadas por la ingestión crónica de alcohol o drogas, colestasis mecánicas o
virales, metástasis hepáticas, desórdenes óseos con elevaciones de la fosfatasa
alcalina, pero en los que la GGT es normal y desórdenes de músculo esquelético
en los cuales la transaminasa ASAT está elevada pero la GGT está normal.
OBJETIVOS
 Demostrar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la
gama glutamiltrasferasa en una muestra biológica.
 Establecer los valores de referencia de la enzima GGT y comparar con el
valor de nuestra muestra problema a analizar.
 Definir cuales son las principales patologías que se presentan si tenemos
valores altos o bajos de GGT en una muestra biológica.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Se mide la actividad de la γ-glutamil transferasa mediante un método cinético
enzimático. En la reacción, la γ-glutamil transferasa cataliza la transferencia de un
grupo gamma-glutamil desde el sustrato incoloro gamma-glutamil-p-nitroanilina, al
aceptor, glicilglicina, y genera un producto coloreado, la p-nitroanilina.

ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

-glutamil-p-nitroanilina + glicilglicina GGT -glutamil-glicilglicina + p-nitroanilina

ASPARTATO AMINOTRANSFERASA GOT (AST) MÉTODO CINÉTICO U.V.

Aspartato aminotransferasa y alanino aminotransferasa

Las transaminasas ASAT y ALAT catalizan la conversión de aspartato y alanina a
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oxaloacetato y piruvato respectivamente. En el hígado se encuentran los niveles

más altos de ALAT, mientras que la ASAT se encuentra presente en el corazón,
músculo esquelético e hígado en cantidades similares. La actividad en el suero de
tanto la ASAT como la ALAT aumenta rápidamente durante el comienzo de la
ictericia viral y permanece elevada por 1 a 2 semanas. En las hepatitis tóxicas
también se elevan la ALAT y la ASAT, pero la LDH se eleva mucho más como
resultado de la necrosis celular hepática. En los pacientes con hepatitis crónica
activa también se observan aumentos en la ASAT y ALAT.
La necrosis hepática aguda se acompaña por incrementos significativos en las
actividades tanto la ALAT y la ASAT. El aumento en la actividad de la ALAT es
generalmente mayor que el incremento en la actividad de la ASAT. En la cirrosis
del hígado las actividades de las transaminasas séricas generalmente no se
elevan por encima de 300 U/L, sin importar la causa de la enfermedad cirrótica.
Las elevaciones en las ALAT y ASAT séricas observadas en el síndrome de
Reye, son atribuibles directamente al daño hepático, y el incremento en la ALAT
es generalmente mayor que el incremento en la ASAT. También se incrementa la
actividad de las transaminasas en la actividad neoplásica.
En el diagnóstico de la enfermedad del hígado, la medición de los niveles séricos
de ASAT y ALAT es valiosa. Sin embargo, la mejor manera de usar estos análisis
es junto con otros análisis de enzimas como la LDH y la creatina cinasa, y con
otras mediciones de la función renal y hepática como la urea sanguínea, la
creatinina, el amoníaco y la bilirrubina. Esto es importante cuando se establece el
diagnóstico puesto que la ALAT y la ASAT están presentes en otros tejidos
además del hígado y la actividad sérica de estas enzimas puede reflejar una
enfermedad orgánica en tejidos distintos al hígado. Las actividades séricas de la
ALAT y la ASAT se elevan en el infarto del miocardio, infarto renal, distrofia
muscular progresiva y otro gran número de enfermedades que solamente afectan
al hígado de una manera secundaria, como la enfermedad de Gaucher, la
enfermedad de Niemann-Pick, la mononucleosis infecciosa, la leucemia
mielocítica, la
cetoacidosis diabética y el hipertiroidismo.

Objetivos:
  Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la
aspartato aminotransferasa en una muestra biológica.
 Establecer los valores de referencia de la enzima AST y comparar con el
valor de nuestra muestra problema a analizar.
 Definir cuales son las principales patologías que se presentan si tenemos
valores altos o bajos de AST en una muestra biológica.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Se mide la actividad de la aspartato aminotransferasa mediante un método
cinético enzimático. En la reacción, la aspartato aminotransferasa cataliza la
transaminación reversible de L-aspartato y α-cetoglutarato a oxaloacetato y L-
glutamato. Luego, el oxaloacetato se reduce a malato en presencia de malato
deshidrogenasa (MDH), con la oxidación concurrente de α dinucleótido de
nicotinamida adenina reducida (NADH) a dinucleótido de nicotinamida adenina
(NAD).

ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

AST
L-Aspartato + -cetoglutarato Oxaloacetato + L-glutamato
MDH
Oxaloacetato + NADH + H+ Malato + NAD+

ALANINA AMINOTRANSFERASA (GPT) ALT MÉTODO CINÉTICO U.V

Los valores de alanina aminotransferasa se utilizan en el diagnóstico y tratamiento
de ciertas enfermedades hepáticas (p. ej., hepatitis viral y cirrosis) y cardíacas.

OBJETIVOS
 Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la
alanina aminotransferasa en una muestra biológica
 Establecer los valores de referencia de la enzima ALT y comparar con el
valor de nuestra muestra problema a analizar.
 Definir cuáles son las principales patologías que se presentan si tenemos
BIOQUIMICA- LABORATORIO METODOS CINÉTICOS

valores altos o bajos de alt en una muestra biológica

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

Se mide la alanina aminotransferasa con un método cinético. En la reacción, la
alanina aminotransferasa cataliza la transaminación reversible de un grupo amino
de la L-alanina al α-cetoglutarato con formación de piruvato y L-glutamato. Luego,
el piruvato se reduce a lactato en presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) con
la oxidación concurrente de alfa-dinucleótido de nicotinamida adenina reducido
(NADH) a dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD).

ESQUEMA DE LA REACCION QUIMICA

ALT
L-alanina +a-cetoglutarato Piruvato + L-glutamato
LDH
Piruvato + NADH + H + Lactato + NAD+

La oxidación de NADH a NAD es directamente proporcional a la actividad de

GPT.

LACTATO DESHIDROGENASA LDH. MÉTODO CINÉTICO U.V

Cuando solamente está implicado un órgano específico, como el hígado, la

medición del la LDH total puede ser útil. La LDH se incrementa con las hepatitis
virales o tóxicas, en la obstrucción biliar extrahepática, en la necrosis aguda del
hígado y en la cirrosis del hígado. Sin embrago, en condiciones en las que
puedan estar implicadas varios órganos, la medición del LDH total es menos útil
que la medición de las isoenzimas de la LDH. Las isoenzimas LDH5 y LDH4 son
las responsables de la actividad primaria del hígado, mientras que las isoenzimas
LDH1 y LDH2 son las responsables por la actividad predominante de la LDH en el
corazón y el riñón. Puesto que los glóbulos rojos también contienen mucha LDH 1,
se debe evitar el análisis de muestras de suero bemolizadas. En las condiciones
hepáticas, la electroforesis de la LDH muestra que la elevación en la LDH total se
debe a la liberación de LDH4 y LDH5 al suero.
La mayor actividad de la LDH se presenta en el riñón y el corazón, y la menor en
el pulmón y el suero. La LDH se localiza en el citoplasma celular y es por tanto
liberada al suero cuando las células se dañan o necrosan.
Los valores de lactato deshidrogenasa se utilizan en el diagnóstico y tratamiento
de enfermedades hepáticas tales como la hepatitis viral aguda, la cirrosis y el
carcinoma hepático metastásico, también en enfermedades cardíacas como el
infarto del miocardio, y tumores de pulmón o de riñón.

OBJETIVOS
 Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación del lactato
deshidrogenasa en una muestra biológica.
 Establecer los valores de referencia de la enzima LDH y comparar con el
valor de nuestra muestra problema a analizar.
 Definir cuales son las principales patologías que se presentan si tenemos
valores altos o bajos de LDH en una muestra biológica.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

El reactivo LDH se utiliza para medir la actividad de la lactato deshidrogenasa con
un método cinético enzimático. En la reacción, la LDH cataliza la oxidación
reversible de L-lactato a piruvato con la reducción concurrente de dinucleótido de
nicotinamida adenina (NAD) a dinucleótido de nicotinamida adenina reducido
(NADH). La deshidrogenasa láctica está presente en muchos tejidos. La LDH
cataliza la interconversión de piruvato y lactato:

ESQUEMA DE REACCIÓN QUÍMICA

LD
L-Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H +

Sólo para uso en diagnóstico in vitro.

La oxidación de NADH a NAD+ acompañada por una disminución de absorbancia
a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de LDH.
BIOQUIMICA- LABORATORIO METODOS CINÉTICOS
 BIOQUÍMICA

DOCENTE: ROSA ATO

ALUMNO: EDWIN QUISPELAYA GAM ARRA

IV CICLO

LABORATORIO Nº 8 MESA Nº 1

TURNO: 11.00 – 12:30

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